Die Affinitätschromatographie

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1 Saubere Lösungen Wasser zur Aufreinigung von Glutathion-S-transferase (GST) mittels Affinitätschromatographie J. Erwig und E. Herbig Die Affinitätschromatographie ist ein Verfahren zur Isolation von Proteinen aus Lösungen. Das Grundprinzip (1) wird schon seit längerer Zeit in Laboren angewandt. Durch Verwendung von Fast Protein Liquid Chromatography-Systemen (FPLC) kann eine hohe Reinheit und Menge der Zielproteine erreicht werden. Arabidopsis thaliana Dawid Skalec 2 GIT Labor-Fachzeitschrift 5/2015 Chromatographie

2 Im Rahmen der Arbeiten zur Funktionsbestimmung von Proteinen, welche in der Pflanze-Pathogen-Interaktion (Arabidopsis thaliana) eine Rolle spielen, werden in dieser Arbeit Versuche zur Aufreinigung des Proteins Glutathion-S-transferase (GST) beschrieben. GST wird als so genannter Anhang (Tag) an Proteine gefügt, um diese dann mittels Affinitätschromatographie aufzureinigen. GSTs spielen eine wichtige Rolle bei der Entgiftung externer organischer Stoffe (sogenannter Xenobiotika). Detailiertere Angaben zur Funktion und Regulation von GSTs in Pflanzen siehe (2). Bei der Aufreinigung dieses Proteins kommt es besonders auf Sauberkeit aller verwendeten Substanzen an. Daher ist es nötig alle Chemikalien und Lösungen in Reinstwasser anzusetzen. Grundlage der Affinitätschromatographie Abb. 1: Der gesamte Zellextrakt, welcher das gewünschte rekombinante Protein enthält, wird auf die entprechende Säule gegeben. Unspezifisch gebundene Proteine werden ausgewaschen und das spezifisch gebundene Protein mit reduziertem Glutathion eluiert. (Zeichnung Jan Erwig in Anlehnung an Bende 1974 (1)). Für die Aufreinigung fügt man mit molekularbiologischen Methoden (u. A. Klonierung und Transformation) einen zusätzlichen Anhang an das Zielprotein an, wodurch ein rekombinantes Protein entsteht. Das Ziel der Affinitätschromatographie ist es, eine möglichst große Menge des rekombinanten Proteins aufzureinigen. Das jeweilige Genkonstrukt wird dafür vorher häufig in bakterielle Systeme eingebracht (kloniert) und dort überexprimiert. Als Wirtsorganismus bedient man sich meist dem Bakterium Escherichia coli, doch auch Bacillus-Stämme oder nicht-bakterielle Systeme wie Hefen, Insekten-, Säugetiere oder Pflanzenzellen finden hierbei Anwendung (3). Die Aufreinigung beruht auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen zwei Reaktionspartnern. Ein Reaktionspartner ist der Protein-Tag, der andere ist ein kovalent an einer Matrix gebundener Ligand oder Antikörper. An diesen Liganden bindet das rekombinante Protein (bzw. der Tag) spezifisch. Nach dem Auswaschen unspezifischer Proteine kann das rekombinante Zielprotein durch einen Kompetitor spezifisch eluiert werden (beispielhaft siehe Abb. 1). Die Wahl der Säulenmatrix ist hierbei abhängig von dem gewählten Protein-Tag. Dieser sollte verschiedene Anforderungen, wie etwa hohe Spezifität zur Matrix, einfache Nachweisbarkeit, Elution mit niedermolekularen Substanzen und die Möglichkeit zu N- wie C-terminalen Fusionsproteinen erfüllen. Darüber hinaus sollten die Tags möglichst keinen Einfluss auf die Teriärstruktur haben und die biologische Aktivität des Proteins nicht beinflussen (4). Bei dem hier gezeigten Beispiel wird die Glutathion-S-transferase (GST), über eine Glutathion-haltige Matrix aus einem Zellextrakt aufgereinigt. GST hat eine Größe von