Biochemische Übungen II. Antikörper und Antigene

Transkript

1 Biochemische Übungen II Antikörper und Antigene

2 Antikörper - Struktur

3 Komposition der 5 Ig Klassen (human) Class Heavy chain Subclasses Light chain IgG γ γ1, γ2, γ3, γ4 κ or λ IgM µ - κ or λ IgA α α1, α2 κ or λ IgE ε - κ or λ IgD δ - κ or λ

4 Aufklärung der Antikörper-Struktur Porter und Edelman, Nobelpreis 1972

5 Immunglobulin-Faltung

6 Modell von IgG

7 Antikörper-Klassen

8 IgG-Subklassen

9 Antigene Determinanten von Ig

10 Epitop-Paratop a sequenzielles oder kontinuierliches Epitop b konformationsbedingtes oder diskontinuierliches Epitop c verborgene antigene Determinante d Neoantigen Antigenbindungsstelle=Paratop Komplementarität

11 Antigen-Antikörper-Komplex

12 Humorale Immunreaktion

13 Antikörperproduktion Injektion von Antigen s.c. (subcutan) i.m. (intramuskulär) i.v. (intravenös) i.p. (intraperitoneal) Blutabnahme und Serumgewinnung

14 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Verschiedene Variationen zur qualitativen Bestimmung oder zur quantitativen Messung von Antigen oder Antikörper Standardkurve mit bekannten Konzentrationen von Antigen oder Antikörper hergestellt und daraus die Konzentration einer Probe bestimmt Antikörper mit Enzym (zb Alkaline Phosphatase oder Horseradish Peroxidase HRP) konjugiert; Enzym reagiert mit farblosem Substrat zu färbigem Produkt; Messung der Absorption im Photometer Chemilumineszenz: sensitiver als colorimetrische Bestimmung; Oxidation des Substrats Luminol durch HRP und H 2 O 2 produziert Licht, Messung der Photonen im Luminometer

15 ELISA Indirect ELISA (Antibody capture assay) Sandwich ELISA Competitive ELISA

16 Antigen-Antikörper-Interaktion

17 Antigen-Antikörper-Interaktion Assoziation zweier Moleküle, ohne chemische Veränderung reversibel Nicht-kovalente Interaktion zwischen Epitop und variabler Region Immunologische Assays zur Detektion von Antigen oder Antikörper: Diagnose von Krankheiten Humorale Immunreaktionen Identifizierung von biologisch oder medizinisch relevanten Molekülen Unterschiedlich schnell und sensitiv Qualitativ/quantitativ

18 Antigen-Antikörper-Interaktion

19 Affinität Stärke aller nicht-kovalenten Interaktionen zwischen einzelner Antigen-Bindungsstelle auf einem Antikörper und einzelnem Epitop ist definiert als Affinität des Antikörpers für das Epitop Antikörper mit niedriger Affinität binden schwach, dissoziieren rasch Hochaffine Antikörper binden stärker, bleiben länger gebunden

20 Avidität Affinität an einer Bindungsstelle reflektiert nicht immer die wirkliche Stärke einer Ag-Ab Interaktion: komplexe Antigene mit vielen sich wiederholenden antigenen Determinanten und Antikörper mit mehreren Bindungsstellen Interaktion von Ag und Ab an einer Stelle steigert Wahrscheinlichkeit zur Reaktion an einer zweiten Stelle Stärke von solchen mehrfachen Interaktionen zwischen multivalentem Antikörper und Antigen als Avidität bezeichnet Hohe Avidität kompensiert niedrige Affinität (pentameres IgM)

21 Kreuzreaktivität Trotz hoher Spezifität von Ag-Ab Interaktionen können Ab gegen ein bestimmtes Ag mit einem unbeteiligten Ag kreuzreagieren 2 verschiedene Ag besitzen identes Epitop oder Abs spezifisch für ein Epitop binden auch ein unbeteiligtes Epitop mit ähnlichen chemischen Eigenschaften Oft bei Polysaccharid-Antigenen aus ähnlichen Oligosacchariden ABO-Blutgruppenantigene: Glycoproteine auf roten Blutkörperchen feine Unterschiede in den endständigen Zuckerresten zwischen A und B Blutgruppenantigenen

22 Kreuzreaktivität - Blutgruppen Blutgruppe Ag auf RBCs Serum Ab A A Anti-B B B Anti-A AB A und B Keine 0 keines Anti-A und Anti-B Ab nicht durch Ag auf RBCs, sondern durch kreuzreaktive mikrobielle Ag auf gewöhnlichen Darmbakterien; diese kreuzreaktiven mikrobiellen Ag induzieren Ab in Personen, denen das jeweilige Ag auf ihren RBCs fehlt; Blutgruppen- Ab kreuzreagieren mit ähnlichen Oligosacchariden auf RBCs

