Laborerfahrungen mit Ohrstanzproben im Rahmen der BVD-Bekämpfung in Sachsen

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1 Laborerfahrungen mit Ohrstanzproben im Rahmen der BVD-Bekämpfung in Sachsen

2 BVDV-Ohrstanzen-Diagnostik in Sachsen Durchführung der Ohrstanzen-Diagnostik an einem Standort für ganz Sachsen zusammengefasst Untersuchung von ca Tieren im Jahr Seit 2001 wird die BVDV-Bekämpfung/ Überwachung mittels Blutuntersuchung in 50iger Pools durchgeführt Prävalenz bei ca. 0,25 % Ohrstanzen-Diagnostik wird in diesem Jahr hauptsächlich bei Problembetrieben und Mutterkuhhaltungen im Rahmen eines Freiwilligenprogramms durchgeführt; zunehmend ist die Zahl der Tiere aus Milchviehanlagen und Kleinbetrieben in Sachsen erfolgt Untersuchung auch von Totgeburten und verendeten Kälbern mittels Rundlingsohrstanzen Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

3 Eckpunkte der Ohrstanzen-Diagnostik Verwendung der Ohrstanzsysteme der Firma Caisley Ohrstanzen werden im 24iger Pool mittels zugelassener Real-time RT-PCR (Virotype BVDV, LDL, Leipzig) untersucht Poolgröße ist ein guter Kompromiss in Bezug auf Prävalenz Einsendung der Ohrstanzcontainer mit Einsendungsschein über Post oder Kurier Befundung der Ergebnisse erfolgt bisher über schriftliche Befunde an ATA, Tierarzt, Tierhalter und Rindergesundheitsdienst Eine elektronische Befundübermittlung an BALVI/ HIT in Vorbereitung Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

4 Durchführung der Untersuchung: Probenanlage Einsendung wird im LIMS unter Angabe des Tierhalters, Tierarztes und Anzahl der eingeschickten Stanzen angelegt Registrierung aller Ohrstanzen/ Rundlinge im LIMS durch Einscannen des 2D-Barcodes mittels Handscanner Scan-Arbeitsplatz Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

5 Durchführung der Untersuchung: Rackbelegung Die Ohrstanzcontainer werden auf ein barcodiertes 96er Rack gestellt (Caisley) Rackbelegung wird auf Formblatt mit Einsendungsnummer und laufender Nummer vermerkt Abflammen des Racks und Entstanzen mittels CapOpener 96 (Caisley) Belegte Racks werden über Caisley-Software PlateScan eingescannt und unter der Racknummer gespeichert PlateScan: Erstellen einer Textdatei über Rackbelegung Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

6 Durchführung der Untersuchung: Pufferzugabe und Lyse Den Ohrstanzcontainern werden zur schnellen Präparation von Ohrgewebeproben (keine RNA-Extraktion) Virotype TLR zugegeben Verwendung von Mehrkanalpipette und Gel-load-Pipettenspitzen Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

7 Durchführung der Untersuchung: Pufferzugabe und Lyse Abkleben der Racks mit Aluminiumfolie und Schnelllyse in Wärmeschränken Inkubation: C für mindestens 30 min C für mindestens 10 min Positivkontrolle Negativkontrolle abgeklebtes Rack Racks im Wärmeofen Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

8 Durchführung der Untersuchung: Herstellung Vorlageplatte Durchführung mittels Pipettierroboter CAS 4200 (Corbett Research) Vorlageplatte bekommt identischen Barcode wie Rack Platte bleibt abgeklebt, Roboter pipettiert durch Folie hindurch CAS 4200 Vorlageplatte Rack Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

9 Durchführung der Untersuchung: Herstellung Vorlageplatte Vorlageplatte essentiell ein direktes Pipettieren aus dem Rack in einen Pool funktioniert nicht, da es keine praktikable Möglichkeit zur Überprüfung gibt, ob alle Einzelproben korrekt pipettiert wurden (kein liquid-sensing möglich) bietet Sicherheit durch Sichtkontrolle ein eventuelles manuelles Nachpipettieren von Rack auf Vorlageplatte möglich Pools werden nur von Vorlageplatten gebildet Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

