Möglichkeiten und Erfahrungen in der serologischen und virologischen Überwachung. W. Gaede, M. Beer, G. Wolf, S. Kenklies, B. Gehrmann, W.

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1 BVD-Untersuchungen bei Bullen nach EU-Spermarichtlinie 2003/43/EG: Möglichkeiten und Erfahrungen in der serologischen und virologischen Überwachung W. Gaede, M. Beer, G. Wolf, S. Kenklies, B. Gehrmann, W. Peter Gliederung Infektionsrisiko durch Bullensperma (Literaturübersicht) Vorschriften der EU-Richtlinie Herausforderungen für die Diagnostik Serologische Untersuchungen Virusnachweis kritische Wertung und Zusammenfassung 1

2 Sperma von PI-Bullen: Hohe BVDV-Konzentration im Sperma: ,5 TCID50/ml (Meyling und Jensen, 1988) 10 7 TCID50/ml (Paton et al., 1989) 10 7 TCID50/ml (Kirkland et al., 1991) TCID50/ml (Givens et al., 2003) Spermaqualität kann verschlechtert sein bei Insemination folgt (fast) immer transiente Infektion empfänglicher (sero-negativer) Rinder Konzeptionsrate kann verschlechtert sein Entstehung von PI-Kälbern(?), Inzidenz <10% BVDV-Ausscheidung nach experimenteller transienter Infektion von Bullen (1) Withmore et al., 1978 Infektionsversuch mit 9 Bullen oral, intranasal und i.m. mit je 10 4 TCID50 NADL BVDV in 4 von 98 Ejakulaten (entnommen vom Tag nach der Inokulation) Paton et al., 1991 Infektionsversuch mit 4 Bullen intranasal 4x10 4 TCID50 NADL danach 10 1,4 TCID50/ml BVDV im Sperma eines Bullen vom Tag Komisrud et al., 1996 Infektionsversuch i.v. mit cpe-virus bei 6 Bullen Beobachtungszeit 66 Tage BVDV (ncpe-typ!) bei 2 von 6 Bullen am 7. Tag nach Inokulation 2

3 BVDV-Ausscheidung nach experimenteller transienter Infektion von Bullen (2) Kirkland et al., 1991 Infektionsversuch mit 5 Bullen intranasal mit PI-Blut/serum nachfolgende Virämie max. vom Tag BVDV-Konzentration in Bullensperma : bei 3 von 5 transient infizierten Bullen: 5 bis 75 TCID50/ml (7-14 Tage p.i.) Givens et al., 2003 Infektionsversuch mit 3 Bullen, intranasale Inf. BVDV für max. 21 d anzüchtbar bei 2 von 3 Bullen BVDV für 7 Monate mit RT-nPCR nachweisbar bei 2 von 3 Bullen nach 7 Monaten Immunhistochemie in Biopsieproben: 2 von 3 Bullen positiv Anzüchtung aus diesen Biopsieproben: 1 von 3 Bullen positiv! BVDV-Ausscheidung nach natürlicher transienter Infektion von Bullen Voges et al., 1998 Ausscheidungsdauer bei natürlicher Infektion Cumulus BVDV über 11 Monate im Sperma nachweisbar bei einem nicht-virämischem Bullen (anschl. Schlachtung) 3

4 Folgen für die Rezipienten (1): Niskanen et al., 2002 Insemination von 3 Färsen mit Sperma von Cumulus Serokonversion und ausbleibende Trächtigkeit bei 1 Färse Kirkland et al., 1997 Insemination von insgesamt 73 Färsen mit Sperma eines natürlich inf. Bullen Serokonversion bei 3 von 60 sero-negativen Färsen (davon 2 mit lokaler Virusisolierung 42 d p. insem.) Givens et al., 2003 i.v. Sperma von 1 experimentell inf. Bullen: Serokonversion bei 1 von 3 Kälbern (Sperma 50 d p.i. entnommen, dabei Virusisolierung negativ und RT-nPCR positiv) Folgen für die Rezipienten (2): Wolf 2003 Tiervesuch mit natürlich infiziertem Bullen Beobachtung der Serokonversion und Trächtigkeit 4

5 Infektionsversuch in LMU München Bulle gemeinsam mit 5 Färsen Kontaktzeit: Brunst mit erfolgreichen Natursprüngen zwischen dem und serologische Ergebnisse: BVDV-1 SNT negativ am ( Tag p. insem.) Bulle 1:400 BVD-AK.-ELISA BARVAC negativ am Bulle 118% Weitere Risiken klinisch manifeste lokale Infektion mit Fertilitätsstörungen bislang einmal beschrieben systemische Infektion mit akutem oder chronischem Krankheitsverlauf bislang nicht beschrieben Entstehung von PI bislang nicht beschrieben, wenig wahrscheinlich 5

6 Bisheriges Fazit: Akut BVDV-infizierte Bullen können das Virus auch nach der virämischen Phase und trotz Serokonversion mit dem Sperma ausscheiden. Die erreichten Virustiter sowie die Dauer der Ausscheidung sind meistens nur gering. Als wesentliche Folgen wurden vereinzelte Fälle Antikörperbildung nach (asymptomatischer) systemischer Infektion beobachtet. Mögliche Probleme bei der Überwachung i.r. von Bekämpfungsprogrammen übertreffen die direkte Gefährdung der Tiergesundheit. Vorschriften der EU-Richtlinie 6

7 EU-Richtlinie Rindersperma - RL 88 /407/ EWG - zuletzt geändert durch - RL 2003 / 43 / EG - vom 26. Mai in nationales Recht zu überführen bis 1. Juli in Deutschland gültig ab 1. Januar Stufenprogramm für Bullen in zugelassenen Stationen: - Serologische Untersuchung - Ggf. virologische Spermauntersucung RL Rinderspema,, Anhang B, Kap.I: Aufnahme von Bullen in zugel.. Stationen Virol. und serol. Quarantäneuntersuchungen, dabei verlängert evtl. auftretende Serokonversion die Quarantänezeit serologisch positive Bullen dürfen in die Besamungsstationen, aber: Vor der ersten Verwendung von Samen von serologisch positiv gegen BVD/MD reagierenden Bullen muss eine Samenprobe jedes einzelnen Tieres durch Virusisolationstest oder Antigen-ELISA auf BVD/MD untersucht werden. Im Falle eines Positivbefundes muss der betreffende Bulle aus der Station entfernt und sein gesamter Samen unschädlich gemacht werden. 7

8 RL Rinderspema,, Anhang B, Kap.II: Obligatorische Routineuntersuchungen für Rinder in zugel.. Besamungsstationen 2 x jährlich serologische Untersuchung sero-negativer Bullen Reagiert ein Tier serologisch positiv, so ist jedes seit dem letzten Negativbefund diesem Tier entnommene Ejakulat entweder zu vernichten oder erneut mit Negativbefund auf etwa vorhandene Viren zu testen. Bulle muss bei Serokonversion quarantänisiert werden. Herausforderungen für die Diagnostik Serologische Untersuchungen 8

9 Vergleichbarkeit von Ergebnissen in Antikörper-ELISA s (ELISA-Durchführung nach Herstellerangaben) Boehringer Serologische BVD-Doppeluntersuchungen 2002/2003 positiv verdächtig negativ positiv Bommeli verdächtig negativ Seren (63%, grün)) mit übereinstimmenden Ergebnissen, aber: bei 26 Seren (6%, rot) völlig divergierende Aussagen klassischer VNT brachte oft nicht die nötige Klarheit Methodische Modifikationen von ELISA und VNT Vorbehandlung der Seren für ELISA und VNT: 30min 56 C inaktiveren ELISA: hier Idexx (ELISA-Durchführung nach Herstellerangaben) VNT: Zellstamm: Klu-R BVDV 1: NADL BVDV 2: München 2 anti-pesti-mak C16 als primärer Ak POD-Konjugat (DAKO) 9

10 Direkter Vergleich von ELISA und VNT ELISA 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 BVDV1-Antikörpertiter: Korrelation von log2 SNT und ELISA 0, log2-snt Keine divergierende Ergebnisse!!! 25 Seren Virusneutralisationstest von Bullen BVD 1 BVD 2 ELISA 8657/ , / , / , /4 neg. neg. neg. 8657/ , /6 neg. neg. neg. 8657/7 neg. neg. neg. 8657/8 neg. neg. neg. 8657/9 neg. neg. neg. 8657/ , / , /12 neg. neg. neg. 8657/13 neg. neg. neg. 8657/14 neg. neg. neg. 8657/15 neg. neg. neg. 8657/ (?) 2, /17 neg. neg. neg. 8657/18 neg. neg. neg. 8657/ (?) 0, / , /21 neg. neg. neg. 8657/22 neg. neg. neg. 8657/ , /24 neg. neg. neg. 8657/ ,04 Herausforderungen für die Diagnostik Virusnachweis 10

11 Methodenübersicht Virusisolierung: Spermaverdünnung 1:10 und 1:100 KLu-R IFT mit anti-pesti-mak C16 als primärer Ak PCR: Nukleinsäureextraktion mit : High Pure Viral Nucleic Acid Isolation Kit HPVNS (Roche) RNeasy Mini Kit (Qiagen) Modifikationen Primern und TaqMan-Sonde 1. Sensitivitätsvergleich: Virustitration in Medium RNA-Isolierung mit HPVNS Ergebnis: VI und PCR mit gleicher Sensitivität Antigen-ELISA wie erwartet mit deutlich geringerer Sensitivität Medium One Tube RT-PCR: One Step Real Time RT-PCR mit Pestivirus- Virustiter ELISA PCR, nach Einfrieren VI positiv 22,4 21,5 22,6 positiv 10-1 positiv 26,3 25,9 25,3 positiv 10-2 neg. 31,1 29,9 31,1 positiv 10-3 neg. 34,4 34,3 33,9 positiv 10-4 neg. 36,7 35,5 36,4 positiv 10-5 neg. 40,9 38,7 neg. positiv 10-6 neg. 38,3 38,7 39,0 positiv 10-7 neg. neg. neg. neg. neg. NK neg. neg. neg. neg. neg. 11

12 1. Sensitivitätsvergleich: Virustitration in Frischsperma sperma RNA-Isolierung mit HPVNS Ergebnis: PCR mit geringerer Sensitivität als VI unverdünntes Sperma zelltoxisch Antigen-ELISA mit geringerer Sensitivität Frischsperma VI / Zellkultur Virus- ELISA PCR, nach Einfrieren Spermaverdünnung titer unverd. 1:10 1: positiv 32,3 32,8 32,1 tox. positiv positiv 10-1 positiv 37,2 37,6 34,4 tox. positiv positiv 10-2 neg. 40,4 39,2 neg. tox. positiv positiv 10-3 neg. neg. neg. neg. tox. positiv positiv 10-4 neg. neg. neg. neg. tox. positiv positiv 10-5 neg. neg. neg. neg. tox. neg. neg neg. neg. neg. neg. tox. neg. neg neg. neg. neg. neg. tox. neg. neg. NK neg. neg. neg. neg. tox. neg. neg. 1. Sensitivitätsvergleich: Virustitration in Paillettensperma RNA-Isolierung mit HPVNS Ergebnis: PCR mit geringerer Sensitivität als VI aufbereitetes Sperma nicht zelltoxisch Antigen-ELISA mit geringerer Sensitivität Pailleten VI / Zellkultur Virus- ELISA PCR, nach Einfrieren Spermaverdünnung titer unverd. 1:10 1: positiv 36,1 36,5 33,2 positiv positiv positiv 10-1 neg. 39,8 39,3 34,1 positiv positiv positiv 10-2 neg. neg. neg. neg. positiv positiv positiv 10-3 neg. neg. neg. neg. positiv positiv positiv 10-4 neg. neg. 42,1 neg. positiv positiv positiv 10-5 neg. neg. neg. neg. positiv positiv neg neg. neg. neg. neg. positiv neg. neg neg. neg. neg. neg. fraglich neg. neg. NK neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. 12

13 2. Sensitivitätsvergleich: Virustitration in Medium Medium Ergebnis: VI und PCR mit gleicher Sensitivität Antigen-ELISA wie erwartet mit deutlich geringerer Sensitivität ELISA PCR Virusverdünnung * ** *** **** ,1 17,9 23,5 positiv positiv ,1 21,3 28,1 positiv positiv 10-2 neg. 23,6 24,4 31,8 positiv positiv 10-3 neg. 28,0 28,6 36,3 positiv positiv 10-4 neg. 31,3 32,8 40,1 positiv positiv 10-5 neg. 34,7 35,7 neg. neg. positiv 10-6 neg. neg. 40,2 neg. positiv positiv 10-7 neg. neg. 41,4 neg. positiv neg. NK neg. neg. neg. neg. positiv neg. VI * HPVNS, Quantitect ** HPVNS, Qiagen One Step RT-PCR Kit *** RNeasy, Qiagen One Step RT-PCR Kit **** HPVNS, nested PCR Ergebnis: 2. Sensitivitätsvergleich: Virustitration in Frischsperma sperma PCR mit höherer Sensitivität als VI Antigen-ELISA mit geringerer Sensitivität VI / Zellkultur ELISA PCR Spermaverdünnung 1:10 1:100 Virusverdünnung * ** *** **** ,7 27,7 26,5 positiv positiv positiv ,1 30,1 31,1 positiv positiv positiv ,8 32,8 31,1 positiv positiv positiv 10-3 neg. 36,6 36,1 26,4 positiv neg. neg neg. neg. 38,5 37,2 positiv neg. neg neg. neg. 43,5 38,8 neg. neg. neg neg. neg. neg. 40,9 neg. neg. neg neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. NK neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. * HPVNS, Quantitect ** HPVNS, Qiagen One Step RT-PCR Kit *** RNeasy, Qiagen One Step RT-PCR Kit **** HPVNS, nested PCR Nativsperma 13

14 2. Sensitivitätsvergleich: Virustitration in Paillettensperma Ergebnis: PCR mit gleicher Sensitivität wie VI Antigen-ELISA mit geringerer Sensitivität Pailleten VI / Zellkultur ELISA PCR Spermaverdünnung unverd. 1:10 1:100 Virusverdünnung * ** *** **** ,6 31,3 25,2 positiv positiv positiv positiv ,2 35,3 27,8 positiv positiv positiv positiv 10-2 neg. 35,7 38,6 32,1 positiv positiv positiv positiv 10-3 neg. neg. 41,4 35,5 neg. positiv positiv neg neg. 41,7 41,3 33,8 positiv positiv pos./neg. neg neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. NK neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. * HPVNS, Quantitect ** HPVNS, Qiagen One Step RT-PCR Kit *** RNeasy, Qiagen One Step RT-PCR Kit **** HPVNS, nested PCR Der Kontrast: Ergebnisse mit Sperma eines natürlich infizierten Bullen 14

15 BVDV - PCR in Frischsperma und Pailletten Real Time RT-PCR: Bulle mit positivem Ergebnis in 5 Ejakulaten (Pailletten) 20 weitere Bullen negativ Frischsperma und Blut: Frischsperma positiv im Blutprobe negativ 3 weitere Bullen negativ Sperma kulturell negativ Ursachen für Sensitivitäts- unterschiede in gespiktem und natürlich infiziertem Sperma: Verwendung von zellkultur-adaptierten BVDV-Laborstamm für Titrationsversuch Chargenunterschiede beim Extraktionskit? Freisetzung von RNasen durch das Einfrieren des Spermas vor der RNA-Isolierung im Titrationsansatz? Unterschiedliche Cytotoxizität und Gehalte an PCR- Inhibitoren in verschiedenen Spermachargen? 15

16 kritische Wertung und Zusammenfassung Bewertung serologischer Testverfahren: Generell ist Hitzeinaktivierung erforderlich! ELISAs: Seren mit homologen NT-Titern von 1:2 bis 1:20 werden i.d.r. von BVDV-Ak-ELISAs nicht detektiert indirekte ELISAs wenig sensitiv, Probleme mit BVD2 - Seren? NS3-blocking-ELISAs sind sensitiver und weniger abhängig vom BVDV- Typ, aber bislang kaum praktische Erfahrungen Viruneutralisationstest gegen BVDV 1 und 2 ( Goldstandard ) Immunperoxidase-Färbung sollte Standard sein evtl. Probleme mit EDTA-Plasma Empfehlung für die Überwachung von Bullenstationen: Quarantäneuntersuchung mit VNT ( BVDV 1 und 2 ) Immunperoxidase-Färbung sollte dabei Standard sein Jahresuntersuchungen mit ELISA, Abklärungen mit VNT 16

17 Spermauntersuchungen: Antigen-ELISAs, werden von Sperma-RL zwar genannt, sind aber weder geeignet noch zugelassen Virusisolierung/Zellkultur (Standardverfahren) zur Vermeidung von zelltoxischer Wirkung v.a. Frischsperma verdünnen PCR: von EU-Sperma-RL nicht genannt! aber im internationalen Handel teilweise wie Virusisolierung anerkannt Protokolle müssen weiter validiert werden, insbesondere im Hinblick auf Eliminierung von Inhibitoren Robustheit gegen Einfrieren (Pailletten) Empfehlung für die Überwachung von Bullenstationen: Zellkulturanzucht PCR bis zum Abschluss der Validierung als ergänzende Diagnostik Herzlichen Dank für die Aufmerksamkeit Herzlichen Dank für die Aufmerksamkeit 17