MOL.504 Analyse von DNA- und Proteinsequenzen

Transkript

1 MOL.504 Analyse von DNA- und Proteinsequenzen

2 Inhaltsübersicht Molekulares Klonieren Vektoren und ihre Eigenschaften Programme für Vektorkarten und virtuelles Klonieren Protein-Expression mrna-eigenschaften und Translation Einfluß verschiedener Faktoren auf die Expression PCR und Primer-Design Eigenschaften von Primern

3 Klonieren in der Molekularbiologie Vektoren sind DNA-Vehikel, um Fremd-Gene in Wirtsorganismen einzuschleusen Klassisches Klonieren: Schneiden von Vektor und einzufügendem Gen (Insert). Ligation von Vektor und Insert zum fertigen Konstrukt Transformation/Transfektion des Vektors in die Wirtszelle, meist Bakterium oder Hefe Verdau Ligation Insert Transfektion/ Transformation Vektor (Plasmid)

4 Serial Cloner Workflow Cloning in silico und in vitro 1) Vorbereitung des Vektors 2) Vorbereitung des Inserts 3) Schneiden und Ligation 4) Analyse Vorbereitung Schneiden (Verdau) und Ligation Analyse Vektor (Plasmid)

5 Klonieren in der Molekularbiologie Klassisches Klonieren LIC Ligation independent Cloning (e.g. Gateway) Sequence and ligation independent cloning (SLIC) (Mamie Z Li & Stephen J Elledge Nature Methods 4, 251 (2007)) Gibson Assembly Cloning: assembly of multiple DNA fragments, regardless of fragment length or end compatibility (multiple overlapping DNA fragments in a single-tube isothermal reaction, Gibson, et al. (2010, 2009) Nature Methods.

6 Vektoren in der Molekularbiologie Vektor-Typen Plasmid-Vektoren zyklische, doppelsträngige DNA. Replikation in Bakterien unabhängig vom eigentlichen Chromosom Kapazität für Gen-Inserts: meist bis 5 kbp, max. 15 kbp Phagen-Vektoren virale DNA, linear oder zyklisch, doppel- oder einsträngig (Bakteriophage λ: linear, doppelsträngig). Kapazität: bis 25 kbp Cosmide Plasmide mit der cos-site (aus dem λ-phagen-genom) an der Klonierungsstelle Kapazität: bis 50 kbp

7 Vektoren in der Molekularbiologie Vektor-Funktionen Transkriptions-Vektoren Hauptzweck ist die Amplifizierung des Gen-Inserts durch Replikation des Vektors und Transkription des Inserts. Relativ einfach aufgebaute Vektoren (z.b. genotype recb, recc, and, sbcb) Expressions-Vektoren Hauptzweck ist die kontrollierte (Über-)Expression des vom Gen-Insert kodierten Proteins durch Replikation, Transkription und anschließende Translation der mrna. Den Eigenschaften des Promoters und der transkribierten mrna kommt besondere Bedeutung zu. Häufig in Kombination mit Expressions-tags (His-6, GST glutathione S- transferase, MBP maltose binding protein, etc). Signal peptides for secretion (e.g. in Pichia pastoris, Drosophila cells)

8 Aufbau von Vektoren minimale Komponenten eines Plasmid-Vektors Replikationsursprung (Ori) Notwendig zur Replikation des Plasmids im Organismus (z.b. Bakterium) Eigenschaften des Ori beeinflussen die Zahl der Kopien (low copy < 20, high copy = n 100) Promoter kontrolliert die Transkription: Bindungsstelle für RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren. Transkriptionsstart nach dem Promoter. multiple Klonierungsstelle (MCS) enthält Schnittstellen für das Einfügen des Ziel-Gens (restriction sites). Selektionsgen, Reportergen etc. amp-gen kodiert ß-Lactamase Antibiotika-Resistenz lac-promoter lacz-gen kodiert ß-Galaktosidase Bakterien blau anfärbbar, wenn keine DNA in die MCS eingefügt wurde

9 Aufbau von Vektoren multiple Klonierungsstelle (MCS) enthält Schnittstellen für das Einfügen des Ziel-Gens (restriction sites).

10 Programme für virtuelles Klonieren für die Planung von Klonierungs-Strategien am Computer sind Plasmidkarten sehr hilfreich Kommerzielle und freie Programme für Plasmidkarten, DNA-Analyse und weitere Funktionen (Auswahl): VectorNTI (Invitrogen) die am weitesten verbreitete Software Vector-Design-Software/Vector-NTI-Software.html Lasergene 8 (DNASTAR) Clonemanager 9 (SciEd Software) PlasMapper (online Tool) Text-Editor, Word

11 PlasMapper Web-Service zum Zeichnen von Plasmidkarten PlasMapper Zeichnen von annotierten Plasmidkarten aus FASTA-Sequenzen Direkteingabe oder Datei-Upload Bibliothek gebräuchlicher kommerzieller Vektoren > pet-25b(+) Vector, 5547 bp, Novagen Inc. atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctc aagaccc ggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagcc aactcag tgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgc tcgacat gggcgagttctggctggctagcccgtttgatctcgagt gcggccg agctcgaattcggatccgaattaattccgatatccatg gccatcg Dong et al. (2004). Nucl. Acids Res. 32, W

12 Programme für virtuelles Klonieren ApE- A Plasmid Editor; ApE.exe Freeware, download (Reads ABI sequencing trace files) University of Utah; Analyse der erhaltenen DNA-Sequenz richtiges Protein, in Frame etc etc

13 Serial Cloner Freeware-Programm zum virtuellen Klonieren Vektorkarten (zirkulär und linear), Annotation, Bibliothek von Restriktionsenzymen Virtuelle PCR, Schneiden, Ligieren

14 Expression von Proteinen / das Insert Übersicht des Informationsflusses

15 Gene Organization/ Gene regulatory elements h4c.htm

16 Expression von Proteinen Begriffsdefinitionen für DNA-Stränge der sense strand (= coding strand) läuft in konventioneller 5 3 -Richtung von ihm wird während der Transkription nicht abgelesen (= non-template strand) er weist die selbe Sequenz auf wie die transkribierte mrna (AS-Codons) der anti-sense strand (= non-coding strand) läuft in reverser 3 5 -Richtung er ist die Transkriptionsvorlage (= template strand) und wird 3 5 abgelesen, dh die Polymerasereaktion erfolgt 5 ->3. er weist die selbe Sequenz auf wie die Serie von trna-as-bausteinen während der Translation (AS-Anticodons) auf DNA-Ebene: 5 -cccggtgatgccagt-3 3 -gggccactacggtca-5 Ergebnis der Transkription: 5 -cccggugaugccagu-3 3 -gggccactacggtca-5 sense anti-sense mrna template Translation: 5 -cccggugaugccagu-3 Pro cca cua Gly Asp trna (Anticodons) cgg Ala uca Ser

17 Expression von Proteinen mrna in Prokaryonten Bacteria: mrna is linear initatior trna is formyl-methionine (fmettrna) ribosome is recruited to AUG codon via a Shine-Dalgarno (SD) sequence (with 3 end of 16S rrna ) 5 AGGAGGU-(X) AUG 3

18 Expression von Proteinen Gene Organization/ mrna in Prokaryonten Lipase EstA (Bacillus subtilis (strain 168)):

19 Expression von Proteinen Eukaryoten: Transkription, Splicing und Translation Enh Enh Prom E I E I E I E I E I E Transkription hnrna E I E I E I E I E I E AAA Spleißen mrna 5 UTR ^ aug ORF 3 UTR AAA Translation Protein

20 Expression von Proteinen Eukaryoten: Transkription, Splicing und Translation-Posttranslational modification Human LPL:

21 Design der Expressionskassette Die Beschaffenheit von Promoter, UTRs und ORF sowie einige weitere Faktoren haben Einfluß auf die Expression Translation start Coding Region (Gene of Interest) Promoter 5' UTR ORF 3'UTR Terminator Poly-A + -Tail expression casse tte Integration und Kopienzahl des Vektors Promoter (Stärke, konstitutiv, induzierbar) Lokalisation des Proteins (intrazellulär, sekretiert) 5 UTR, 3 UTR: Stabilität der mrna, Sekundärstruktur Translationsstart (Kozak, Shine-Dalgarno) Kodierende Sequenz (Sequenz, Codon Usage, ) Terminator (poly-(a)-signal, )

22 ORF-Eigenschaften mehrere Eigenschaften der kodierenden Sequenz haben Einfluß auf die Expression: DNA-Zusammensetzung (GC-Gehalt;) GC-Verteilung 2 Faktoren beeinflussen die Stabilität der DNA Doppelhelix: -Basenpaarung zwischen Komplementärsträngen - Base stacking zwischen benachbarten Basen Codon-Usage und Codon-Usage-Bias Codon-Tandemrepeats Kryptische Spleiß- und Poly-(A)-Signale Sekundärstrukturen Wichtig für Klonierarbeiten: Schnittstellen für Restriktionsenzyme

23 GC-Gehalt und -Verteilung lokale GC-Häufungen ( Spitzen ) sollten vermieden werden, kommen aber häufig vor unterschiedliche Organismen reagieren verschieden empfindlich das originale Gen kann durch ein synthetisches Gen mit alternativen Äquivalent-Codons ersetzt werden

24 Codon Usage Codons sind redundant das Muster der tatsächlich verwendeten Codons unterscheidet sich zwischen Organismen A.t. A. thaliana H.s. H. sapiens S.c. S. cerevisiae E.c. E. coli S. p. S. pombe die Codon-Häufigkeit korreliert mit der Menge der vorhandenen trnas. die Translations-Effizienz hängt von der Verfügbarkeit der trnas ab. AA Codon A.t. H.s. S.c. E.c. S.p. Ala GCU GCC GCA GCG Cys UGU UGC Asp GAU GAC Ile AUU AUC AUA Leu UUA UUG CUU CUC CUA CUG Arg CGU CGC CGA CGG AGA AGG

25 Codon-Tandemrepeats die aufeinanderfolgende Verwendung des gleichen Codons kann zu einer lokalen Verarmung der dazugehörigen trna am Ribosom führen und dadurch die Translation bremsen. dies gilt auch, wenn es sich um ein häufiges Codon handelt. ACT GTC, GTT, GTG, GTA, GTT Thr Val

26 ORF-Sekundärstrukturen ausgeprägte Helices oder Hairpins können zur Verlangsamung oder zum Abbruch der Translation führen, da diese Strukturen von den Ribosomen kaum oder gar nicht aufgelöst werden können vgl. Translationsstart. original optimiert Original Optimiert Anzahl der Helices Durchschnittliche Helixlänge 6,58 5,53 Maximale Helixlänge 10 9 Durchschnittlicher Helix-Score 7,84 4,13

27 Synthetische Gene Äquivalent-Gene mit optimierten Eigenschaften können mittels bioinformatischer Analyse geplant/designed werden. z.b.: GeneDesigner (DNA 2.0): Integration von Design & Synthese genedesigner2/

28 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR ist eine in vitro-replikation von DNA dient der Amplifizierung von Genen auch geeignet zum Erzeugen von DNA-Inserts für die Klonierung benötigt: Ausgangs-DNA (template), DNA-Polymerase, 2 Primer, Nukleotide, Puffer Denaturierung bei C Annealing bei (z. B.) 55 C Primer-Hybridisierung Elongation bei 72 C Komplettierung des 1. Zyklus: Verdoppelung der DNA-Menge Zyklus: 4x, 8x usw. (n Zyklen 2 n fache Vervielfachung)

29 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Beispiel für eine PCR Fwd primer: 5 -atgacattagaaatcttcg-3 Rev primer: 5 -gctcataatcatatttttc-3 coding strand: non-coding strand: 5 -atgacattagaaatcttcgaatacttagaaaaatatgattatgagc 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg coding strand: 5 -atgacattagaaatcttcgaatacttagaaaaatatgattatgagc non-coding strand: 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg coding strand: Rev primer: Fwd primer: non-coding strand: 5 -atgacattagaaatcttcgaatacttagaaaaatatgattatgagc 3 -ctttttatactaatactcg-5 5 -atgacattagaaatcttcg-3 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg Coding strand: new n.c. strand: new coding strand: non-coding strand: 5 -atgacattagaaatcttcgaatacttagaaaaatatgattatgagc-3 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg-5 5 -atgacattagaaatcttcgaatacttagaaaaatatgattatgagc-3 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg-5

30 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Primerdesign forward und reverse Primer coding strand: non-coding strand: 5 -atgacattagaaatcttcgaatacttagaaaaatatgattatgagc-3 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg-5 Fwd primer: 5 -atgacattagaaatcttcg-3 Rev primer: 5 -gctcataatcatatttttc-3 forward Primer entspricht der Sequenz, die ich amplifizieren möchte forward primer annealed am und amplifiziert den non-coding strand DNA polymerase Richtung: 5 ->3 Fwd primer: non-coding strand: new coding strand: non-coding strand: 5 -atgacattagaaatcttcg-3 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg 5 -atgacattagaaatcttcgaatacttagaaaaatatgattatgagc-3 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg-5

