Strategien. ELISA als screening Methode (Einzelseren) Bestätigung der positiven Proben mit PCR oder zweitem Antigen-ELISA

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1 Weiterentwicklung diagnostischer Methoden zum Nachweis von BVD C. Egli, C. Schelp, C. Lozano, P. Vaith und L. Schalch Bommeli Diagnostics, Liebefeld-Bern, CH still a company of Einleitung PCR ELISA Sehr hohe Sensitivität (Pooluntersuchung) Probenaufbereitung aufwändig Probenqualität RNAsen Proteine stabiler Höhere Toleranz bezüglich Probenqualität Screening-Methode 1

2 Strategien PCR als screening-methode (Pools) Analyse der positiven Pools mittels Antigen-ELISA Bestätigung der positiven Proben mit zweitem Antigen-ELISA oder mit PCR ELISA als screening Methode (Einzelseren) Bestätigung der positiven Proben mit PCR oder zweitem Antigen-ELISA CHEKIT BVD-VIRUS III Detektion von E rns (gp 44/48) E rns wird sezerniert: in grossen Mengen vorhanden Monoklonale Anti-E rns -Antikörper 1-3, 1-1, 1-12, 1-13, 1-27, 17B6, 17/5, 5F4 Ziel: Erkennung einer möglichst grossen Anzahl von Stämmen / Isolaten 2

3 Neuer CHEKIT BVD-VIRUS III Vergleich mit alter Version CHEKIT BVD-VIRUS III alte Version neue Version Chromogen ABTS (2 ul) TMB (1 ul) Probenvolumen 15 ul 5 ul Probeninkubation 9 Min 37º oder über Nacht 4º 9 Min 37º oder über Nacht RT 1. Waschschritt 3 x waschen 5 x waschen Chromogeninkubation: nach Kurzinkubation 3 Min. 15 Min. nach über Nachtink. 2 Min. 1 Min. Bottom wash beim 1. Mal Vergleich der ABTS- und der TMB- Version (Referenz: PCR) CHEKIT-BVD-VIRUS-III TMB CHEKIT-BVD-VIRUS-III ABTS 1 positiv negativ >29.8 Sens: 98.7 Spec: positiv negativ >29.8 Sens: 1. Spec:

4 neuer BVD-Antigen ELISA: Vergleich mit der Virusisolierung 88 Proben mit bekanntem BVD-VI-Resultat Von 56 VI-negativen Proben wurden 55 negativ getestet: Spezifität 98.2% Alle VI-positiven Proben bestätigt: Sensitivität 1% 35 Anzahl Proben cut-off - + negative Proben positive Proben 5 < > 11 CHEKIT-BVD-VIRUS-III %-Klassen Vergleich mit einem 2. BVD-Antigen- ELISA (381 Proben) 25 cut-off Anzahl Proben CHEKIT BVD-Virus III 2. BVD-Antigen-ELISA < mehr %-Klassen 4

5 Vergleich mit einem 2. BVD-Antigen- ELISA (381 Proben), Referenz: PCR positive Proben n = 244 negative Proben n = CHEKIT-BVD-Virus-III BVD-Antigen-ELISA >3.2 Sens: 98.8 Spec: positiv negativ >29.8 Sens: 95.9 Spec: positiv negativ Untersuchung von Ohrstanzproben Neuer Ansatz zu Detektion von pi-tieren Sammeln von 12 gepaarten Proben (Ohrstück-Blutprobe) im Schlachthof Analyse der Proben mit CHEKIT-BVD-VIRUS III mit PCR als Referenzmethode 5

6 Untersuchung von Ohrstanzproben: TypiFix-System (TypiFix TM Probensammler) Entnahme von Gewebeproben bei Nutztieren: Ausstanzen der Gewebeprobe mit der Zange direkt in den Sammelbehälter Untersuchung von Ohrstanzproben 1) Aufsetzen des schwarzen Probeentnahmekegels 2) Einlegen des Probensammelbehälters 6

7 Untersuchung von Ohrstanzproben Probenentnahme: Positionierung der Zange Zudrücken der Zange Öffnung und Entfernung der Zange Der Stanzkegel versiegelt den Probenbehälter Untersuchung von Ohrstanzproben Öffnen des Probenbehälters mit Hilfe einer Zange 7

8 Untersuchung von Ohrstanzproben Entnahme der Gewebeprobe (Frischgewicht 1mg) mit einer Pinzette Probenbeschaffung Sammeln von 12 gepaarten Proben (Ohrstück-Blutprobe) im Schlachthof Entnahme der Blutprobe und eines Stücks Ohr vom gleichen Rind Aufbereitung der Blutproben im Labor (Serum) Behandlung der Ohrproben: sorgfältig waschen, Trocknung, dann einfrieren Entnahme der Stanzprobe vor dem Einfrieren gemäss Anleitung des Herstellers. 8

9 Vorbereitung der Ohrstanzproben Hautproben (> 5mg) werden in ein Reaktionsgefäss überführt.5 ml Lysispuffer werden hinzugefügt Nach Schütteln Inkubation unter leichtem Schwenken bei 37 C für 9 min Schütteln Verwendung von 5ul Lösung als Probe Weiter gemäss GA CHEKIT-BVD-VIRUS III Blut- und Ohrstanzproben im Vergleich gepaarte Proben 4 35 R 2 =.9792 OD% Ohrstanzprobe Grenze 3% OD% Serum 9

10 Untersuchung der drei positiven Proben mit Panpesti-PCR Nr Probe RT-PCR System Ct Beurteilung NK Wasser Panpesti I N/A negativ PK NADL 31. positiv Panpesti I 34.7 positiv 17 4 Panpesti I N/A negativ (5256) Panpesti I 36.9 positiv (729) Panpesti I N/A negativ (4854) Panpesti I 34. positiv Weiterentwicklung diagnostischer Methoden zum Nachweis von BVD Zusammenfassung CHEKIT-BVD-VIRUS III: gute Differenzierung positiver und negativer Populationen Detektion von E rns -Antigen Verbesserung der Spezifität Sensitivität unverändert hoch Korrelierende Resultate mit gepaarten Blut- Ohrstanzproben 1

11 Ausblick Weiterentwicklung der BVDV-PCR mit interner Kontrolle Validierung von CHEKIT-BVD-VIRUS III für Ohrstanzproben Ohrstanzproben von pi-tieren mit maternalen AK (diagnostische Lücke)? Entnahmestelle am Ohr? (Blutgefässe) Haltbarkeitsstudien mit TypiFix-Behälter 11