Testanleitung Quantitative Bestimmung der fäkalen Elastase 1 vom Hund. Instruction Manual Quantitative Determination of Canine Faecal Elastase 1

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1 Testanleitung Quantitative Bestimmung der fäkalen Elastase 1 vom Hund Instruction Manual Quantitative Determination of Canine Faecal Elastase 1 ScheBo Elastase 1 - Canine Bestell-Nr./Catalog No.: 09 In vitro Diagnostikum 96 For in vitro diagnostic use only Entwickelt und hergestellt von / Developed and manufactured by, Netanyastr. 3, Giessen, Germany Phone +49-(0) Fax +49-(0) (January 2011) gültig ab Charge 18 / valid from lot 18 onwards

2 Inhaltsverzeichnis 1 Einführung Pathobiochemie Vorteile Sensitivität und Spezifität Testprinzip Empfindlichkeit Präzision Störfaktoren Zusammensetzung des Testkits Probenmaterial und Probenhaltbarkeit Aufbewahrung und Haltbarkeit des Testkits Erforderliche Geräte und Hilfsmittel Vorsichtsmaßnahmen Hinweise für eine optimale Testdurchführung Ihr Ansprechpartner für Rückfragen Testdurchführung Vorbereitungen Herstellung des Proben-/Waschpuffers Vorbereitung der ELISA-Platte Vorbereitung der Stuhlproben Abarbeiten mit ScheBo E1 Quick-Prep - Canine Abarbeitung mit der Einwiegemethode Durchführung Inkubation von Proben und Standards Inkubation mit dem 2. Antikörper (anti E1-bio) Inkubation mit POD-Streptavidin Farbreaktion Abstoppen der Farbreaktion Messung Quantitative Auswertung Manuelle Auswertung Auswertung mittels ELISA - Software Referenzkonzentration für die canine fäkale Elastase Literatur Kurzanleitung...Rückseite Quick-Prep TM ist ein eingetragenes Warenzeichen der ScheBo Biotech AG, Deutschland

3 Table of Contents 1 Introduction Pathobiochemistry Advantages Sensitivity and specificity Basic principle of the assay Detection limit Precision Interferences Reagents Sample material and sample stability Storage and stability of the test kit Additional utensils required Precautions Recommendations for optimal test performance Contact details Test procedure Preparation Preparation of sample/washing buffer Preparation of ELISA plate Preparation of stool specimen Performance with ScheBo E1 Quick-Prep - Canine Performance with the weighing method Assay procedure Incubation of samples and standards Incubation with the second antibody (anti E1-bio) Incubation with POD-Streptavidin Color reaction Stopping the color reaction Measurement Quantification of results Manual evaluation Evaluation by ELISA - Software Reference concentration for canine pancreatic elastase References Short protocol... Back Page Quick-Prep TM is a registered trademark of ScheBo Biotech AG, Germany

4 4 1 Einführung Canine Elastase 1 im Faeces 1.1 Pathobiochemie Hunde besitzen eine zur humanen pankreatischen Elastase 1 homologe pankreatische Elastase (Eim 1998, Spillmann et al. 1998a). Die canine pankreatische Elastase 1 (E1) übersteht die Darmpassage unbeschadet und kann im Faeces als Protein quantifiziert werden (Spillmann et al. 1998b). Die Konzentration im Faeces des Hundes spiegelt die exokrine Pankreasfunktion wider. 1.2 Vorteile Zur Verbesserung der Diagnostik der exokrinen Pankreasinsuffizienz beim Hund wurde ein speziesspezifischer Enzymimmunoassay (ELISA) entwickelt, mit dem die canine pankreatische Elastase 1 im Hundekot quantifiziert werden kann (Eim 1998). In der Humanmedizin hat sich die Quantifizierung der pankreatischen Elastase 1 im Stuhl als nicht-invasiver Pankreasfunktionstest zur Diagnostik einer exokrinen Pankreasinsuffizienz mit einer Sensitivität und Spezifität von jeweils 93% durchgesetzt. Seine Resultate korrelieren in hohem Maße mit den Ergebnissen des in der Humanmedizin als Goldstandard angesehenen invasiven Sekretin- Pankreozymin-Tests (Scheefers-Borchel et al. 1992, Löser et al a und b, Stein et al. 1996, 1997). Obwohl die exokrine Pankreasinsuffizienz auch beim Hund eine der häufigsten Ursachen einer Maldigestion ist (Strombeck und Guildford 1993), existierte bisher kein indirekter Pankreasfunktionstest, mit dem einfach, kostengünstig und zuverlässig Pankreasfunktionsstörungen zu erkennen sind. Die etablierten Parameter wie Chymotrypsinaktivität im Faeces (Reusch 1986) sowie Digestionstests (Bunch 1992, Williams 1992, Spillmann 1996) (z.b. Fettbelastungstest, BT-PABA-Test) und der Ceruletid-Test (Spillmann 1994) weisen individuelle Schwächen auf. Je nach Testmethode sind falsch-pathologische bzw. falschphysiologische Resultate möglich (Spillmann 1996). Deshalb müssen diese Tests häufig in Kombination eingesetzt werden. Aus Kosten- und Zeitgründen ist dies jedoch nicht immer möglich. Bisher ermöglichte lediglich die Ermittlung der caninen trypsin-like immunoreactivity (ctli) im Serum bei pathologisch erniedrigten Werten einen eindeutigen Nachweis einer Pankreasatrophie (Williams 1987 und 1988). Eine exokrine Pankreasinsuffizienz infolge einer Obstruktion der Pankreasgänge wird jedoch nicht erfasst (Williams 1987). Auch können Entzündungen (chronische Pankreatitis) der von einer Atrophie nicht erfassten Pankreasabschnitte zu einer Erhöhung der ctli-serumkonzentration führen und so der atrophiebedingten Absenkung der ctli-konzentration entgegenwirken, wodurch falsch normale Werte resultieren können (Williams 1987). Ein weiterer entscheidender Nachteil des ctli-tests ist jedoch, dass es sich um einen Radioimmunoassay (RIA) handelt.

