Entwicklung eines LAP-Sensors zur Erfassung der mikrobiellen Aktivität in Abhängigkeit von Nährstoffkonzentrationen

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1 Entwicklung eines LAP-Sensors zur Erfassung der mikrobiellen Aktivität in Abhängigkeit von Nährstoffkonzentrationen Dr. Simone Groebel FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES Gliederung 1. Einleitung I. Interdisziplinäre Messdaten II. Herausforderungen und Lösungsansätze 2. Die Entschlüsselung der Organismen I. Erstellung von Gendatenbanken II. Nachweis und Quantifizierung 3. Die Entwicklung eines LAPS I. Das Messprinzip II. Die Realisierung III. Messungen IV. Einsatzbereiche & Entwicklungspotentiale 4. Fazit und Ausblick FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

2 Einleitung Interdisziplinäre Messdaten Temperatur Durchmischung Verweilzeit ph T Substratzusammensetzung Wassergehalt Leitfähigkeit Redoxpotential Zerkleinerung ph-wert FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Einleitung Interdisziplinäre Messdaten Temperatur Durchmischung Verweilzeit Wassergehalt Leitfähigkeit ph T Substratzusammensetzung Redoxpotential Hochmolekulare Verbindungen Zerkleinerung Polysaccharide, Fette, Proteine Niedermolekulare Verbindungen, Glukose, Aminosäuren, Fettsäuren Organische Säuren, ph-wert Alkohole Acetat CH 4, CO 2 CO 2, H 2 FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

3 Einleitung Herausforderungen und Lösungsansätze Das Problem: komplexer Prozess der Biogasbildung viele Organismengruppen agieren zusammen die ideale Prozessüberwachung ist aktuell noch nicht entwickelt ph T Frage: Wie kann eine Biogasanlage überwacht und kontrolliert werden? Der Weg: Detektion der metabolischen Produkte direkt nahe der Organismen im Fermenter Die Idee: ein ph-sensitiver Biosensor mit Organismen auf der Oberfläche FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Einleitung Herausforderungen und Lösungsansätze ph T FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

4 Gliederung 1. Einleitung I. Interdisziplinäre Messdaten II. Herausforderungen und Lösungsansätze 2. Die Entschlüsselung der Organismen I. Erstellung von Gendatenbanken II. Nachweis und Quantifizierung 3. Die Entwicklung eines LAPS I. Das Messprinzip II. Die Realisierung III. Messungen IV. Einsatzbereiche & Entwicklungspotentiale 4. Fazit und Ausblick FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Die Entschlüsselung der Organismen Erstellung von Gendatenbanken GAAATCGCAGC ATCGGATCCGT. TCCGATTCTCCG. Identifizierung der prozesstragenden Organismen durch Gendatenbank FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

5 Die Entschlüsselung der Organismen Nachweis und Quantifizierung GAAATCGCAGC ATCGGATCCGT. TCCGATTCTCCG. Identifizierung der prozesstragenden Organismen durch Gendatenbank Design von Sonden & Primern Nachweis über Fluoreszenzin-situ-Hybridisierung (FISH) FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Die Entschlüsselung der Organismen Nachweis und Quantifizierung FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Analyse direkt im Habitat Keine aufwendige Vorbereitung, nur spezifische Sonden FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

6 Die Entschlüsselung der Organismen Nachweis und Quantifizierung Mikroskopische Aufnahme einer Fermenterprobe (1:4 verdünnt); 1: lichtmikroskopische Phasenkontrastaufnahme; 2: mit allgemeiner Archaeensonde Rhodamin green (grün) markiert; 3: mit spezifischer Mollicutes-Sonde (AJB 101) - Cy 3 (rot) markiert; 4: Überlagerung der Aufnahmen 2 und 3 FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Die Entschlüsselung der Organismen Nachweis und Quantifizierung GAAATCGCAGC ATCGGATCCGT. TCCGATTCTCCG. Identifizierung der prozesstragenden Organismen durch Gendatenbank Design von Sonden & Primern Nachweis über Fluoreszenzin-situ-Hybridisierung (FISH) 4 5 Quantifizierung mittels real time PCR FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

7 Die Entschlüsselung der Organismen Nachweis und Quantifizierung Real time PCR Methode zur Bestimmung der DNA-Menge Erkenntnisse über die Varianz, die Häufigkeit und der Zusammenhänge der Organismen! FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Gliederung 1. Einleitung I. Interdisziplinäre Messdaten II. Herausforderungen und Lösungsansätze 2. Die Entschlüsselung der Organismen I. Erstellung von Gendatenbanken II. Nachweis und Quantifizierung 3. Die Entwicklung eines LAPS I. Das Messprinzip II. Die Realisierung III. Messungen IV. Einsatzbereiche & Entwicklungspotentiale 4. Fazit und Ausblick FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

