Wasserchemisches Praktikum. - Immunoassays (ELISA) -

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1 Wasserchemisches Praktikum - Immunoassays (ELISA) - Referent: Helmut Kremer Vertrieb und Beratung Coring System Diagnostix GmbH Magdalenenstr. 21 D Gernsheim Tel.: 06258/ Fax: 06258/ Info@Coring.de Homepage:

2 ELISA Quantitative oder semiquantitative Screening Tests für Probenserien Seit mehr als 25 Jahren werden ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) in vielen Bereichen der Analytik als schnelle Screening Tests erfolgreich eingesetzt (Rückstandsanalytik von Pharmaka, industriellen Kontaminaten und Pestiziden sowie von natürlichen Toxinen wie Mykotoxine oder Algentoxine, Nachweis von Tierarten, allergenen Proteinen, pathogenen Keimen, Vitaminen, etc.). Die Analysen mit ELISA sind im Vergleich zu den aufwändigen chromatographischen Laborverfahren (z.b. HPLC, GC-MS, LC-MS) mit minimalem Geräteeinsatz kostengünstiger durchzuführen. Wenn ELISA Verfahren für die Kontrolle gesetzlicher Grenzwerte im Rahmen der Rückstandsanalytik eingesetzt werden, sollten positive Ergebnisse mit Referenz-Methoden abgesichert werden. Immunoassays - wie ein ELISA - sind analytische Verfahren, bei denen Antikörper, die gegen bestimmte Analyten oder Analytgruppen erzeugt wurden, als biochemische Sonden zur Quantifizierung der Analytkonzentration in unbekannten Proben eingesetzt werden. Je nach Größe des Analyten, gewünschten Nachweisgrenzen, zu prüfenden Matrizes, etc., werden unterschiedliche Prinzipien von Immunoassays angeboten (s.u.). Für den Nachweis von niedermolekularen Substanzen eignen sich kompetitive Immunoassays, wie der hier beschriebene Chloramphenicol ELISA. 1.1 Prinzip des direkt kompetetiven ELISA am Beispiel eines Chloramphenicol ELISA Bei dem direkt kompetitiven ELISA-Verfahren ist eine Mikrotiterplatte mit hochspezifischen Antikörpern auf Chloramphenicol beschichtet. Der Test beruht auf der Konkurrenzreaktion (Kompetition) um die Antikörperstellen auf der Mikrotiterplatte zwischen Chloramphenicol (Standards/Probenlösungen) und einem Enzymkonjugat (an Meerrettich-Peroxidase gebundenes Chloramphenicol). Je mehr Chloramphenicol in Standard/Probenlösungen vorhanden ist, desto weniger Konjugat wird an den Antikörpern gebunden. Nach einem Waschschritt wird ein farbloses Substrat (Farbstoff + Peroxid) zugefügt, das durch Katalyse des Enzymkonjugats zu einem blauen Farbstoff reagiert. Nach Stoppen der Farbreaktion mit Säure schlägt die Farbe von blau nach gelb um und die Farbintensität (Absorption) wird bei 450 nm mit einem ELISA Reader gemessen. Sie ist umgekehrt proportional zu der Chloramphenicol-Konzentration. Die Testdurchführung dauert ohne Probenvorbereitung ca. 90 Minuten. 1.2 Standardkurve und Berechnung der Testergebnisse Die meisten ELISA-Reader verfügen über eine integrierte Software für die Auswertung bzw. sind an einen PC mit entsprechender Software angeschlossen. Gemäß dem Pipettierschema werden die Positionen der Standards (mit Konzentrationen), Proben, etc. eingegeben. Von den Messwerten der Doppelbestimmungen werden die Mittelwerte gebildet. Für die Berechnung der Testergebnisse wird anhand der Standards mit der 4-Parameter Funktion eine Eichkurve erstellt und damit die Konzentrationen der Probenlösungen in ng/ml ermittelt. Falls keine Software zur Verfügung steht, kann die Auswertung auch graphisch mit halblogarithmischen Millimeterpapier erfolgen: Nachdem Beispiel alle Kavitäten gemessen sind, werden aus den Doppelbestimmungen die Mittelwerte errechnet. Die ermittelten Absorptionen der Standards (y- Achse) werden gegen den Logarithmus (log 10 ) der Standard- Konzentrationen in ng/ml aufgetragen (x-achse). Anhand der Punkte wird eine Kurve so gelegt, dass sie durch die Messpunkte geht bzw. am besten die Messpunkte berücksichtigt. Die Messpunkte können auch mit Geraden verbunden werden. Dann können aus dem Diagramm die Konzentrationen der Probenlösungen (ng/ml) abgelesen werden. Wenn durch die Probenvorbereitung ein Verdünnungsfaktor gegeben ist, müssen die ELISA-Messwerte mit diesem Faktor multipliziert werden.