5 Canine Elastase 1 im Faeces 5 Im Vergleich zu den gebräuchlichen Parametern der Pankreasfunktionsdiagnostik beim Hund bietet die quantitative Bestimmung der caninen pankreatischen Elastase 1 entscheidende Vorteile: Der Test ist nicht radioaktiv. Ein Isotopenlabor ist nicht erforderlich. E1 ist absolut pankreasspezifisch. E1 ist darmstabil, d.h. die Konzentration der E1 im Faeces spiegelt in idealer Weise die Sekretionsleistung des Pankreas wider (Diagnose oder Ausschluß einer Pankreasinsuffizienz). Eine Substitutionstherapie hat keinen Einfluß auf das Testergebnis. Die im Test verwendeten monoklonalen Antikörper erkennen tierart-spezifisch ausschliesslich E1 des Hundes. Eine Kreuzreaktion mit den in Substitutionspräparaten enthaltenen Elastasen aus Schwein und Rind wurde nicht gefunden. Eine besondere Vorbereitung der Patienten wie die Unterbrechung einer Substitutionstherapie bei der Chymotrypsinaktivitätsmessung oder ein 12-stündiges Fasten wie vor der TLI-Bestimmung ist nicht erforderlich. 1.3 Sensitivität und Spezifität Spillmann et al. (2000) ermittelten bei einer Referenzkonzentration von < 10 μg/g Faeces und einer Einfachbestimmung der caninen Elastase 1 eine Senitivität von 95% (eine Sensitivität von 97% wurde bei der Bestimmung der caninen Elastase 1 an drei aufeinanderfolgenden Tagen gefunden) bei einer Spezifität von 92% für eine hochgradige exokrine Pankreasinsuffizienz. Als Kontrollgruppe wurden gesunde Patienten und solche mit chronischer Enteropathie herangezogen. Werte aus dem Bereich μg/g Faeces sind fraglich (Graubereich) und weisen möglicherweise auf eine beginnende exokrine Pankreasinsuffizienz hin. Die Messung muss daher mit einer neuen Probe wiederholt werden (s ). Werte > 40 μg/g Faeces sind normal. Der Test reicht an den derzeitigen Goldstandard in der Veterinärmedizin, die ctli- Bestimmung, heran (Spillmann et al. 1998b). 1.4 Testprinzip Die ELISA-Platte ist mit einem monoklonalen Antikörper, der nur canine pankreatische Elastase 1 erkennt, beschichtet. Elastase 1 aus Proben bzw. Standards wird durch Bindung am Antikörper immobilisiert. Anschließend erfolgt eine Inkubation mit einem zweiten monoklonalen Antikörper gegen die canine Elastase 1. Dieser Antikörper ist mit Biotin markiert und reagiert in der nächsten Inkubation mit dem Konjugat von POD (Peroxidase) und Streptavidin. Die Peroxidase ihrerseits ist in der Lage, das Substrat TMB (3,3 5,5 -Tetramethylbenzidin) zu oxidieren. Oxidiertes TMB wird anschließend photometrisch bestimmt.

6 6 Canine Elastase 1 im Faeces 1.5 Empfindlichkeit Das Testkit erlaubt die Bestimmung der caninen pankreatischen Elastase 1 im Messbereich von 3 bis 180 μg E1/g Faeces. Werte unterhalb des niedrigsten Standards sollten als < 3 μg E1/g Faeces angegeben werden. 1.6 Präzision Die Intraassay-Varianz wurde durch zwanzigfache Bestimmung von vier Patientenproben ( μg E1/g Faeces) ermittelt. Der mittlere Variationsko-effizient (VK) lag bei 7,2 % (6,3-7,9%). Die Interassay-Varianz wurde anhand von fünf Patientenproben ( μg E1/g Faeces), die an zehn verschiedenen Tagen bestimmt wurden, berechnet. Der VK lag bei 7,6% (4,1-11,0%). 1.7 Störfaktoren Sehr wässrige Kotproben können aufgrund des Verdünnungseffektes zu verminderten Elastase 1-Konzentrationen führen. Es empfiehlt sich daher, die Konsistenz von sehr wässrigen Patientenproben zu notieren und bei pathologischen Konzentrationen (< 40 μg E1/g Faeces) eine geformte Patientenprobe anzufordern. Andere Störfaktoren sind nicht bekannt. Insbesondere beeinflußt die Einnahme von Substitutionspräparaten die canine Elastase 1-Bestimmung nicht. 2 Zusammensetzung des Testkits ELISA-Streifen mit jeweils 8 Vertiefungen, die mit einem monoklonalen Antikörper gegen canine pankreatische Elastase 1 (E1) beschichtet sind. 96 Vertiefungen 2. Proben-/Waschpuffer (5x) (schwarzer Deckel), 100 ml Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, ph 7,2 mit Detergenz 3. E1 Standards 1 bis 4, gebrauchsfertig (rote Deckel), je 700 μl canine pankreatische Elastase 1 in wässriger Lösung mit Natriumazid 4. Kontrolle, gebrauchsfertig (gelber Deckel), 700 μl canine pankreatische Elastase 1 in wässriger Lösung mit Natriumazid 5. Zweiter monoklonaler anti E1-Antikörper biotinyliert (anti E1-bio) (violetter Deckel), 150 μl in wässriger Lösung mit Natriumazid 6. POD-Streptavidin, gebrauchsfertig, lichtempfindlich (schwarze Plastikflasche, schwarzer Deckel), 8 ml in wässriger Lösung 7. Substratlösung, gebrauchsfertig, lichtempfindlich (schwarze Plastikflasche, roter Deckel), 12 ml TMB in wässriger Lösung 8. Stopplösung, gebrauchsfertig (Plastikflasche, weißer Deckel), 12 ml wässrige saure Lösung