etwa 26 kda und ist damit um ein Vielfaches größer als, zum Beispiel, ein Polyhistidin-Tag (1 kda). Die Vorteile größerer Protein-Tags sind potenziell bessere Löslichkeit des rekombinanten Proteins und eine spezifischere Aufreinigung. Viele kürzere Polypeptid-Tags werden über Matrices aufgereinigt, an die unspezifische Proteine in geringem Maß binden können. Damit ist die aufgereinigte Fraktion weniger rein, verglichen mit beispielsweise dem GST-Tag. Die Elu- tion der gebundenen rekombinanten Proteine wird meistens durch kompetitive Bindung von freiem Liganden oder aber durch Änderung des ph-wertes oder der Salzkonzentration erreicht. Im vorliegenden Beispiel wird die Aufreinigung der GST via Protein Liquid Chromatography gezeigt. Durch den komplexen Aufbau des Systems ist genaues und vor allem sauberes Arbeiten und reinste Materialien inkl. Wasser unerlässlich. So könnten z. B. schwankende ph Werte und wechselnde Salzkonzentrationen sich auf das Bindungs- und Eluierungsverhalten auswirken und damit die Ergebnisse verfälscht werden. Die gebundene GST wird mit reduziertem Glutathion von der Säule eluiert und in unterschiedlichen Fraktionen aufgefangen. Diese Fraktionen werden anschließend auf ihre Reinheit untersucht. Materialien und Methoden Für die Aufreinigung wurde eine Flüssigkultur mit E. coli TOP10 Zellen, die mit dem pgex4t1 Expressionvektor transformiert wurden, beimpft und bis zu einer OD 600 ~0.6 Chromatographie GIT Labor-Fachzeitschrift 5/2015 3

3 heranwachsen gelassen. Der Induktor (IPTG) wurde mit einer Endkonzentration von 0,2 mm zugegeben und die Kultur anschließend für 4 Stunden bei 28 C weitergeschüttelt. Vor und nach der Induktion wurden je 1 ml Kultur als Kontrolle genommen. Die Flüssigkultur wurde dann zentrifugiert und das Pellet in kaltem PBS-Puffer, der PMSF und Lysozym enthielt, resuspendiert und lysiert. Das Zelllysat wurde dann bei x g zentrifugiert. Nach jedem Schritt wurden Kontroll-Proben genommen. Der Überstand wurde überführt und in einem Ultraschallbad entgast. Die Aufreinigung wurde in einem Affinitätschromatographiesystem durchgeführt und ausgewertet. Da das System auch die UV Absorption der Probe während der Aufreinigung misst, kann das Zielprotein durch einen Anstieg der UV Absorption bei der Elution mit reduziertem Glutathion identifiziert werden. Das aufgereinigte Protein wurde in 200 µl Fraktionen gesammelt. Für die weitere Analyse mittels SDS-PAGE wurden 20 µl von einzelnen oder zwei gepoolten Peakfraktionen mit 4 x SDS-Ladepuffer gemischt und auf ein 10%iges Polyacrylamidgel geladen. Das Gel wurde dann mit colloidalem Coomassie gefärbt (vgl. 5). Alle Puffer, Lösungen und Medien wurden für die Versuche mit Reinstwasser aus einem Arium pro System (Sartorius) angesetzt (detaillierte Beschreibung des Systems siehe Seite 52). Ergebnisse Um die Expression des Zielproteins zu untersuchen, wurden uninduzierte und induzierte E.coli-Zellen direkt in SDS aufgeschlossen und mittels SDS-PAGE in einem 10% Polyacrylamidgel aufgetrennt (siehe Abb. 2). GST hat eine molekulare Masse von etwa 26 kda. Die induzierten Zellen zeigen hier eine eindeutige größere Menge eines Proteins in derselben Größe (vgl. Abb. 2: *). Die induzierten Abb. 2: SDS-Page eines 10%igen Acrylamidgels auf dem der totale SDS- Zellextrakt der uninduzierten (-) und induzierten (+) E. coli Zellen aufgetragen wurde. Colloidal Coomassie-Blau gefärbtes Gel. GST durch * gekennzeichnet