3 2. Erläuterungen von Begriffen, die für das Verständnis von ELISA-Verfahren hilfreich sind Antigene (= Immunogene) Stoffe, die im Wirbeltierorganismus eine Immunantwort, d.h. eine Antikörpersynthese auslösen. Nur relativ große Moleküle (MG > 5000 Dalton) oder z.b. Oberflächenstrukturen von Viren/Bakterien können eine Immunantwort induzieren. Hapten (= inkomplettes Antigen) Sehr kleine Moleküle induzieren zunächst keine Immunantwort, doch sie können trotzdem selektiv von entsprechenden Antikörpern gebunden werden. Damit ein solches Hapten (gr. = anheften) als Antigen für eine Immunisierung fungieren kann, muss es an ein größeres Molekül gebunden werden (z.b. an ein Protein wie BSA). Dazu werden meist analoge Substanzen des Analyten mit einer für die Bindung geeigneten funktionellen Gruppe (z.b. einer Carboxyl-Gruppe, die mit einer Amino-Gruppe des Proteins eine Peptidbindung bildet) synthetisiert. Antikörper (Immunglobuline, Ig) Für ELISA Verfahren benötigt man Antikörper des IgG Typs. IgG Antikörper bestehen aus zwei leichten und zwei schweren Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken zu einer Y-förmigen Struktur verbunden sind. An den Spitzen des Y befindet sich die variable Region für die spezifische Bindung des Antigens über Wasserstoff-Brücken, elektrostatische und Van der Waals Kräfte nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip (Antikörper-Antigen-Komplex). Ein IgG kann demnach zwei Antigene binden. Diese Region wird auch Paratop genannt. Die charakteristische Struktur des Antigens, an der das Paratop andockt, wird als Epitop (oder auch immunogene Determinate) bezeichnet. Je größer das Antigen ist, desto mehr potentielle Epitope sind gegeben. Antikörper sind Syntheseprodukte der aus B-Lymphozyten durch klonale Vermehrung hervorgegangenen Plasmazellen (eine Plasmazelle produziert ca Antikörper/s). Die Bildung von Antikörpern durch das Immunsystem wird durch Antigene (körperfremde Molekülstrukturen) induziert. Die Antikörper werden in verschiedene Hauptklassen unterteilt. Wichtig bei der Antikörpergewinnung für die Entwicklung eines ELISA-Verfahrens ist, dass das Immunsystem sehr rasch weniger spezifische Antikörper der IgM-Typs produziert. Erst nach wenigen Wochen sind die spezifischen Antikörper des IgG-Typs in ausreicht hohem Titer im Blut. Um möglichst viele der gewünschten Antikörper gewinnen zu können, wird dem Tier mehrfach in zeitlichen Abständen das Antigen injiziert. Zur Serumgewinnung lässt man das entnommene Blut 1 h stehen und entfernt den entstandenen Blutkuchen. Nach einigen Stunden wird das Serum dekantiert und zum Entfernen der restlichen Blutzellen zentrifugiert. Das Serum ist bei 80 C jahrelang stabil. Nur ein kleiner Teil der Serumproteine sind Antikörper, wovon nur ein geringer Teil das injizierte Antigen bindet. Das Antiserum kann schon jetzt z.b. für einen Präzipitationstest nach Ouchterlony eingesetzt wird (Voraussetzung für eine Präzipitation sind mindestens zwei Epitope am Analyten). Für die meisten Anwendungen (z.b. ELISA) benötigt man aber aufgereinigte Antikörper, wofür verschiedene Methoden zur Verfügung stehen (z.b. mit Chromatographie-Säulen, die spezifisch IgG Antikörper binden oder Säulen mit dem Antigen, um antigenspezifische Antikörper zu isolieren). Da die Antikörper von verschiedenen Klonen der Plasmazellen produziert wurden, werden sie als polyklonale Antikörper bezeichnet, die eine unterschiedlich starke Affinität zum Antigen/Hapten aufweisen können. Monoklonale Antikörper sind identische Antikörper eines Zellklons von Hybridoma-Zellen (selektierte Plasmazelle aus der Milz mit Krebszelle fusioniert und z.b. in einem Fermenter weiter vermehrt). Rekombinante Antikörper werden mit Hilfe gentechnischer Verfahren hergestellt, die allerdings aufgrund der hohen Kosten bei der Entwicklung und Produktion bei kommerziellen ELISA bislang keine Rolle spielen.