7 Canine Elastase 1 im Faeces 7 9. Druckverschlussbeutel mit Trockenmittel für unbenutzte ELISA-Teststreifen 3 Probenmaterial und Probenhaltbarkeit Der E1-ELISA dient der quantitativen Bestimmung der caninen pankreatischen Elastase 1 im Hundekot (eine erbsengroße geformte Probe genügt). Dabei werden die Patientenproben vor der ELISA-Bestimmung extrahiert und verdünnt. Die Haltbarkeit der Faecesproben beträgt 3 Tage bei 4-8 C und 1 Jahr bei -20 C. Die Faecesextrakte können 1 Tag bei 4-8 C aufbewahrt werden. Für andere Probenmaterialen liegen keine Leistungsmerkmale vor. 4 Aufbewahrung und Haltbarkeit des Testkits Alle Komponenten des Testkits sind bei 4-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Nach Ablauf der Haltbarkeit darf das Testkit nicht mehr verwendet werden. Unbenutzte ELISA-Teststreifen müssen mit Trockenmittel im Druckverschlußbeutel festverschlossen gelagert werden. 5 Erforderliche Geräte und Hilfsmittel Einwegröhrchen mit Stopfen zur Probenverdünnung (3 ml, 10 ml und 12 ml) Meßzylinder (500 ml) Vortex-Mixer verstellbare Präzisionspipetten für 0-50 μl, μl und μl 2 ml, 5 ml und 10 ml Pipetten verstellbare 8-Kanal-Pipette μl Mikroplattenreader mit 450 nm Filter (Referenzfilter: 620 nm). 6 Vorsichtsmaßnahmen Nur als in vitro-diagnostikum verwenden. Extraktionspuffer, Standards, Kontrolle und anti E1-bio enthalten als Konservierungsmittel Natriumazid. In der Substratlösung ist TMB und Kathon CG als Konservierungsmittel enthalten. Bitte Sicherheitsvorschriften beachten. Berührung mit der Haut vermeiden. Nicht mit dem Mund pipettieren. Während der Testdurchführung Einmal-Handschuhe tragen. Sicherheitsdatenblätter können angefordert werden. Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen dürfen nicht verwendet werden. Eine Vermischung von Materialien und Reagenzien aus caninen Elastase 1-Testkits und Kits zur Bestimmung der humanen pankreatischen Elastase 1 ist ebenfalls nicht möglich.

8 8 7 Hinweise für eine optimale Testdurchführung Canine Elastase 1 im Faeces 1. Genaueste Einhaltung der Testanleitung. 2. Alle Bestandteile des Testkits müssen bis zu ihrer Verwendung bei 4-8 C gelagert und kurz vor Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht werden. 3. Alle flüssigen Testkit-Bestandteile sind vor Benutzung gut zu mischen. Eventuell vorhandene Flüssigkeitsreste im Deckel entfernen (Aufklopfen auf den Labortisch). 4. Das Berühren der ELISA-Platte am Boden ist zu vermeiden. 5. Das Abarbeiten der ELISA-Platte sollte stets in gleicher Reihenfolge und im gleichen Zeitintervall erfolgen. 6. Um Kontaminationen zu vermeiden, sind für jeden Pipettierschritt saubere Pipettenspitzen und Pipettierwannen zu verwenden. Beachten Sie bitte, daß bei Pipettierungen mit der 8-Kanal-Pipette immer dieselben Pipettierwannen für ein und dasselbe Reagenz (wie z.b. anti E1-bio oder POD-Streptavidin) benutzt werden. 7. Pipettieren Alle Reagenzien und Proben sollten im unteren Drittel der Vertiefung pipettiert werden. Beim Waschen Pipettenspitzen stets am oberen Rand der Vertiefung ansetzen. 8. Waschen Vor jedem Waschschritt ELISA-Platte gut ausschütten und kräftig trocken klopfen, so daß keine Flüssigkeitsreste zurückbleiben. Stets saubere Papierhandtücher zum Ausklopfen verwenden. Darauf achten, daß keine Flüssigkeitsreste zurücklaufen oder in andere Vertiefungen gelangen. Waschlösung bei jedem Waschschritt mind. 1-2 Minuten einwirken lassen. 9. Messen Platte vor jeder Messung gut schütteln, so daß keine Farbschlieren mehr vorhanden sind. Evtl. Luftblasen mit sauberer Kanüle entfernen. Mindestens 5 Minuten nach dem Stoppen bis zur Messung warten.