Abb. 3: Flussverlaufsdiagramm der Affinitätschromatographie. Das Chromatogramm erlaubt eine direkte Analyse der einzelnen Parameter. UV Absorption (blau), Konzentration des Elutionspuffers (grün) sowie der Start der Ladung der Probe auf die Säule sind eingezeichnet. Elutionspeak markiert durch *. Zellen wurden dann lysiert und das Zelllysat in unlösliche und lösliche Fraktionen mittels Zentrifugation getrennt (siehe Abb. 4). Die Aufreinigung eines Proteins mittels Affinitätschromatographie setzt voraus, dass das aufzureinigende Protein in wässriger Phase löslich ist. Die Löslichkeit der GST wurde durch SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung bestätigt (Abb.4). Die lösliche Proteinfraktion wurde für die Affinitätschromatographie benutzt. Durch die Software ist die Verfolgung der Aufreinigung in Echtzeit möglich (Chromatogramm Abb. 3). Die Beladung der Säule mit der Proteinprobe verursacht einen Anstieg der UV- Absorbtion (vgl. Abb. 3 blaue Linie). Nach erfolgter Ladung sinkt folglich der UV Wert. GST ist im ersten Drittel der Elutionsfraktionen als eindeutiger Peak in der UV-Absorption zu erkennen ( Abb. 3 Stern). Nach der Aufreinigung wurden die jeweiligen Fraktionen bezogen auf ihren Proteingehalt und Reinheit mittels SDS-PAGE untersucht. Geladen wurden die jeweiligen Kontrollen (totaler Zellextrakt, Zellextrakt nach Lyse, Überstand und ungebundene Proteine), sowie Fraktionen innerhalb (A7-B7) und außerhalb (A4 und C4) des UV-Peaks. Es ist zu sehen, dass die Peakfraktionen das Zielprotein in hoher Menge und Reinheit enthalten (Abb.4). Im Vergleich mit den Kontrollen ist eine eindeutige Proteinbande bei 26 kda zu erkennen, die in den Peakfraktionen A11-B12 den höchsten Proteingehalt aufweist. Gleichzeitig ist im Vergleich des eingesetzten Überstandes und dem ungebundenen Proteingehalt zu sehen, dass die exprimierte und lösliche GST nahezu vollständig aufgereinigt werden konnte. Fazit Aufreinigung und Isolation spezifischer Proteine und die anschließende biochemische Analyse dieser ist eine wichtige Methode um die Funktion der Proteine besser verstehen zu können. Die Ergebnisse belegen, dass das gesuchte Protein eindeutig als differenzierbare Bande isoliert werden konnte. Eine solche distinkte Auftrennung lässt sich nur durch absolut saubere Lösungen erzielen. Als Grundlage der eingesetzten Lösungen diente Reinstwasser, dass problemlos für die Versuchsdurchführung verwendet werden konnte, weil es sich durch seine gleichbleibende hohe Qualität bezüglich aller geforderten Werte wie z.b. Leitfähigkeit, TOC, Salzgehalt auszeichnet. Die Identifizierung über Gelektrophorese zeigte keine störenden Schlieren, schlechte Fokussierung oder unspezifische Proteinbanden, wie es bei Anwesenheit von Salzen oder geladenen organischen Partikeln in den Lösungen geschehen kann (6). Um reproduzierbare verlässliche Gelauswertungen zu bekommen, muss auf saubere Puffer und Färbelösungen geachtet werden. Da die hier beschriebene Versuchsdurchführung über Anzucht der Bakterien, Herstellung der Lösungen bis hin zu den Chromatographie-Läufen und abschließender Gelelektrophorese arbeitsintensive, kostspielige und zeitaufwendige Arbeiten sind, schließt sich eine Verwendung von unsauberem Wasser/ Chemikalien von vornherein aus. Ein direkter Vergleich unterschiedlicher Reinstwasserqualitäten konnte daher aus diesen Gründen nicht durchgeführt werden. 4 GIT Labor-Fachzeitschrift 5/2015 Chromatographie

