Uwe Andag (Autor) Identifizierung und Funktionsanalyse verschiedener Faktoren des retrograden ER-Golgi Transports in Saccharomyces cerevisiae

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1 Uwe Andag (Autor) Identifizierung und Funktionsanalyse verschiedener Faktoren des retrograden ER-Golgi Transports in Saccharomyces cerevisiae Copyright: Cuvillier Verlag, Inhaberin Annette Jentzsch-Cuvillier, Nonnenstieg 8, Göttingen, Germany Telefon: +49 (0) , Website:

2 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Intrazellulärer Vesikeltransport von Proteinen in eukaryotischen Zellen Transport zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi- Apparat Anterograder ER-Golgi Transport Komponenten und Mechanismus der Bildung von COPII-Vesikel Signale für den ER-Export in Frachtmolekülen Retrograder Golgi-ER Transport Komponenten und Mechanismus der Bildung von COPI-Vesikel Signale für den ER-Rückwärtstransport bzw. der ER-Retention Tethering, Docking und Fusion von Vesikeln mit der Zielmembran Funktion von Tethering/Docking -Faktoren SNARE-Proteine vermitteln die Membranfusion SNARE-Proteine der ER-Golgi Recyclingmaschinerie in S. cerevisiae Modulatoren der SNARE-Proteine: die SEC1-Familie und Ypt-Proteine Zielsetzung und Konzept dieser Arbeit Material und Methoden Material Hefe- und Bakterienstämme Verwendete Plasmide Verwendete Oligonukleotide Medienzusätze Enzyme und Kits Chemikalien Verbrauchsmaterialien Antikörper Geräte Methoden zur Herstellung von E. coli- und Hefekulturen Nährmedien für E. coli Anzucht von E. coli-kulturen Nährmedien für Hefekulturen Anzucht von Hefekulturen... 33

3 2.3 Molekularbiologische Methoden DNA-Präparationen Analytische Plasmidisolierung aus E. coli-zellen Präparative Plasmidisolierung aus E. coli-zellen Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration Enzymatische Behandlung von DNA Fragmentierung von Doppelstrang-DNA mit Restriktionsenzymen Behandlung von linearisierter DNA mit alkalischer Phosphatase Auffüllen von 5'-überhängenden DNA-Enden Ligation von DNA-Doppelstrang-Fragmenten Analytische und präparative Agarose-Gelelektrophorese DNA-Isolierung aus präparativen Gelen Transformation von E. coli-zellen Herstellung transformationskompetenter E. coli-zellen (Hitzeschock-Methode) Transformation von E. coli-zellen (Hitzeschock-Methode) Herstellung transformationskompetenter E. coli-zellen (Elektroporation) Transformation von E. coli-zellen (Elektroporation) DNA-Amplifikation mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methoden zur Hefegenetik Klassische Transformation von Hefezellen Plasmidisolation aus S. cerevisiae Kreuzung von Hefezellen Sporulation von Hefezellen Analyse von Hefetetraden Suche von SEC22-abhängigen Hefemutanten ( synthetic lethality screen ) Sektorierungs-Nachweis Mutagenese von Hefezellen mit Ethyl-Methan-Sulfonat Transformation einer cdna-genbank Genomische Fusion eines His 6 /c-myc Epitops Nachweis von sezerniertem α-pheromon durch den Halo -Test Paarungstest Biochemische Methoden Aufschluß von Hefezellen Alkalischer Aufschluß von Hefezellen und TCA-Präzipitation der Proteine... 47

4 Zellaufschluß mit flüssigem Stickstoff im Mörser Zellaufschluß mit Glasperlen Messung der Proteinkonzentration Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen mit Coomassie brilliant blue Silberfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen Transfer von Proteinen auf Nitrozellulose-Filter ( Western Blot -Verfahren) Ponceau S-Färbung von Nitrozellulose-Filtern Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulose-Filtern (Immunoblot-Analyse) Expression von GST-Fusionsproteinen in S. cerevisiae Expression von GST-Fusionsproteinen in E. coli Expression von His 6 -Fusionsproteinen in E. coli Bindungsexperimente mit rekombinanten GST-Fusionsproteinen Epitop-Bestimmung durch peptide SPOT Analyse Bindungsexperimente mit kovalent gekoppelten Peptiden Bestimmung der ARF-GAP Aktivität durch quantitative HPLC GTP-Beladung von Arf1p GAP-Reaktion und HPLC-Analyse Zellbiologische Methoden Trennung von Membran- und zytoplasmatischen Fraktionen Subzelluläre Fraktionierung von Hefekompartimenten mittels Sucrosegradienten Analyse der Invertase-Glykosylierung und Sekretion durch Aktivitätsfärbung Immunpräzipitation von radioaktiv markierten Proteinen aus Zellextrakten ( Pulse-Chase -Experiment) Analyse der BiP/Kar2p-Sekretion von Hefezellen Filtertest TCA-Präzipitation sezernierter Proteine Immunfluoreszenzanalyse von Hefezellen Fixierung von GFP-Fusionsprotein exprimierenden Hefezellen Ergebnisse Identifikation von SEC22-abhängigen Mutanten (synthetic lethality screen)... 66

5 3.2 Genetische Interaktion der dsl1-22 Mutante mit anderen Genen der anterograden und retrograden ER-Golgi Transport-Maschinerie Die dsl1-22 Mutante zeigt nur schwache Defekte im ER-Golgi Vorwärtstransport dsl1-22 Zellen akkumulieren ER-Membranen aber keine Vesikel bei restriktiver Temperatur Der Golgi-ER Rückwärtstransport ist in dsl1-22 Zellen massiv gestört Subzelluläre Verteilung des Dsl1 Proteins Dsl1p interagiert in vitro mit COPI-Hüllproteinen (coatomer) Dsl1p interagiert direkt mit der δ-cop Untereinheit von coatomer Dsl1p bindet δ-cop über eine zentrale saure Domäne Bestätigung der in vitro Beobachtungen durch das Two-Hybrid-System Die dsl1 W413AW455A Mutante ist nicht lebensfähig Die W413A und W455A Einzelmutationen im Dsl1p führen nur zu schwachen in vivo Defekten Dsl1p bindet an eine zentrale Region von geringer struktureller Komplexität im δ-cop Der N-terminale Bereich des Dsl1p bindet Tip20p Die δ-cop Bindungsdomäne kommt nur in den Pilz-Homologen des Dsl1p vor Die Rolle von ARF-GAP Proteinen bei der Sortierung von Frachtmolekülen während der COPI-Vesikel Bildung ARF-GAP Proteine haben eine wichtige Funktion bei der Rekrutierung von ΔN17Arf1p an GST-SNAREs Die Rekrutierung von His 6 -ΔN17Arf1p ist unabhängig von seiner Aktivierung Diskussion Isolierung und Charakterisierung des DSL DSL1: Genetische Analysen weisen auf eine Funktion im retrograden Golgi-ER Transport hin dsl1-22 Mutanten zeigen starke Defekte bei der Rückhaltung von Proteinen im ER Dsl1p: Nur ein ER-Protein oder mehr? Dsl1p interagiert direkt mit der coatomer-untereinheit δ-cop WxW - und WxxxW -Motive: besitzen diese unterschiedliche Funktionen bei der Bindung von δ-cop?

6 Die funktionelle Bedeutung der Dsl1p/δ-COP Interaktion Dsl1p-ein zentraler Faktor des denkbaren Tethering-Komplexes am ER? ARF-GAP Proteine und die Aufnahme von SNARE-Proteinen in COPI-Vesikel Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis Anhang Publikationsliste Danksagungen Lebenslauf