Ergebnisse und Probleme bei der Erprobung verschiedener Probenahmesysteme und diagnostischer Tests für die BVD- Ohrstanzendiagnostik

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1 BVD-Workshop in Stendal am 17. Juni 2010 Ergebnisse und Probleme bei der Erprobung verschiedener Probenahmesysteme und diagnostischer Tests für die BVD- Ohrstanzendiagnostik Volker Herwig, Fachbereich Veterinärmedizin, Stendal

2 Ohrstanzenprojekt Daten und Fakten Systeme Fehlerquellen Fazit

3 Daten und Fakten 7 Teilnehmer 1500 Ohrstanzen ( Ohrstanzen/ Teilnehmer) 3 Ohrmarkensysteme Allflex, Caisley und Hauptner-Herberholz 2 PCR Kits nach 17c TierSG Andiatec, Labordiagnostik Leipzig

4 Übersicht: Zangen Verwendete Zangen: Caisley Hauptner Allflex 128 Einsendungen mit 1-42 Proben; Durchschnitt: 12 Proben

5 Übersicht: Gewebecontainer Gewebecontainer: Verwendete Zangen: Caisley Hauptner Allflex Visuelle Kontrolle beim Probeneingang: Hauptner: 8-mal nicht sichtbar (1,64%) Caisley: 6-mal nicht sichtbar (1,24%) Allflex: 2-mal nicht sichtbar (0,40%)

6 Fehler bei Einsendungen Kennzeichnungsprobleme: Angaben zum Tier Fehlerhafte Eingaben zur Tierzahl bzw. Kennzeichen Beschriftung Folgeseiten Material: Ohrstanze

7 Fehler bei Einsendungen Gewebecontainer: Caisley Hauptner Allflex Probleme: Caisley Hauptner Allflex fehlerhafte Beschriftung bzw. Strichcode zu eng Scannprobleme - Grund: Keine Serienproduktion nach QS- System Problem trat bei Nachlieferung nicht mehr auf Einsendung des Dorns Scann-Probleme durch fehlenden Container, Gewebe fällt heraus

8 Zeitfaktor 2 Gewebeextraktion: Caisley (96) Hauptner (24) Allflex (1) Hinweis: Das Lesen des Barcodes erfolgt bei Caisley und Allflex in einem gesonderten Schritt (nicht gezeigt). Fazit: Das Lesen des Barcodes und das Öffnen unterscheiden sich in Kapazität und Zeitaufwand erheblich.

9 Technische Probleme Technische Probleme : Caisley Hauptner Allflex Fazit: Technische Probleme auch bei geringen Probenzahlen möglich.

10 Verbesserungsbedarf Potentielle weitere Probleme : Caisley Hauptner Allflex Probleme: Caisley Hauptner Allflex mögliches Kontaminationsrisiko: Fälschungssicherheit Stanznadel bzw. Trocknungsmittel (Tausch des Gewebes)

11 BVD Nachweissysteme Stand ADIAVET BVD REALTIME AES Laboratoire FLI-B 392 BoVir-SL Bovines Virales Diarrhoe Virus TaqMan RT-PCR Kit Kurzform: BoVir-SL BVDV TaqMan RT-PCR Kit Testkit zum Nachweis von Antigen des Bovinen Virus Diarrhoe Virus (BVDV), Handelsformen: 1. HerdChek BVDV Ag/Leukozyten 2. HerdChek BVDV Ag/Serum Plus Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen das Virus der Bovinen Viralen Diarrhoe Kurzform: HerdChek BVDV Ab Test zum Nachweis von Antikörpern gegen das P80-Protein des Virus der Bovinen Virusdiarrhoe/Mucosal Disease (BVDV) in Serum und Milch Kurzform: BVD/MD P80 Antikörper ELISA Test zum Nachweis der Antigene NSP2-3 und E0 des Virus der Bovinen Virusdiarrhoe/Mucosal Disease (BVDV) in Serum, Vollblut, Plasma, Ohrstanzproben und Leukozytenfraktionen Kurzform: BVD/MD Antigen Mix VIROTYPE BVDV, Real-time RT-PCR Kit zum Nachweis des Bovinen Virusdiarrhoe-Virus Kurzform: VIROTYPE BVDV AnDiaTec FLI-B 410 IDEXX BGVV-B 230 IDEXX BGVV-B 233 Institut Pourquier BGVV-B 296 Institut Pourquier FLI-B 357 LD Leipzig FLI-B 451 PrioCHECK BVDV Ab Prionics Deutschland BGVV-B 317 PrioCHECK BVDV Ag Pl plus Prionics Deutschland FLI-B 464 PrioCHECK BVDV Ag Pl focus Prionics Deutschland FLI-B 465 cador BVDV RT-PCR Kit Kurzform: cador BVDV RT-PCR cador BVDV Type ½ RT-PCR Kit Kurzform: cador BVDV Type ½ RT-PCR SVANOVIR Bovine Virus Diarrhoea Virus, Handelsformen: 1. SVANOVIR BVDV-Ak 2. SVANOVIR BVDV-Ak Screening/Monophasisch QIAGEN FLI-B 467 QIAGEN FLI-B 468 Svanova FLI-B 427 SERELISA BVD/MD Antigen Synbiotics BGAF-B 166 SERELISA BVD/MD Antikörper Synbiotics BGAF-B 167