10 Durchführung der Untersuchung: LABOdiagnostics Software interne Ohrstanzen-Datenbank Die Software bietet die Möglichkeit, die beim Scannen erstellte Rackbelegung zu importierten; die Zuordnung Rack/ Probe über Datum/ Uhrzeit Verwechselungen, Doppelungen und Übersehen von Proben ist damit unmöglich variable Poolgrößen möglich, Poolplatten können fortgesetzt werden PCR-Ansätze werden generiert und auf CAS 1200 und CAS 4200 automatisch pipettiert Verknüpfung CAS 1200 mit CAS 4200 und Rotorgene 6000 sichere Datenbank, gut abgestimmt auf vorhandene Laborgeräte nachteilig ist modularer Aufbau und das sehr geschlossene System (Änderungen/ Anpassungen nicht möglich für den Anwender!) Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

11 Durchführung der Untersuchung: Rackimport Die Textdateien aus PlateScan werden in die Datenbank übernommen Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

12 Durchführung der Untersuchung: Pooling Herstellung der Pools aus 24 Einzelproben CAS 4200 pipettiert aus Vorlageplatten auf barcodierte Poolplatte mit Hilfe der LABO- Software; bis zu 10 Vorlageplatten können verarbeitet werden Vorlageplatten Poolplatte Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

13 Durchführung der Untersuchung: Real-time RT-PCR Poolplatte CAS 1200 Rotorgene 6000 Verifizieren Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

14 Durchführung der Untersuchung: Real-time RT-PCR Pool Negativ Pool Positiv LIMS Probe Negativ xml-datei Probe Positiv Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

15 Anmerkungen zum Verfahren Validierung des Systems mit definiertem Probenmaterial (Ohren von PI-Tieren) - positive Stanzen alternierend mit negativen Stanzen (Kontamination) - Paralleltestung von Ohrstanzen AG-ELISA/ RT-PCR - Testung der PCR mit Blutproben/ Ohrstanzen - Lagerungsversuche - die RT-PCR wird überprüft mittels Prozesskontrollen Untersuchungszahlen von März 2010 bis 11.Juni.2010 Gesamtanzahl der Untersuchungen: 8014 gesamt % Positiv 14 0,17 Negativ ,63 Zerbrochen/leer 416 5, Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

16 Problemfeld: Versandt/ Probeneingang defekte Briefumschläge: Ohrstanzen gehen verloren fehlender Untersuchungsauftrag ungenügender Informationsgehalt von Einsendungsscheinen unkorrekte Angaben über Anzahl der Proben Rundlinge hoher Arbeitsaufwand Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

17 Problemfeld: Probenqualität zerbrochen (ca. 98%) / leer (ca.2%): April: 5,90 % Mai: 5,09 % Juni: 4,85 % Qualität der Probe sehr schlecht einschätzbar, trotz semitransparenter Container semitransparente Container bestehen aus weicherem Material: höherer Anteil defekter Container Trocknungsmittel (weniger ist mehr!!!) Lagerung im Vorfeld der Untersuchung Container = black box Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

18 Ausblick Die Akzeptanz der Ohrstanzdiagnostik steigt bisher gute Kommunikation zwischen Tierhaltern, Tierärzten, Ämtern, TGD und Labor mit einem Anstieg falsch negativer Proben/ Tiere wird zu rechnen sein ct- Werte nicht geeignet für Unterscheidung zwischen PI- und transient- infizierten Tieren (nach bisheriger Erfahrung); Cave: Probenqualität! Befundung sollte elektronisch erfolgen; in Sachsen werden dafür infrastrukturelle Voraussetzungen geschaffen Untersuchung von männlichen Tieren beinhaltet Zeitproblem, Totgeburten und Verendungen erfordern hohen Arbeitsaufwand Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz

19 Vielen Dank! Das gibt es auch! Juni 2010 Dr. Bernd-Andreas Schwarz