8 Die Entwicklung eines LAPS Das Messprinzip LAPS Lichtadressierbarer potentiometrischer Sensor halbleiterbasierter Chemo- und Biosensor ortsaufgelöste potentiometrische Analytbestimmung ph- empfindliche Ta 2 O 5 -Schicht mit Lichtquelle lokale ph-wert-messung Die Idee Detektion der metabolischen Aktivität in unmittelbarer Umgebung der Organismen in Fermenterproben FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Die Entwicklung eines LAPS Das Messprinzip Aufbau Messung eines Fotostromes Abhängig von angelegter Spannung (U BIAS ) Oberflächenpotential (Konzentration) Licht U BIAS + Oberflächenpotential + Licht Fotostrom Ausleseprinzip Beispiel mit drei verschiedenen ph- Lösungen H + -Ionenkonzentrationsabhängiges Oberflächenpotential verschiebt die I/V-Kurve Verschiebung der I/V-Kurve an I wp ergibt das Messsignal Werner, 2008 U bias FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

9 Die Entwicklung eines LAPS Das Messprinzip Proof of principle E. coli als Testorganismus in Flüssigkultur Werner, C.F., Krumbe, C., Schumacher, K., Groebel, S., Spelthahn, H., Stellberg, M., Wagner, T., Yoshinobu, T., Selmer, T., Keusgen, M., Baumann, M.E.M., Schöning, M.J., (2011) Determination of the extracellular acidification of Escherichia coli by a light-addressable potentiometric sensor [Artikel] // Physica Status Solidi A 208 (6). - S FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Die Entwicklung eines LAPS Das Messprinzip Anforderungen an Mikroorganismen ph-änderung durch Stoffwechselumsatz Vorkommen in Biogasfermenter immobilisierbar oben: Escherichia coli; links: Methanosaeta concilii Immobilisierung der Organismen reproduzierbar in Organismenanzahl und Schichtdicke langzeitstabil gute Diffusion der Substrate und Produkte Acrylamid/Bisacrylamidgel FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

10 Die Entwicklung eines LAPS Die Realisierung Chipaufbau Messzellen Membran U bias Schumacher, 2009 FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Die Entwicklung eines LAPS Messungen Test der Reproduzierbarkeit in Differenzanordnung immobilisierte E.coli im Acrylamidgel in LB-Medium Werner, C.F., Krumbe, C., Schumacher, K., Groebel, S., Spelthahn, H., Stellberg, M., Wagner, T., Yoshinobu, T., Selmer, T., Keusgen, M., Baumann, M.E.M., Schöning, M.J., (2011) Determination of the extracellular acidification of Escherichia coli by a light-addressable potentiometric sensor [Artikel] // Physica Status Solidi A 208 (6). - S FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

11 Die Entwicklung eines LAPS Messungen Konzentrationsabhängige Messungen mit E. coli in Puffer Potential / mv c Glucose= 0,5 mmol/l 0,47*10 4 H + /(s*zelle) c Glucose= 1,0 mmol/l c Gluc= 1,5 mmol/l 0,55*10 4 H + /(s*zelle) 1,02*10 4 H + /(s*zelle) Potentialdifferenz / mv ,1341-1,584-2, Zeit / min Werner, C.F., Groebel, S., Krumbe, C., Wagner, T., Selmer, T., Yoshinobu, T., Baumann, M.E.M., Keusgen, M., Schöning, M.J., (2012) Nutrient concentrationsensitive microorganism-based biosensor [Artikel] // Physica Status Solidi A 209 (5). - S FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Die Entwicklung eines LAPS Messungen Anaerobe Messungen mit immobilisierten E. coli in Gülle FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

12 Zusammenfassung Einsatzbereich & Entwicklungspotentiale Bestimmung der metabolischen Aktivität der Organismen möglich Reproduzierbare Ergebnisse bei Messungen mit in Gel immobilisierten E. coli in Differenzanordnung Messsignal direkt abhängig von der Substratkonzentration Messungen in Fermentationslösung demonstriert Idee des Sensors weiter verfolgen Entwicklung eines Multisensors (verschiedene Organismen und Parameter erfassen, um Gesamtüberblick zu erhalten) Onlineüberwachung der Stoffwechselaktivität der Fermentermikrobiologie FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März Zusammenfassung Erkenntnisse & Ausblick ph T FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES 27. März

13 Vielen Dank! Membran Danksagung Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV), Fachagentur nachwachsende Rohstoffe (FNR) FH AACHEN UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES