Die Biacore-Technologie in der pharmazeutisch- biotechnologischen Industrie
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- Rainer Beck
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1 Die Biacore-Technologie in der pharmazeutisch- biotechnologischen Industrie Dr. Matthias Kania Rentschler Biotechnologie Laupheim
2 Inhalt Einführung in die Biacoretechnologie Anwendungsmöglichkeiten glichkeiten des Biacore Zusammenfassung
3 Biacore-Technologie Oberflächenplasmonresonanz (SPR) optisches Messverfahren Detektion der Massenzunahme auf dünnem d Goldfilm mit aufgelagerter Dextranmatrix Flusssystem real-time time-messung Bindung des Analyten an den immobilisierten Liganden kann in Echtzeit verfolgt werden kinetische Messungen
4 Aufbau einer Flusszelle
5 SPR-Sensorgramm Sensorgramm Signalantwort [RU] Assoziation Dissoziation Regeneration Zeit [s]
6 Anwendungsmöglichkeiten glichkeiten Konzentrationsbestimmungen (nm( nm-bereich) Freigabe Drug Substance IPC-Proben Proben Stabilitätsstudien tsstudien Rezeptor-Bindungs Bindungs-Studien (Potency( Potency-Assays) Anti-Drug Drug-Antibody (ADA) ADA)-DetektionDetektion
7 Biacore-Konzentrationsassay Probeninjektion Regeneration AK AK AK AK Dextranmatrix Goldfilm
8 Immobilisierung Assayentwicklung Wahl des Liganden und Kopplungsart Coupling conditions (Pufferart, Injektionsdauer etc.) Regeneration Pufferart Molarität ph-wert Injektionsdauer Testcharakterisierung Spezifität Präzision Richtigkeit Working Range Robustheit
9 Regenerationscouting M 2 M 3 M Signalantwort [RU] Basislinie [RU] Zyklus 16000
10 IL-6-Konzentrationsbestimmung Parameter-Kalibrierkurve Signalantwort [RU] IL-6-Konzentration [ng/ml]
11 IL-6-Konzentrationsbestimmung Arbeitsbereich: ng/ml IL-6 Richtigkeit: % Präzision: CV < 6 % hohe Spezifität hohe Lebensdauer der Flusszelle mehr als 400 Messzyklen durchführbar hrbar ( ( 270 Proben) Messung von QC samples am Anfang und Ende der Messung zeigen mögliche m Alterung des Sensorchips an + kurze Entwicklungszeit von ca. 1,5 Monaten
12 Konzentrationsmessungen Vergleich mit ELISA: + kein Detektionsantikörper notwendig + oftmals größ ößerer Arbeitsbereich + hohe Präzision (CV < 10%) + Richtigkeit zwischen % + automatisierbar + GMP-konforme Bestimmung und Protokollierung - geringere Sensitivität - höhere here Kosten
13 Messung der aktiven Konzentration (Rezeptor-Ligand-Assays) ICH Q6B:. Examples of procedures for biotechnological/biological biological products.include.include: animal-based biological assay, cell culture-based biological assays, biochemical assays, other procedures such as ligand and receptor binding assays may be acceptable
14 Assayentwicklung Immobilisierung des Rezeptors Regeneration Testcharakterisierung Spezifität Präzision Richtigkeit Working Range Robustness
15 Rezeptor-Bindungs Bindungs-Studien IL-6 Probeninjektion IL-6 IL-6 IL-6 Regeneration Dextranmatrix Goldfilm
16 Rezeptor-Bindungs Bindungs-Studien Entwicklung eines Rezeptorassays zur Quantifizierung der aktiven IL-6-Konzentration Signalantwort [RU] Parameter-Kalibrierkurve R hi = 1457 R lo = 4,703 A1 = 3694 A2 = 1,064 X 2 = 2, Konzentration [ng/ml]
17 Rezeptor-Bindungs Bindungs-Studien Arbeitsbereich: ng/ml IL-6 Richtigkeit: % Präzision: < 6 % hohe Spezifität hohe Lebensdauer der Flusszelle mehr als 250 Messzyklen durchführbar hrbar ( ( 170 Proben)
18 Messung denaturierter IL-6 6 Proben mit dem Rezeptorassay Aktivität [%] Temperatur [ C] Abnahme der Bindungsaktivität ab 40 C
19 Messung der aktiven Konzentration (Rezeptor-Bindungs Bindungs-Studien) Vor- und Nachteile: + hohe Präzision (CV < 10%) und Richtigkeit + Robustheit + mehr Information über die Konformation des Analyten als durch Immunoassay + schließt t Lücke L in frühen Entwicklungsstadien, in der Bioassays oftmals nicht zur Verfügung stehen - Binding Assay liefert oft alleine keine ausreichende Aussagen über Bioaktivität
20 Anti-drug antibodies (ADA) Detektion Substanzen > 1000 Da können k Immunantwort hervorrufen ADA können k die Wirksamkeit des Präparates herabsetzen ADA können k die Pharmacokinetik des Präparates verändern Kreuzreaktion mit natürlichen endogenen Proteinen möglich Behörde verlangt ADA-Bestimmung
21 ADA-Detektion Detektion Immobilisierung des Drug-Product Injektion von Serumproben Detektion der Signalantwort Möglichkeit: Injektion von Subklassenantikörper (anti-human-ig)) zur Detektion der Immunglobulin-Spezies spezifische Ig-Signalantwort
22 ADA-Detektion Detektion anti-human IgG 1 -AK AK anti-human IgG1-AK AK Seruminjektion Sekundär-AK DP DP DP Dextranmatrix Goldfilm
23 ADA-Detektion Detektion Primärantwort durch Seruminjektion 1000 unspezifischer Threshold Signalantwort [RU] negativ positiv
24 Proben ID Vergleich mit Bioassay Biacore Bioassay Biacore erkennt alle bindende AK
25 ADA-Detektion Detektion gute Übereinstimmung mit Ergebnissen des Bioassay (Nab-Tests) Bioassay detektiert die relevante AK (neutralisierende AK) ABER: + schnellere Entwicklung + einfaches Handling + reproduzierbarer + effizientere Methode Als Präscreening gute Alternative zum Bioassay
26 Zusammenfassung GMP gerechter Betrieb und Dokumentation mit dem Biacore C Freigabe-Analytik ADA-Bestimmung Mögliche Alternative zu ELISA (Konzentrationassay)) und Bioassay (Rezeptor-Ligand-Assay) einfache und schnelle Assay-Entwicklung
27 Danksagung Hr. Dipl. Biol. A. Wieland Fr. Dipl.-Ing. (FH) S. Svoboda Fr. A. Wink Fr. A. Unzeitig Fr. S. Sättele Hr. B. Weiß
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