9 Canine Elastase 1 im Faeces Ihr Ansprechpartner für Rückfragen Dr. Karin Decker ScheBo Biotech AG Netanyastr. 3, Giessen Tel: , Fax: schebo@schebo.com 8 Testdurchführung 8.1 Vorbereitungen Herstellung des Proben-/Waschpuffers 100 ml Proben-/Waschpuffer 5x (schwarzer Deckel) ml H 2 O bidest. Der verdünnte Proben-/Waschpuffer ist 6 Monate bei 4-8 C stabil Vorbereitung der ELISA-Platte Eingeschweißte ELISA-Platte (Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen) vor dem Öffnen der Folie auf Raumtemperatur kommen lassen. Gewünschte Anzahl der beschichteten ELISA-Streifen in der Mikrotiterplattenhalterung belassen. Unbenutzte ELISA-Teststreifen müssen mit Trockenmittel im festverschlossenen Druckverschlussbeutel gelagert werden Vorbereitung der Stuhlproben ScheBo E1 Quick-Prep - Canine Probenvorbereitungssystem (Best.-Nr. 09- Quick) - bevorzugte Methode - (siehe ) alternativ kann mit der Einwiegemethode: Stuhlproben werden eingewogen (siehe ) gearbeitet werden Abarbeitung mit dem ScheBo E1 Quick-Prep - Canine Der gebrauchsfertige Extraktionspuffer ist bereits im Röhrchen des ScheBo E1 Quick-Prep - Canine-Probenvorbereitungssystems enthalten! Haltbarkeit siehe Packungsaufdruck. ScheBo E1 Quick-Prep - Canine (Best.-Nr. 09-Quick) wird gemäß Abb. 1 (Seite10) benutzt. Verdünnung der Stuhlprobenextrakte (ScheBo E1 Quick-Prep - Canine) Herstellung der 1: 8 Verdünnung (wie in Abb. 1, Seite 10, Schritt 11 beschrieben): 50 μl Stuhlprobenextrakt μl Proben-/Waschpuffer 1x Achtung: Die Verdünnung der Probenextrakte immer erst am Testtag durchführen!

10 10 Canine Elastase 1 im Faeces 4. Gelbe Dosierspitze herausziehen 11. Nach Absetzen der Partikel wird aus dem Röhrchen das Stuhlprobenextrakt 1:8 verdünnt: 50 μl Stuhlprobenextrakt μl Proben-/Waschpuffer 1x. Die weitere Testdurchführung erfolgt gemäß Testanleitung (siehe 8.2, S. 12). Dosierspitze Stuhlextraktion mit E1 Quick-Prep TM -Canine 3. Mit der gelben Dosierspitze ca. 1 cm tief in die Stuhlprobe stechen (alle Einkerbungen müssen mit Stuhl gefüllt sein) 2. Gelbe Dosierspitze herausziehen 1. Gelbe Dosierspitze nach links drehen Blauer Konuseinsatz Blauer Konuseinsatz Dosierspitze Blauer Konuseinsatz Röhrchen Röhrchen Röhrchen Extraktionspuffer 10. Blauen Konuseinsatz zusammen mit der gelben Dosierspitze aus dem Röhrchen ziehen 9. Blauen Konuseinsatz zum Öffnen des Röhrchens nach links drehen und den Konuseinsatz leicht bis zum Knacken nach hinten oder nach oben drücken 6. Gut mischen (Reagenzglasschüttler) 7. Zehn Minuten extrahieren 8. Abschließend mischen Achtung! Es darf kein Stuhl mehr an der Dosierspitze hängen! 5. Gelbe Dosierspitze durch den blauen Konuseinsatz in das Röhrchen stecken und die Dosierspitze zum Schließen nach rechts drehen Blauer Konuseinsatz Dosierspitze Blauer Konuseinsatz Blauer Konuseinsatz Röhrchen Röhrchen Abbildung 1

11 Canine Elastase 1 im Faeces Abarbeitung mit der Einwiegemethode Extraktionspuffer (5x) (Vierkantflasche, grüner Deckel), 100 ml (Best.-Nr. 02), phosphatgepufferte Kochsalzlösung, ph 7,2 mit Detergenz und Natriumazid Herstellung des Extraktionspuffers 100 ml Extraktionspuffer 5x (Best.-Nr. 02, Vierkantflasche, grüner Deckel) ml H 2 O bidest. Der verdünnte Extraktionspuffer ist 6 Monate bei 4-8 C stabil. Einwiegen der Stuhlprobe: Ein etwa 12 ml umfassendes Einwegröhrchen und eine mikrobiologische Impföse (z.b. SARSTEDT) werden mit einer empfindlichen digitalen Laborwaage auf Null austariert. Anschließend wird mit der Impföse der Stuhl eingewogen, indem man mit der Öse in die Stuhlprobe sticht und die an der Spitze verbleibende Stuhlmenge (etwa 100 mg) in das Einwegröhrchen einbringt. Anstelle der Impföse kann auch ein Zahnstocher benutzt werden. Entsprechend der gewogenen Stuhlprobenmasse werden die Volumina des zuzugebenden Extraktionspuffers variiert (z.b. 70 mg Stuhl + 7 ml Puffer oder 100 mg Stuhl + 10 ml Puffer). Homogenisation und Extraktion der Stuhlprobe: Die Stuhlprobensuspension wird bei Raumtemperatur mehrfach kräftig mit einem Reagenzglasschüttelgerät (z.b. VORTEX) gemixt. Die Stühle müssen gut homogenisiert sein, um eine vollständige Extraktion zu gewährleisten. Nach mindestens 15 Minuten Extraktion wird noch einmal abschließend gemixt. Der Extrakt wird 10 min. bei RT stehen lassen. Der Überstand wird abgenommen und im Test verdünnt eingesetzt. Verdünnung der Stuhlproben (Einwiegemethode) Herstellung der 1:40 Verdünnung: 25 μl Stuhlprobenextrakt + 1 ml Proben/Waschpuffer 1x Achtung: Die Verdünnung der Probenextrakte immer erst am Testtag durchführen!

12 Durchführung Inkubation von Proben und Standards Canine Elastase 1 im Faeces A Blank Blank P3 P3 P11 P11 P19 P19 P27 P27 P35 P35 B STD1 STD1 P4 P4 P12 P12 P20 P20 P28 P28 P36 P36 C STD2 STD2 P5 P5 P13 P13 P21 P21 P29 P29 P37 P37 D STD3 STD3 P6 P6 P14 P14 P22 P22 P30 P30 P38 P38 E STD4 STD4 P7 P7 P15 P15 P23 P23 P31 P31 P39 P39 F Ko Ko P8 P8 P16 P16 P24 P24 P32 P32 P40 P40 G P1 P1 P9 P9 P17 P17 P25 P25 P33 P33 P41 P41 H P2 P2 P10 P10 P18 P18 P26 P26 P34 P35 P42 P Streifen > < Teststreifen > < gesamte Platte, 12 Teststreifen > Abbildung 2: STD: Ko: P1-P42: Mögliches Pipettierschema Standards Kontrolle Patientenproben Blank: Vertiefung - A1 und A2 - jeweils 50 μl Proben-/Waschpuffer einpipettieren. Die Standards (rote Deckel) sind gebrauchsfertig und werden in Streifen 1 und 2 als Doppelwerte in die entsprechenden Vertiefungen pipettiert (jeweils 50 μl). Standard 1 = 3 μg/g Faeces Standard 2 = 15 μg/g Faeces Standard 3 = 70 μg/g Faeces Standard 4 = 180 μg/g Faeces Die Kontrolle (gelber Deckel) ist gebrauchsfertig und wird mit jeweils 50 μl z.b. in die Vertiefungen F1 und F2 pipettiert. Kontrolle = 35 μg/g Faeces ± 15 %

13 Canine Elastase 1 im Faeces 13 Von den verdünnten Probenextrakten werden jeweils 50 μl nebeneinander als Doppelwerte in die weiteren Vertiefungen pipettiert. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen: Inhalt der Vertiefungen verwerfen. Vertiefungen dreimal mit Proben-/ Waschpuffer (8-Kanalpipette) waschen (250 μl/vertiefung); Waschlösung bei jedem Waschschritt mind. 1-2 Minuten einwirken lassen; Flüssigkeitsreste durch Ausklopfen auf sauberen Papiertüchern vollständig entfernen Inkubation mit dem 2. Antikörper (anti E1-bio) Wichtig: Verdünnungen des zweiten Antikörpers (anti E1-bio) erst kurz vor dem jeweiligen Waschvorgang ansetzen! Zugabe von 50 μl pro Vertiefung des biotinylierten zweiten monoklonalen Antikörpers = anti E1-bio (violetter Deckel), (kurz vor Gebrauch 1:100 verdünnen). Ansatz für 2 Teststreifen (1/6 Platte): 15 μl anti E1-bio + 1,5 ml Proben-/Waschpuffer Ansatz für 4 Teststreifen (1/3 Platte): 25 μl anti E1-bio + 2,5 ml Proben-/Waschpuffer Ansatz für 6 Teststreifen (1/2 Platte): 30 μl anti E1-bio + 3,0 ml Proben-/Waschpuffer Ansatz für 12 Teststreifen ( 1 Platte): 60 μl anti E1-bio + 6,0 ml Proben-/Waschpuffer 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen: Inhalt der Vertiefungen verwerfen. Vertiefungen dreimal mit Proben-/ Waschpuffer (8-Kanalpipette) waschen (250 μl/vertiefung); Waschlösung bei jedem Waschschritt mind. 1-2 Minuten einwirken lassen; Flüssigkeitsreste durch Ausklopfen auf sauberen Papiertüchern vollständig entfernen Inkubation mit POD-Streptavidin Zugabe von 50 μl pro Vertiefung gebrauchsfertige POD-Streptavidin-Lösung (schwarze Plastikflasche, schwarzer Deckel). 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Waschen: Inhalt der Vertiefungen verwerfen. Vertiefungen dreimal mit Proben-/ Waschpuffer (8-Kanalpipette) waschen (250 μl/vertiefung); Waschlösung bei jedem Waschschritt mind. 1-2 Minuten einwirken lassen; Flüssigkeitsreste durch Ausklopfen auf sauberen Papiertüchern vollständig entfernen.

14 14 Canine Elastase 1 im Faeces Farbreaktion Zugabe von 100 μl der gebrauchsfertigen Substratlösung (schwarze Plastikflasche, roter Deckel) pro Vertiefung. 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. (Bitte verkürzen Sie, falls nötig, bei ELISA-Readern oder Vollautomaten, die nur bis 2,5 OD oder 3,0 OD messen, diese Inkubationszeit entsprechend.) Abstoppen der Farbreaktion Zugabe von 100 μl gebrauchsfertiger Stopplösung (Plastikflasche/weißer Deckel) pro Vertiefung, gut schütteln Messung Die OD-Messung erfolgt bei 450 nm in der Zeit von 5 bis 30 min. nach Zugabe der Stopplösung. Vor der Messung muss die ELISA-Platte gut geschüttelt werden. Nach Möglichkeit sollte gegen eine Referenzwellenlänge von 620 nm gemessen werden. 8.3 Quantitative Auswertung Manuelle Auswertung Nach Subtraktion des Blank-Mittelwertes wird der Mittelwert der Absorption der Doppelwerte berechnet. Die Konzentration der Standards (Abszisse) wird gegen ihre Absorption (Ordinate) aufgetragen (log-log)= Standardkurve. Für die Patientenproben werden die Werte direkt an der Standardkurve abgelesen.