31 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Primerdesign forward und reverse Primer coding strand: non-coding strand: 5 -atgacattagaaatcttcgaatacttagaaaaatatgattatgagc-3 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg-5 Rev primer: 5 -gctcataatcatatttttc-3 Die Richtung der DNA-Polymerase ist 5 ->3, der reverse primer muss am coding strand annealen damit ihn die Polymerase amplifizieren kann Annnealing am Teil 5 -gaaaaatatgattatgagc-3 ; reverse: 5 -cgagtattagtataaaaag-3; complement: 5 -gctcataatcatatttttc-3 reverse Primer entspricht dem reverse complement der Sequenz, die ich amplifizieren möchte (blau) entspricht also der Sequenz des noncoding Strandes. Erstellen des Reverse complement manuell oder mit programmen (e.g. Coding strand: new n.c. strand: 5 -atgacattagaaatcttcgaatacttagaaaaatatgattatgagc-3 3 -tactgtaatctttagaagcttatgaatctttttatactaatactcg-5

32 Primer-Design wichtige (!) Überlegungen Start/Ende des zu amplifizierenden Gens markieren die Bindungsstellen von Fwd/Rev-Primer maßgeschneiderte Primer. ggf. Schnittstelle für Restriktionsenzyme (z.b. BamHI, XhoI) in den Primern, um später passendes Insert zu bekommen. hg0s2_22-103: Forward: GGATCCAAGATGGTGAAGCTGTACG Reverse: CTCGAGCTAAGAGGCGTGCTGC Berücksichtigung des Stop-Codons (TAG; TAA, TGA; Frame, Position) hg0s2_22-103: Reverse: CCGCTCGAGCTAAGAGGCGTGCTGC

33 Primer-Design wichtige (!) Überlegungen Um für den späteren Schnitt dem Restriktionsenzym genügend Angriffsfläche auf der DNA zu geben, wird noch ein 5 overhang ( frei wählbar ) zugefügt. hg0s2_22-103: Forward: GGCGCCGGATCCAAGATGGTGAAGCTGTACG Reverse: CCGCTCGAGCTAAGAGGCGTGCTGC GC-clamp am 3 -Ende des Primers (besseres Annealing H-Brücken). um die Primer-Bindung (Hybridisierung) spezifisch zu machen sollte die Primer-Länge mindestens 15 bp (üblich bp) betragen; die Qualität der synthetisierten Primer ist meist bis ca. 40 bp in ungereinigter Form OK. um die Dimerisierung von Primern (Fwd:Rev) zu vermeiden, sollten die Primer an ihren 3 -Enden nicht komplementär zueinander sein. Die Primersequenzen sollten so beschaffen sein, dass die Primer keine Sekundärstruktur (v.a. Hairpins) bilden.

34 Primer-Design wichtige (!) Überlegungen Berücksichtigung des Frames of Translation, insb. bei Fusionsproteinen NcoI-site BamHI site EheI - site Schmelztemperatur der Primer sollte ca C betragen.

35 Primer-Design praktische Überlegungen (Ablauf der PCR) Länge und GC-Gehalt der Primer bestimmen deren Schmelztemperatur T m T m ~ 4 * (G+C) + 2 * (A+T) z. B. 10 A + 10 T 10 G + 10 T 5 A + 5 T + 5 G + 5 C ~40 C ~80 C ~60 C die Annealing-Temperatur sollte mindestens 5 C unter T m liegen die PCR verläuft spezifischer, je höher die Annealing-Temperatur ist (max. ~75 C, da sonst zuwenig Produkt-Ausbeute) hohe T m wünschenswert Es ist unbedingt ratsam, den Beipackzettel der jeweils verwendeten Polymerase zu beachten, da ideale Bedingungen für Annealing und Amplification oft vom Typ der Polymerase abhängt.

36 Software für Primer/Klonieren/DNA/Analyse Primer3 OligoPerfect Designer (free tool from lifetechnologies) NCBI Tools: Primer-BLAST IDT-Integrated DNA Technology: WORD/WordPad/Editor BioEdit (