23 Kreuzreaktivität - Autoimmunität Viren und Bakterien besitzen antigene Determinanten, die identisch oder ähnlich normalen Wirtszell-Komponenten sind Induzieren Ab, die mit diesen Komponenten kreuzreagieren -Gewebsschädigung Beispiel: Streptococcus pyogenes M-Antigene der Zellwand Ab gegen M-Antigene kreuzreagieren mit Proteinen von Herz- und Skelettmuskulatur

24 Präzipitation Lösliches Antigen + spezifischer Antikörper --> Komplexbildung --> sichtbares Präzipitat; Antikörper = Prezipitin Abhängigkeit von der Valenz von Antigen + Antikörper: Antikörper muss bivalent sein Antigen muss entweder bivalent oder polyvalent sein zumindest 2 Kopien desselben Epitops oder unterschiedliche Epitope, die mit verschiedenen Antikörpern in einem polyklonalen Antiserum reagieren

25 Präzipitation Beispiel Myoglobin Präzipitiert nur mit spezifischem polyklonalen Antiserum, nicht mit spezifischem monoklonalen Antikörper

26 Präzipitation in Lösungen Heidelberger Kurve

27 Präzipitation in Gelen Präzipitate nicht nur in Lösungen sondern auch in Agar: Antigen und Antikörper diffundieren im Agar gegeneinander oder Antikörper sind im Agar enthalten und das Antigen diffundiert in diese Matrix sichtbare Präzipitation im Äquivalenzbereich Immundiffusion zur Bestimmung relativer Konzentrationen von Antikörpern oder Antigenen zum Vergleich von Antigenen zur Bestimmung der Reinheit einer Antigen-Präparation

28 Radiale Immundiffusion Mancini-Methode

29 Doppelte Immundiffusion Ouchterlony-Methode

30 Western Blot

31 Western Blot

32 Western Blot

33 Western Blot

34 Agglutination Interaktion zwischen Antikörper und partikulärem Antigen --> sichtbares Verklumpen Antikörper = Agglutinin Überschuss an Antikörper inhibiert Agglutination prozone effect : Zahl der Antikörperbindungsstellen >> Zahl der Epitope --> nur univalente Bindung und kein Crosslinking Hohe Konzentration von Antikörpern, die zwar das Antigen binden, aber keine Agglutination induzieren incomplete antibodies : Oft IgG, besetzt alle Bindungsstellen, blockiert Zugang für Agglutinin (zb IgM) Durch eingeschränkte Flexibilität in der hinge-region oder ungünstige Lokalisation von Epitopen

35 Hämagglutination Zur Charakterisierung von roten Blutkörpern (RBCs): RBCs werden auf einem Objektträger mit Antiseren gegen die Blutgruppenantigene A oder B gemischt; ist das jeweilige Antigen auf den Zellen vorhanden Agglutination

36 Bakterielle Agglutination Bakterielle Infektion induziert Antikörper gegen Oberflächenantigene des Erregers, Nachweis durch Agglutinations-Reaktion: Verdünnungsreihe des Serums mit vermutetem Erreger versetzt; höchste Verdünnung, die noch zu sichtbarer Agglutination führt Antikörper-Titer Beispiel: Verdünnung 1/640 zeigt noch Agglutination, 1/1280 keine mehr Titer des Patienten ist 640

37 Radioimmunoassay (RIA) Kompetitive Bindung von radioaktiv ( 125 I oder 3 H) markiertem Ag (Ag*) und unmarkiertem Ag an einen hochaffinen Ab Ag* mit dem Ab gemischt bei Konzentrationen, die die Ag- Bindungsstellen des Ab absättigen, dazu kommt in steigenden Mengen die Probe mit unmarkiertem Ag unbekannter Konzentration Ag* und unmarkiertes Ag kompetitieren um Bindungsstellen auf dem Ab Steigende Konzentrationen von unmarkiertem Ag verdrängen Ag* von den Bindungsstellen Abnahme der Menge an gebundenem Ag* als Maß für die Menge an Ag in der Probe

38 RIA zur Detektion von HBV in Blut Festphasen-RIA zur einfacheren Trennung der Ab-Ag-Komplexe von ungebundenem Ag

39 ELISPOT Assay S = secreting, NS = nonsecreting cell CS = chromogenic substrate CP = colored product (unlöslich)

40 MACS: Positive Selektion Target-Zellen werden mittels Microbeads magnetisch markiert Markierte Zellen bleiben auf der Säule, unmarkierte laufen durch Target-Zellen werden von der Säule eluiert

41 MACS: Depletion Unerwünschte Zellen werden mittels Microbeads magnetisch markiert Markierte Zellen bleiben auf der Säule Die unmarkierten Target-Zellen laufen durch