15 Canine Elastase 1 im Faeces 15 2,0 Optische Dichte 1,0 (0,67) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Stuhl: (48 μg/g) μg/g Stuhl E1-Konzentration Abbildung 3: Typisches Beispiel einer Standardkurve Berechnungsbeispiel: Die gemittelte OD der Probe betrug nach Korrektur des Blanks 0,67. Durch Ablesen an der Standardkurve ist einer Konzentration von 48 μg/g Stuhl zu ermitteln Auswertung mittels ELISA-Software Die Plattenbelegung bezüglich der Blanks, Standards und Proben definieren (Abbildung 2). Als Methode lineare Regression mit log-log Skalierung wählen.

16 16 Canine Elastase 1 im Faeces Referenzkonzentration für die canine fäkale Elastase 1 Normalbereich: Graubereich: Schwere Insuffizienz: > 40 μg E1/g Faeces μg E1/g Faeces < 10 μg E1/g Faeces Sehr wässrige Kotproben können aufgrund des Verdünnungseffektes zu verminderten Elastase 1-Konzentrationen führen. Es empfiehlt sich daher, die Konsistenz von sehr wässrigen Patientenproben zu notieren und bei pathologischen Konzentrationen (< 40 μg E1/g Faeces) eine geformte Patientenprobe anzufordern (s.1.7). Spillmann et al. (2000) ermittelten bei einer Referenzkonzentration von < 10 μg/g Faeces und einer Einfachbestimmung der caninen Elastase 1 eine Senitivität von 95% (eine Sensitivität von 97% wurde bei der Bestimmung der caninen Elastase 1 an drei aufeinanderfolgenden Tagen gefunden) bei einer Spezifität von 92% für eine hochgradige exokrine Pankreasinsuffizienz. Als Kontrollgruppe wurden gesunde Patienten und solche mit chronischer Enteropathie herangezogen. Werte aus dem Bereich μg/g Faeces sind fraglich (Graubereich) und weisen möglicherweise auf eine beginnende exokrine Pankreasinsuffizienz hin. Die Messung muss daher mit einer neuen Probe wiederholt werden. Werte > 40 μg/g Faeces sind normal. Aufgrund der starken Tagesschwankungen der E1-Konzentration im Hundekot wird ein zweistufiges Vorgehen empfohlen, wenn die Werte der ersten Messung im fraglichen Bereich von10-40 μg/g Faeces liegen (siehe auch Abb. 4): 1. Messung: Das Ergebnis ist eindeutig wenn Werte > 40 μg/g Faeces (Normalbereich) oder < 10 μg/g Faeces (schwere Insuffizienz) gemessen werden. Liegt der Messwert dagegen in dem Bereich μg/g Faeces, sollte zur Überprüfung eine 2. Messung mit einer neuen Probe herangezogen werden. 2. Messung: Werden bei dieser Zweitmessung Werte > 40 μg/g Faeces (Normalbereich) oder < 10 μg/g Faeces (schwere Insuffizienz) erzielt, dann ist die exokrine Pankreasfunktion des Patienten eindeutig definiert. Fällt dagegen der zweite Messwert wiederum in den fraglichen Bereich von μg/g Faeces, besteht Verdacht auf eine beginnende exokrine Pankreasinsuffizienz. Die Pankreasfunktion des Patienten sollte in zwei Monaten wieder kontrolliert und/oder einer Invasivdiagnostik zur Differenzierung der Ursache der chronischen Pankreasinsuffizienz (z.b. Laparoskopie) unterzogen werden.

17 Canine Elastase 1 im Faeces Messung Messwert < 10 μg E1/g Faeces? Ja EPI Nein Messwert > 40 μg E1/g Faeces? Ja normal Nein Messwert im Graubereich μg E1/g Faeces? 2. Messung mit neuer Probe 2. Messung Messwert < 10 μg E1/g Faeces? Ja EPI Nein Messwert > 40 μg E1/g Faeces? Ja normal Messwert im Graubereich μg E1/g Faeces? Nein Kontrolle in zwei Monaten (Verdacht auf beginnende EPI) Abbildung 4: Zweistufige Messung der fäkalen Elastase 1 beim Hund EPI = Exokrine Pankreasinsiuffizienz

18 18 1 Introduction Canine Elastase 1 in Faeces 1.1 Pathobiochemistry The pancreas of dogs secretes a digestive enzyme that is homologous to human pancreatic elastase 1 (Eim 1998, Spillmann et al. 1998a). Canine pancreatic elastase 1 (E1) remains undegraded during intestinal transit (Spillmann et al. 1998b). Therefore, its faecal concentration reflects pancreatic exocrine function. 1.2 Advantages To improve the diagnosis of canine pancreatic exocrine insufficiency, ScheBo Biotech has developed a species-specific enzyme immunoassay (ELISA) that allows quantification of pancreatic elastase 1 in the faeces of dogs. Quantification of human pancreatic elastase 1 in faeces has proven to be a superior non-invasive pancreatic function test for the diagnosis of pancreatic exocrine insufficiency with a sensitivity and specificity of 93%. Its results correlate well with the invasive gold standard secretin-pancreozymin test (Scheefers-Borchel et al. 1992, Löser et al a and b, Stein et al. 1996, 1997). Although pancreatic exocrine insufficiency is one of the major reasons for maldigestion in dogs (Strombeck and Guildford 1993), until now there was no noninvasive pancreatic function test available allowing a simple, inexpensive and reliable diagnosis of pancreatic insufficiency. The established parameters such as chymotrypsin activity in the faeces (Reusch 1986) as well as digestion tests (Bunch 1992, Williams 1992, Spillmann 1996) (e.g. lipid assimilation test, BT-PABA test) and the ceruletide test (Spillmann 1994) show specific weaknesses (Spillmann 1996). Thus, these tests should be done in combination. However, this is very expensive and time consuming. Previously only the measurement of pathologically low concentrations of canine trypsin-like immunoreactivity (ctli) in the serum allowed detection of a pancreatic acinar atrophy (Williams 1987 and 1988). However, in dogs with pancreatic exocrine insufficiency secondary to obstruction of pancreatic ducts, serum ctli might be normal (Williams 1987). Additionally, in animals with exocrine pancreatic insufficiency caused by chronic pancreatitis serum ctli concentrations may not always be as low as in those with pancreatic acinar atrophy. Inflammation in residual pancreatic tissue might lead to slightly greater serum ctli concentrations than would be expected from the mass of acinar tissue remaining (Williams 1987). However, another main disadvantage of the ctli test is its radioimmunoassay (RIA) technology. In contrast to conventional laboratory parameters of canine pancreatic exocrine function, the determination of pancreatic elastase 1 (E1) has the following advantages: The test is non-radioactive. An isotopic laboratory is not required. E1 is absolutely pancreas-specific.

