Erfahrungen mit der BVD- Ohrstanzendiagnostik in Thüringen

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1 Erfahrungen mit der BVD- Ohrstanzendiagnostik in Thüringen Wulf-Iwo Bock THÜRINGER LANDESAMT FÜR LEBENSMITTELSICHERHEIT UND VERBRAUCHERSCHUTZ (TLLV) Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal

2 Tierseuchendiagnostik Wie wünschen wir uns die Tierseuchendiagnostik??? Richtig (keine falsch negativen oder falsch positiven Ergebnisse) Robust (unabhängig von Luftfeuchte, Temperatur und Tageszeit ) Schnell (Ergebnis innerhalb 12 bis 24 Stunden) Automatisierbar (große Probenzahlen, schneller als die Seuche ) Bezahlbar ( mindestens so günstig wie die Feuerwehr ) Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 2

3 Qualitätssicherung bei der Diagnostik Ziel: Weg: Vermeidung falsch negativer oder falsch positiver Ergebnisse Einsatz von (Prozess-) Kontrollen für die gesamte Probenbearbeitung Es muss sichergestellt werden, dass Probenmaterial zur Untersuchung gelangt!!! (Die Grundvoraussetzung zur Vermeidung falsch negativer Ergebnisse ) Prozesskontrollen für die Probenlogistik (Identifizierung der Proben, Kontrolle der Qualität/Quantität für die weitere Bearbeitung (z. B. Pipettieren )) IC RIC/DIC IC (PCR) NTC PC Interne Kontrolle (Kontrolle von Extraktion und Inhibition) NS-Isolierungskontrolle (Kontrolle Kontamination und IC) Interne Kontrolle PCR (Kontrolle Inhibition) no template control (Kontrolle Kontamination) positiv Kontrolle (ggf. als Standard zur Quantifizierung) Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 3

4 Bisherige BVD-Untersuchungen in Thüringen I Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 4

5 BVD-Ohrstanzenuntersuchungen in Thüringen I BVD-Ohrstanzendiagnostik - Pilotstudie Thüringen ( ) Ziele: Etablierung, Training und Validierung der BVD-Ohrstanzendiagnostik im Labor des TLLV Training des Handlings des Einziehens von Gewebe-OM Vorbereitung der BVD-Bekämpfung gemäß BVDV-Verordnung (Start: ) Anforderungen an das Ohrstanzsystem aus Laborsicht: Einfache und sichere Handhabung beim Einziehen der Ohrmarke und der Probengewinnung Zuverlässigkeit bei der Probengewinnung (Leerproben) Möglichkeit zur direkten Begutachtung der Probe Ausschluss falsch negativer Ergebnisse (Lebenslanger Befund mit nur einer Untersuchung) Maschinenlesbarer Barcode auf dem Probengefäß, welcher der Tierkennzeichnung entspricht Nachvollziehbarkeit der Probenidentität, Kompatibilität zu LIMS Der Weg: eine Erzeugerkette (6 Betriebe) und 1 Einzelbetrieb (geplant ca Tiere) Ohrmarkenhersteller Fa. Caisley alle Kälber werden in der ersten Lebenswoche mit 2 Gewebestanzen beprobt PCR: nach Lyse Pool-US mit Virotype BVDV und Einzel-US mit in-house-pcr (IC beta-actin) die Blutprobenahme erfolgt nach dem 40. LT und dient als amtliches Ergebnis Die 2. Ohrstanze sollte in weiterer kommerzieller PCR untersucht werden (nicht realisiert) Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 5