4 Standardkurve Mit den Standardlösungen, deren Konzentrationen den Messbereich abdecken, für den der ELISA entwickelt wurde, wird eine Eichkurve erstellt. Wenn inklusive Nullstandard 6 Standards für die Kalibrierung zur Verfügung stehen, kann mit der 4-Parameter-logistischen Gleichung eine Eichkurve berechnet werden. Wenn z.b. nur mit 3 Standards gearbeitet wird, sollten deren Konzentrationen unbedingt im mittleren, linearen Bereich der Standardkurve liegen. Dann kann eine Eichgerade mit linearer Regression berechnet werden. Was immer geht und auch zu befriedigenden Ergebnissen führt, ist die Punkt-zu-Punkt Kalibrierung. Berechnung der prozentualen B/B 0 -Werte beim direkt kompetitiven ELISA Wenn Kalibrierkurven von verschiedenen Testläufen verglichen oder die Kreuzreaktion eines Antikörpers mit verschiedenen Analyten geprüft werden sollen, ist eine Normierung der Daten von Vorteil. Denn je nach Temperatur bei der Testdurchführung und Alter des ELISA Kits erhält man etwas unterschiedliche Absorptionen bei verschiedenen Testläufen. Da immer Standards und Proben gleichzeitig bei einem Testlauf gemessen werden, haben diese Unterschiede keinen Einfluss auf das Testergebnis. Die Absorption des Nullstandards (Negativkontrolle) resultiert aus der maximalen Belegung der Antikörper mit Enzymkonjugat und wird gleich 100% (B 0 ) gesetzt. Je mehr Analyt sich in den Standards befindet, desto weniger Enzymkonjugat kann gebunden werden. % B/B 0 = Durchschnittlicher OD der Kalibratoren oder Proben Durchschnittlicher OD der Negativ Kontrolle x 100 Kreuzreaktivität Antikörper können neben dem eigentlichen Analyten (Antigen/Hapten) auch Moleküle binden, die ein Epitop mit ähnlicher sterischer Form sowie eine ähnliche Ladungsverteilung aufweisen. Die Kreuzreaktivität, die ein Antikörper auf eine dem Analyten ähnliche Substanz hat, wird durch Vergleich von Kalibrierkurven ermittelt, wobei die Kurve des Analyten als Bezugsgröße (100% Kreuzreaktivität) dient. Meist wird der 50% B/B 0 Punkt für die Bestimmung der Kreuzreaktion verwendet. Bsp.: Ac = Die Konzentration von Substanz A bei 50% B/B 0 (z.b. 5 ng/ml) Bc = Die Konzentration von Substanz B bei 50% B/B 0 (z.b. 7 ng/ml) % Kreuzreaktion von Substanz B = (Ac/Bc) x 100 (= 71%) Je spezifischer ein Antikörper ist, desto weniger Kreuzreaktionen weist er auf. Ein nicht so spezifischer Antikörper kann erwünscht sein, wenn es von Vorteil ist, eine ganze Substanzgruppe (z.b. Aflatoxin B1, B2, G1, G2) oder möglichst viele Verbindungen einer Substanzgruppe mit einem Analysengang zu erfassen. Eine quantitative Aussage zu den Konzentrationen der möglichen verschiedenen Verbindungen in einer Probenlösung ist dann natürlich nicht möglich. Die Spezifität wird in erster Linie durch die Struktur des gewählten Antigens bestimmt. Daher wird oft mit etwas modifizierten Molekülen (Analoge) des eigentlichen Analyten immunisiert, um weitere sinnvolle Kreuzreaktionen zu erzielen. Tracer Der Tracer ist ein markiertes Hapten (bzw. Antigen) oder ein markierter Antikörper, mit dem der Anteil der Antikörper-Bindungsstellen ermittelt wird, der im Falle des kompetetiven Immunoassays nicht durch den Analyten belegt ist. Als Marker werden meist Enzyme ( ELISA) wie Meerrettich- Peroxidase verwendet, die eine Farbreaktion katalysieren. Enzymmarkierte Haptene/Antigene werden Enzymkonjugat genannt. Es gibt aber auch lumineszenz- oder radioaktivmarkierte Tracer ( Lumineszenzimmunoassay LIA bzw. Radioimmunoassay RIA).