4 Abb. 4: Colloidal Coomassie gefärbtes 10% SDS-PAGE Gel welches die aufgereinigte GST in Nichtpeak- und Peakfraktionen zeigt. Kontrollen: Totaler Zellextrakt, nicht löslicher Teil nach Zelllyse (Zellextrakt nach Lyse), löslicher Teil der eingesetzt wurde für die Chromatographie (Überstand) und ungebundene Proteine. Das frisch aufbereitete Reinstwasser soll nach (6) auch zu erhöhter Anzahl und besserer Verteilung von Proteinspots in einem 2D-Gel im Vergleich zu Flaschenwasser führen. Danksagung Ein besonderer Dank der Autoren gilt Herrn Prof. Dr. Volker Lipka für die wissenschaftliche Betreuung der Arbeit sowie Frau Dr. Elena Petutschnig (beide Schwann-Schleiden Forschungszentrum für Molekulare Zellbiologie, Abteilung Zellbiologie der Pflanze, Georg-August Universität Göttingen) für die Durchsicht des Manuskriptes sowie für die konstruktive Diskussion zum Thema. Literatur [1] Bende, Heinz: Affinitäts-Chromatograpie, Chemie in unserer Zeit, 8. Jahrgang, Nr. 1 (1974) [2] Marrs, Kathleen A.: The Functions and Regulation of Glutathione S-Transferases in Plants, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47: (1996) [3] Terpe, K.: Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commerical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: , (2006) [4] Terpe, Kay: Protein-Affinitäts- Tags, BIOspektrum , 13. Jahrgang (2007) [5] Dyballa, N.; Metzger, S.: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. JoVE. 30, (2009). com/details.php?id=1431, doi: /1431 [6] Tarun, M.; Mabic, S. und Schrader, M.: Auf die Reinheit kommt es an Laborwasserqualität beeinflusst die Proteinauftrennung, Laborpraxis Seiten 48-50, Okt. (2011) KONTAKT Jan Erwig, M.Sc. Schwann-Schleiden Forschungszentrum für Molekulare Zellbiologie Abteilung Zellbiologie der Pflanze, Georg-August Universität Göttingen Dr. Elmar Herbig Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG Göttingen Mehr Informationen: Affinitätschromatographie Webcast zum Thema unter Proteinreinigung Chromatographie GIT Labor-Fachzeitschrift 5/2015 5

5 Marktplatz Reinstwassersystem arium pro DI Das arium pro DI Reinstwassersystem (Abb. 1) wurde zur Herstellung von Reinstwasser aus vorbehandeltem Trinkwasser konzipiert und entfernt aus diesem noch vorhandene Verunreinigungen. Die Reinstwasserproduktion erfordert kontinuierliche Rezirkulation und einen konstanten Wasserfluss, was durch ein Pumpensystem mit Druckregelung erreicht wird. Die Leitfähigkeit des Wassers wird am Speisewasser-Einlass und beim Produktwasser (Wasser- Auslass) gemessen. Das arium pro DI System arbeitet mit zwei unterschiedlichen Kartuschen. Diese sind mit einem speziellen Aktivkohle-Adsorber und Mischbett-Ionenaustauscherharzen gefüllt, um hochreines Wasser bezüglich organischer und anorganischer Ionen (z.b. Salze) zu liefern. Ein 0,2 µm Endfilter ist am Wasserauslass installiert und dient der Entfernung von Partikeln und Bakterien aus dem erzeugten Reinstwasser während der Dosierung. Der Prozess der gerätspezifischen Wasserreinigung, ist in Abbildung 2 (Flussdiagramm arium pro DI) dargestellt. Abb. 1: Reinstwassersystem arium pro DI (Foto: Sartorius) Abb. 2: Schematische Darstellung des Flussdiagramms beim Reinstwassersystem arium pro DI. Zur besseren Übersichtlichkeit sind die Ventile und deren Steuerung weggelassen. KONTAKT Sartorius AG Göttingen, Deutschland info@sartorius.com 52 GIT Labor-Fachzeitschrift 5/2015 Anzeige