12 Verwendete BVD PCR-Nachweissysteme ADIAVET BVD REALTIME AES Lab. FLI-B 392 BoVir-SL Bovines Virales Diarrhoe Virus TaqMan RT-PCR Kit Kurzform: BoVir-SL BVDV TaqMan RT-PCR Kit VIROTYPE BVDV, Real-time RT-PCR Kit zum Nachweis des Bovinen Virusdiarrhoe-Virus Kurzform: VIROTYPE BVDV cador BVDV RT-PCR Kit Kurzform: cador BVDV RT-PCR cador BVDV Type ½ RT-PCR Kit Kurzform: cador BVDV Type ½ RT-PCR Beschränkung auf 2 PCR Systeme AnDiaTec FLI-B 410 LD Leipzig FLI-B 451 QIAGEN FLI-B 467 QIAGEN FLI-B 468 Vorteil: Vereinfachung des Untersuchungsaufwands Gründe für Wegfall: ADIAVET- frühere Untersuchungen (mittlerweile aber neue Version), QIAGEN- Testkitbeschreibung (Limitierung auf Geräte und Extraktionsmittel; mittlerweile behoben)

13 Probenbearbeitung Zugelassene Testkits (keine eigene Methode) Prinzip: Nukleinsäuregewinnung Bildung von 10er Poolen (Kosten) Befunderstellung Für den Versuch zusätzlich: Kontrolle der Einzelprobe (housekeeping-gen)

14 Ergebnisse: Negative Proben Alle Proben waren negativ (Auswahl BVDV unverdächtiger Bestände) aber Negative Ergebnisse (des Houskeeping Gen) für visuell als erfolgreich gestanzte Proben: Caisley: 8 % (36 von 443) Allflex: 4 % (21 von 432) Hauptner: 0,3 % (1 von 348) Versuch zum Einfluss von Lagerdauer und PCR-Reagenzien: Die aufgetretenen Probleme beim Housekeeping- Gen hängen vermutlich mit der Inhibition der Polymerase durch die Lysate zusammen (nur bei Polymease Quantitect, QIAGEN) Trübungen bei lysierten Gewebeproben

15 Negative Proben 2 Versuch zum Einfluss von Lagerdauer mit verschiedenen Kits: Durch eine RNA-Aufreinigung sind PI Tiere über die Zeit von 20 Tagen auf einem konstanten Niveau sowohl mit dem Cador Kit (Qiagen) als auch mit dem mod. FLI-Protokoll nachweisbar. Bei quick and dirty (nur Lyse) verschlechterte sich die Nachweisbarkeit von PI- Tieren! Inhibitionen der internen Kontrolle (IC) wurden nicht beobachtet. BVD Nachweise mit 17c RT-PCR Kits Aufarbeitung mit modif. FLI Methode ct- Wert Tag 1 Tag 3 Tag 7 Tag 20 Tage im Lysepuffer Andiatech (1:10) Qiagen (1:100) Qiagen (1:50) LDL (1:25) ct-wert Tag 1 Tag 3 Tag 7 Tag 20 Tage Andiatech (1:10) LDL (1:25) Qiagen (1:100) Qiagen (1:50)

16 Probleme mit der internen Kontrolle Prozentuale Probenanteil nicht wertbarer BVD- Ergebnisse infolge negativer IC Allflex Caisley Hauptner Andiatec 0,0% 13,1% 33,3% 21,3% LDL 44,6% 28,9% 0,0% 31,7% 41,4% 21,2% 19,9% 27,8% Bei 0%- geringe Probenzahlen Fazit: Es gab einen unerwartet hohen Anteil von Poolen, bei denen die interne Kontrolle negativ war. Das Ergebnis konnte nicht reproduziert werden. Gründe unbekannt?

17 Fazit und Ausblick: Erweiterte Testphase für hohe Probenzahlen notwendig ELISA Einsatz für Betriebe mit hoher Prävalenzerwartung prüfen PCR Einsatz für Betriebe mit jahrelangem BVDV unverdächtigem Status

18 Herzlichen Dank für Ihre Aufmerksamkeit und den Kollegen bei der Bearbeitung der Proben Frau Hasstedt Frau Rahn Frau Weimann Frau Liebau Frau Lemme

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