5 Substrat und Farbreaktion Für die enzymatisch katalysierte Farbreaktion durch das gebundene Enzymkonjugat wird nach dem Auswaschen der Kavitäten der Mikrotiterplatte (nicht gebundenes Enzymkonjugat würde die Messung verfälschen) Substratlösung zugefügt. Das Substrat besteht aus einem Farbstoff (meist zunächst farbloses 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidin, TMB) und einem Peroxid (meist Wasserstoffperoxid). Peroxid und Farbstoff werden teilweise auch getrennt mit einem ELISA Kit geliefert. Die Lösungen werden entweder vor dem Auftragen auf die Platte gemischt oder nacheinander pipettiert. Durch die Peroxidase des Enzymkonjugats wird Wasserstoffperoxid in OH-Radikale gespalten, welche einer Aminogruppe des TMB ein Elektron entreißen. Das TMB-Radikalkation ist blau gefärbt. Ein gebundenes Enzymkonjugatmolekül bedingt so während der Farbreaktionszeit die Bildung tausender blauer TMB-Radikalkationen. Damit nicht alle TMB Moleküle umgesetzt werden, womit die Absorption der Testlösungen trotz unterschiedlicher Enzymkonjugat-Konzentration in den Kavitäten sich angleichen würde, wird nach einer gewissen Zeit das Enzym mit verdünnter Mineralsäure denaturiert, so dass es nicht mehr katalytisch aktiv ist. Durch die Protonierung der TMB- Radikalkations schlägt die Farbe von blau nach gelb um (Absorptionsmaximum bei 450 nm). Neben TMB sind auch andere Farbstoffe für ELISA-Verfahren geeignet (z.b. ABTS, welches sich grün färbt und nach der Säurezugabe die grüne Farbe behält). 3. ELISA Prinzipien Es hat sich als hilfreich erwiesen, ELISA-Verfahren nach folgenden Prinzipien zu klassifizieren. Im Detail können sich ELISAs eines Grundprinzips aber noch unterscheiden. Kompetitive und nicht-kompetitive ELISA-Verfahren: Bei einem kompetitiven ELISA ist die Konzentration der spezifischen Reagenzien wie Antikörper und Enzymkonjugat limitiert. Dies führt zu einer kompetitiven Situation bei der Bindungsreaktion. Bei einem nicht-kompetitiven ELISA ist nur ein Bestandteil, die Probe/der Standard, in einer limitierten Konzentration vorhanden. Die anderen Reagenzien werden im Überschuß zugesetzt. Ein typisches Beispiel ist der sogenannte Sandwich-ELISA (erster Antikörper Analyt zweiter markierter Antikörper. Eine Voraussetzung für einen nicht-kompetitiven ELISA besteht darin, dass das Antigen mit zumindest zwei Antikörper-Bindungsstellen (Epitope) ausgestattet ist. Niedermolekulare Substanzen haben aber in der Regel nur eine mögliche spezifische Bindungsstelle. Somit sind hierbei in der Regel nur kompetitive ELISAs möglich. Für hochmolekulare Substanzen sind beide Prinzipien möglich. Direkte und indirekte ELISA-Verfahren: Je nachdem, ob das Antigen oder der Antikörper markiert ist, unterscheidet man direkte von indirekten Methoden. Bei einem direkten kompetitiven ELISA konkurrieren freies Antigen (=Analyt) und markiertes Antigen (= Enzymkonjugat) um die begrenzte Anzahl der Antikörper-Bindungsstellen. Die Anzahl der gebundenen Enzymkonjugatmoleküle wird also direkt bestimmt. Bei einem indirekten kompetitiven ELISA liegt ein immobilisiertes Antigen vor (auf Mikrotiterplatte fixiertes Antigen- Konjugat). Dieses tritt nun in Konkurrenz zum Analyten um den Antikörper, der in Lösung vorliegt. Der Antikörper ist in der Regel markiert. Simultane und konsekutive ELISA-Verfahren: Bei einem simultanen ELISA werden Standard/Probe und Enzymkonjugat von Anfang an zusammen inkubiert es erfolgt also nur ein Inkubationsschritt. Bei einem konsekutiven ELISA hat man zwei Inkubationen. Erst wird Standard/Probe aufgetragen und erst deutlich später das Enzymkonjugat. Der konsekutive ELISA ist im strengen Sinn also nicht exakt ein kompetitiver ELISA wegen des first come, first serve Effektes. 4. Literatur Vornorm DIN V , Dez. 1995