19 Canine Elastase 1 in Faeces 19 Since E1 is stable during intestinal transit, the faecal elastase 1 concentration reflects the secretory capacity of the pancreas (diagnosis or exclusion of exocrine pancreatic insufficiency). Digestive enzyme substitution therapy has no influence on the determination of E1. The monoclonal antibodies used in the test are monospecific for canine elastase 1 therefore recognizing only elastase 1 of canine origin. There is no cross-reaction with bovine or porcine elastases. Substitution therapy does not need to be discontinued 5 days before measurement in contrast to the determination of faecal chymotrypsin activity. There is no need for a 12-hour starvation period, in contrast to the necessary preparation before the ctli test. 1.3 Sensitivity and specificity Spillmann et al. found that a reference concentration of <10 μg E1/g faeces in the stool sample from a single day corresponds to a sensitivity of 95% (sensitivity of 97% for three consecutive days stool) at a specificity of 92% for clinical exocrine pancreatic insufficiency (Spillmann et al. 2000). They also reported a negative predictive value of 100% for single day samples >20 μg E1/g faeces. As controls, both healthy patients and dogs with chronic enteropathy were tested. Borderline values within the range μg E1/g faeces represent the "grey zone" (see chapter 8.3.3) and a new sample should be obtained and tested. Overall the reliability of the canine pancreatic elastase 1 ELISA reaches that of the ctli RIA (Spillmann et al. 1998b). 1.4 Basic principle of the assay The ELISA plate is coated with a monoclonal antibody which only recognizes canine pancreatic elastase 1 (E1). E1 from samples and standards binds to the antibody and is immobilized on the plate. A second monoclonal antibody, which is biotinylated, binds to E1 during the next incubation. Then the conjugate of POD (peroxidase) and streptavidin binds to the biotin moiety. The peroxidase oxidizes TMB (3,3 5,5 -tetra-methyl benzidine), which turns yellow. Finally, the concentration of oxidized TMB is determined photometrically. 1.5 Detection limit Canine pancreatic elastase 1 can be determined within the range of 3 to 180 μg E1/g faeces. Concentrations below the lowest standard should be stated as < 3 μg E1/g faeces.

20 Canine Elastase 1 in Faeces Precision The intra-assay variance was evaluated by 20-fold determination of samples (range: μg E1/g faeces) from four patients. The average coefficient of variance (CV) was 7.2 % (range: %). The inter-assay variance was calculated with samples (range: μg E1/g faeces) from five patients, which were tested on ten different days. The mean CV was 7.6 % (range: %). 1.7 Interferences The E1 concentration in very watery faeces samples may be lowered due to dilution. Therefore, it is recommended to note the consistency of watery faeces. In case of a pathological result (< 40 μg E1/g faeces) a formed sample should be requested. No substances are known to interfere with the test. In particular, digestive enzyme substitution therapy does not influence the determination of canine elastase 1. 2 Reagents ELISA-strips with 8 wells per strip, each coated with a monoclonal antibody to canine pancreatic elastase 1 (E1) (96 wells) 2. Sample/ washing buffer concentrate (5x) (black cap), 100 ml phosphate buffered saline, ph 7.2, with detergent 3. E1 standards 1 to 4, ready-to-use (red caps), 700 μl each canine pancreatic elastase 1 in aqueous solution with sodium azide 4. Control, ready-to-use (yellow cap), 700 μl canine pancreatic elastase 1 in aqueous solution with sodium azide 5. Second monoclonal antibody to E1 conjugated to biotin = anti E1-bio (violet cap), 150 μl in aqueous solution with sodium azide 6. POD-Streptavidin, ready-to-use, light sensitive (black plastic vial with black cap), 8 ml in aqueous solution 7. Substrate solution, ready-to-use, light sensitive (black plastic vial with red cap), 12 ml TMB in aqueous solution 8. Stop solution, ready-to-use (plastic vial with white cap), 12 ml aqueous acidic solution 9. Plastic bag containing a desiccant for unused ELISA-strips