6 BVD-Ohrstanzenuntersuchungen in Thüringen II BVD-Ohrstanzendiagnostik - Pilotstudie Thüringen ( ) Probleme/Kritikpunkte: Probenbeurteilung (Qualität und Quantität der Gewebestanze) Ausschlusskriterium eingesandte Gefäße teils defekt, nicht verschlossen, leer, unvollständig (weiß/gelb) IC (beta-actin) war in einigen Lysaten nicht nachweisbar ca. 5% der Proben waren nicht auswertbar!!! (kein Material, defektes Gefäß, keine IC) Logistik (Zuordnung im LIMS, manuelle Ergebnisübermittlung/Befundung (Schnittstellen)) Die schnelle einfache Gewebelyse führte zu einer verringerten Nukleinsäuereausbeute/-qualität für die PCR-Untersuchung (Faktor 1:1000 bis 1:10000 für die Einzelprobe) transiente Infektionen werden nicht erkannt aber PI-Tiere ggf. auch nicht (zusätzlich noch Poolung!!!)??? Ist so eine effektive Tierseuchenbekämpfung möglich??? Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 6

7 BVDV-Ohrstanzenuntersuchungen in Thüringen III BVD-Ohrstanzendiagnostik - Pilotstudie Thüringen ( ) Klärungsbedarf vor Einsatz als amtliche Untersuchung: Probenlogistik Untersuchungsantrag vs. Untersuchungsantragsfrei??? Anzahl der Untersuchungen 2010 & Probeneingang im TLLV nur schwer kalkulierbar!!! Anschaffung Gerätetechnik (abhängig von Ohrstanzsystem und der verwendeten PCR)??? Ergebnisübermittlung an Einsender/Landkreis vs. direkt in Hi-Tier oder auf OHR -Server??? Umgang mit dem Untersuchungsergebnis aus der Ohrstanzdiagnostik (Reicht schon das erste positive Ergebnis für den Status PI-Tier aus? Ist eine 2. Untersuchung aus Sicht der Tierseuchenbekämpfung (42 Tage PI-Tier im Bestand) gerechtfertigt/nötig?)??? falsch negative Ergebnisse??? Schulung / Information der ATÄ + TÄ + Landwirte zur Probenahme/Lagerung/Versand??? Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 7

8 Was brachte uns das Jahr 2010? Von der Bestandsuntersuchung zur Nachtreteruntersuchung Nachtreteruntersuchungen aller gewillten Betriebe Ohrstanzproben in Mutterkuhherden ab 01. April 2010 Blutuntersuchungen für alle anderen Betriebe ab 01. März 2010 Bestandsuntersuchungen zurückgestellte Betriebe aus dem Jahr 2009 (Anlage 7) Bestände mit einem aktuellen BVD-Problem in Abhängigkeit von den Untersuchungskapazitäten können in der 2. Jahreshälfte weitere Bestände untersucht werden Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 8

9 BVD-Ohrstanzenuntersuchungen 2010 Teil 1 BVD-Ohrstanzendiagnostik 2010 Start ab für Mutterkuhhaltungen Die Bestellung der Ohrstanz-Ohrmarken erfolgt normal über den TVL. Das Einziehen der OM muss innerhalb der ersten Lebenstage (bis spätestens 7. Lebenstag entsprechend den Vorgaben der ViehVerkV) erfolgen. Es werden aus beiden Ohren Stanzen entnommen, um Ausfälle (Nachuntersuchungen) durch Leerstanzen, beschädigte Gefäße und unzureichendes Probenmaterial u. a. zu minimieren. (Übergangsregelung bedingt durch Ergebnisse aus Pilot-Studie!!!) Der Rinderhalter muss unverzüglich nach Kennzeichnung des Tieres die Geburtsmeldung an die Datenbank HI- Tier durchführen, um den Vorgaben der Viehverkehrsverordnung zu entsprechen und gleichzeitig eine sichere Zuordnung der Befunde zum Tier zu gewährleisten. Ohrstanzen können für etwa zwei Wochen gekühlt (2 bis 8 C) gelagert werden, so dass mehrere Stanzen gemeinsam versandt werden können. Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 9

10 BVD-Ohrstanzenuntersuchungen 2010 Teil 2 Der Versand der Proben erfolgt über das Kuriersystem des Landes, in geeigneter doppelwandiger Verpackung (Tüte & Umverpackung aus z. B. Papier/Pappe) als antragsfreie Einsendung (kein Formular etc. nötig) an das Labor. Im antragslosen Verfahren eingesandte Proben werden vom Labor anhand der auf den Probengefäßen vorhandenen Ohrmarkennummern automatisiert identifiziert. Nach Probeneingang im Labor erfolgt umgehend die Bearbeitung, negative Ergebnisse liegen im Allgemeinen innerhalb von 4-5 Werktagen in der HI-Tier vor. mögliche Ergebnisse: Negativ = Nicht-PI-Tier Positiv = PI-Tier; sofortige Eliminierung aus dem Bestand nicht auswertbar (n. a.) = Nachuntersuchung mittels Blutprobe Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 10

11 BVD-Ohrstanzenuntersuchungen 2010 Teil 3 Die Untersuchungsergebnisse werden dem jeweiligen Tier durch Übermittlung der Befunde in die HI-Tier Datenbank anhand der Ohrmarkennummer eindeutig zugeordnet, so dass das Tier sein Lebensergebnis erhält und entsprechend gehandelt werden kann. Tierhalter und Viehhändler mit eigenem Zugang zu HI-Tier können jederzeit die BVD-Befunde jedes Tieres aus der Datenbank abrufen (vor Verkäufen oder sonstigen Verbringungen), Tierhalter ohne HIT-Zugang wenden sich diesbezüglich bitte an ihr zuständiges Veterinäramt. Für die Ohrstanzen (Einziehen & Versand an Labor) gilt Je früher, desto besser Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 11

12 Untersuchungsantragsfreie Bearbeitung 1. Probeneingang (Kurier, Post, persönlich) 2. Vergabe einer US-Nr./Tag im LIMS (Einsender=TH; Eingangsdatum) 3. Verteilung in das Labor (Sichten, Aufstellen, Einlesen aller Probengefäße) 4. Bearbeitung der Probe (Begutachtung, Lyse, Poolen, PCR-Diagnostik) 5. Zuordnung der Ergebnisse zum Einzeltier im LIMS (Kennzeichnung) 6. Befundung (Meldung aller Ergebnisse pos. / neg. / n. a. über Batch-Datei an die HI-Tier + zusätzlich alle pos. und n. a. an VLÜÄ) 7. Nachbearbeitung der Fehlermeldungen aus HI-Tier log-datei Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 12

13 Welche Probleme gab/gibt es??? Pilotstudie (ca Proben) Probenbeurteilung (falsch negative ) Anteil n. a. Proben (kein/nicht ausreichendes Material, IC) Befundung an Einsender inklusive manueller Bearbeitung/Auswertung seit April 2010 ( scharfe Anwendung ca Proben) Probenbeurteilung (zum Ausschluss falsch negativer Ergebnisse ) Begutachtung nach dem Stanzen + Lysepuffer ggf. mit manueller Nachbearbeitung (ca % der Proben) Erstellen einer Masterplatte vor dem Poolen Anteil n. a. Proben (kein/nicht ausreichendes Material, IC) sofortiger Austausch bei beanstandeten Gefäßen Bearbeitung der 2. Stanze (Rückhalteproben) nach IC Befundung / Datenübermittlung Antragsloses Verfahren Zunehmende Automatisierung der Probenbearbeitung und Datenübermittlung Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 13

14 Bewertung der IC bei Pool und Einzelproben IC bei Poolproben: je mehr Proben in einem Pool enthalten sind, desto weniger Auswirkung hat die Inhibition der Einzelprobe auf die Inhibition der Poolprobe Problem: Kann für Pool- und Einzelproben das gleiche Validierungskriterium (Ct < 36) für die IC angenommen werden??? Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 14

15 Bewertung der IC bei Pool und Einzelproben IC bei Poolproben: je mehr Proben in einem Pool enthalten sind, desto weniger Auswirkung hat die Inhibition der Einzelprobe auf die Inhibition der Poolprobe Problem: Kann für Pool- und Einzelproben das gleiche Validierungskriterium (Ct < 36) für die IC angenommen werden??? Oder ist es sinnvoller das Kriterium, in Abhängigkeit von der Poolgröße, für Pools strenger zu wählen, um falsch negative Ergebnisse zu vermeiden??? Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 15

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17 Bisherige Ergebnisse Positiv Verdächtig Negativ n. a. Summe April / ,3% / 96,3% 2,4% Mai / ,8% / 97,9% 1,3% Der Anteil manuell nachbearbeiteter Proben (Kontakt der Probe zum Lysepuffer muss sichergestellt sein) ist sehr hoch (ca %). Circa 200 Proben / Tag binden eine technische Mitarbeiterin bei der aktuellen Vorgehensweise Anteil n. a. scheint rückläufig (Trainingseffekt???, 2. Untersuchung) Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 17

18 Was bringt uns die Zukunft??? BVD-Diagnostik ab 2011 (aus heutiger Sicht) Viel Arbeit ca Proben/Jahr (3-fache Menge) Viele Nachfragen (nach Einsendungen und Ergebnissen )? Viele Falsch negative Proben???? Eine effiziente BVD-Bekämpfung??? Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 18

19 Danke an die Kolleginnen & Kollegen in den VLÜÄ s & im Feld (für die tollen Proben ), im Friedrich-Loeffler-Institut und vielen Dank an die fleißigen MitarbeiterInnen des TLLV Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 19

20 Danke an die Kolleginnen & Kollegen in den VLÜÄ s & im Feld (für die tollen Proben ), im Friedrich-Loeffler-Institut und vielen Dank an die fleißigen MitarbeiterInnen des TLLV und Ihnen danke ich für Ihre Aufmerksamkeit & eine hoffentlich kontroverse Diskussion Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 20

21 LABOR-IMPRESSIONEN Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 21

22 Valide (Ct < 36) Ct 36 Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 22

23 BVD-Untersuchungen in Thüringen Negativer Befund Negatives Einzeltierergebnis Positiver (1.) Befund Wiedereinsendung nach >42 Tagen Negatives Einzeltierergebnis (nicht PI-Tier) Positives Einzeltierergebnis (PI-Tier, laut BVDV-Verordnung) (Wiedereinsendung nach 42 Tagen, hohe Viruslast) Ohne Nachuntersuchung (PI-Tier, laut BVDV-VO) Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 23

24 BVD-Untersuchungen in Thüringen Verordnung zum Schutz der Rinder vor einer Infektion mit dem Bovinen Virusdiarrhoe-Virus Negativer Befund Positiver (1.) Befund (BVDV-Verordnung) vom 11. Dezember 2008, Bundesgesetzblatt Jahrgang 2008 Teil I Nr. 59, S.2461 vom 18. Dezember Begriffsbestimmungen Negatives Einzeltierergebnis Negatives Einzeltierergebnis persistent BVDV-infiziertes Rind: (nicht PI-Tier) Wiedereinsendung ein Rind, das mit einer nach in der >42 amtlichen Tagen Methodensammlung beschriebenen Methode mit positivem Ergebnis auf BVDV untersucht worden ist und Positives Einzeltierergebnis (PI-Tier, laut BVDV-Verordnung) a) das längstens 60 Tage nach der ersten Untersuchung erneut mit einer in der amtlichen Methodensammlung beschriebenen Methode mit positivem Ergebnis auf BVDV untersucht worden ist, b) bei dem eine Wiederholungsuntersuchung nach Buchstabe a unterblieben ist oder c) das an Mucosal Disease erkrankt ist, sowie die Nachkommen eines Rindes nach den Buchstaben a bis c. (Wiedereinsendung nach 42 Tagen, hohe Viruslast) Ohne Nachuntersuchung (PI-Tier, laut BVDV-VO) Workshop BVD-Ohrstanzendiagnostik, 17. Juni 2010, LAV Sachsen-Anhalt, Stendal Folie 24