21 Canine Elastase 1 in Faeces 21 3 Sample material and sample stability Sample material: Single spot sample of canine faeces. Sample stability: Samples may be stored for up to three days at 4-8 C or up to a year at -20 C. Undiluted stool extracts may be stored at 4-8 C for one day. Performance characteristics have not been established for other types of samples. 4 Storage and stability of the test kit All components of the test kit are stable at 4-8 C until the expiry date shown on the kit labels. The kit must not be used after the expiry date. Unused ELISA-strips must be stored in the well-sealed plastic bag containing a desiccant. 5 Additional utensils required Polystyrene test tubes (3 ml,10 ml and 12 ml) with caps 500 ml graduated cylinder vortex mixer adjustable precision pipettes: 0-50 μl, μl, and μl 2 ml, 5 ml and 10 ml pipettes adjustable 8 channel pipette μl ELISA reader capable of reading absorbance at 450 nm. Reference wavelength: 620 nm. 6 Precautions For in vitro diagnostic use only. Extraction buffer, standards, control and anti E1-bio contain sodium azide as a preservative. Substrate solution contains TMB, and Kathon CG as preservative. Please observe the relevant safety precautions. Avoid skin contact. Do not pipette by mouth. Wear disposable gloves while performing the test. Do not mix materials from different master lots or materials from canine and human elastase 1 kits. 7 Recommendations for optimal test performance 1. Follow the instruction manual precisely. 2. All components of the test kit have to be stored at 4-8 C. Bring all reagents and the ELISA plate to room temperature shortly before use. After using store all remaining reagents at 4-8 C immediately. 3. Vortex all liquid reagents before use. Avoid droplets in the caps of the tubes.

22 22 Canine Elastase 1 in Faeces 4. Do not touch the bottom of the ELISA plate. 5. Always work along the ELISA plates in identical order and equal time intervals. 6. To avoid contamination use clean pipette tips and clean receptacles. Do not use the same receptacle for different reagents (e.g. anti E1-bio and POD- Streptavidin). 7. Pipetting Pipette all reagents and samples into the lower third of the wells When washing hold the pipette tips at the upper rim of the wells 8. Washing Before each washing step, invert the plate and tap hard on a clean paper towel to remove all remaining liquid. Use only clean paper towels when tapping the plate dry. Make sure that no liquid drains back or transfers to other wells. Incubate with washing buffer for at least 1-2 minutes per washing step. 9. Measurement Agitate plate well before each measurement to ensure even distribution of the dye. Remove any bubbles with a clean needle. Wait at least five minutes after stopping the color reaction before measuring. 7.1 Contact details For UK & Republic of Ireland contact: ScheBo Biotech UK Limited Ivor Smith, B.Sc., P.O. Box 6359, Basingstoke, RG22 4WE, U.K. Tel.: Fax: Mobile: i.smith@schebo.com Or for other countries contact: Your local distributor

23 Canine Elastase 1 in Faeces 23 8 Test procedure 8.1 Preparation Preparation of sample/washing buffer 100 ml sample-/washing buffer 5x (black cap) ml bidistilled water. The diluted sample-/washing buffer is stable at 4-8 C for 6 months Preparation of ELISA plate Bring ELISA plate to room temperature before opening bag. Desired number of ELISA strips are left in the microplate frame. Unused ELISA-strips must be stored in the well-sealed plastic bag containing the desiccant Preparation of stool specimen We recommend the ScheBo E1 Quick-Prep - Canine dosing device (cat. no. 09-Quick, see ) is used for speed and convenience, or alternatively Weighing method: stool specimen can be weighed (see ) Perfomance with ScheBo E1 Quick-Prep - Canine The tubes of the ScheBo E1 Quick-Prep - Canine sample preparation system contain ready-to-use extraction buffer. See the imprint on the packaging for the expiry date. The ScheBo E1 Quick-Prep - Canine sample preparation system (cat. no. 09- Quick) should be used according to figure 1 (page 24). Dilution of stool extracts prepared with ScheBo E1 Quick-Prep - Canine Preparation of 1: 8 dilution (as described in final step of figure 1 on page 24): 50 μl extracted stool sample μl sample-/washing buffer 1x Attention: Do not dilute stool extracts until the day the test is performed.

24 24 Canine Elastase 1 in Faeces 4. Remove the yellow dosing tip 11. After the particles have settled, dilute the faeces sample extract 1:8 (50 μl faeces sample extract μl sample-/washing buffer 1x) Complete the test as described in the instruction manual (see section 8.2, page 26) Dosing tip Stool extraction with E1 Quick-Prep TM -Canine 3. Insert the yellow dosing tip in faeces sample to a depth of c. 1cm (all notches must be filled with stool) 2. Remove the yellow dosing tip by pulling it upwards 1. Turn the yellow dosing tip (only) anti-clockwise Blue Cone Blue Cone Blue Cone Dosing tip Tube Tube Extraction buffer 10. Remove the blue cone and yellow dosing tip (together) from the tube 9. Twist the blue cone anticlockwise, then push or lift upwards until it clicks open 6. Mix well (vortex) 7. Extract for 10 minutes 8. Then mix again Attention! Make sure NO stool is left on the dosing tip! 5. Insert the yellow dosing tip into the tube through the blue cone and turn the yellow dosing tip clockwise Blue Cone Dosing tip Blue Cone Blue Cone Tube Tube Figure 1 Tube

25 Canine Elastase 1 in Faeces Performance with the weighing method Extraction buffer concentrate (5x) for stool specimen (square flask, green cap), 100 ml (cat. no. 02) phosphate buffered saline, ph 7.2, with detergent and sodium azide Preparation of extraction buffer: Dilute the extraction buffer (5x) (cat. no. 02): 100 ml extraction buffer (5x) ml bidistilled water. The diluted extraction buffer is stable at 4-8 C for 6 months. Weighing the stool specimen: Tare a disposable tube (circa 12ml capacity) and an inoculating loop to zero, using a sensitive digital laboratory balance. Then take a sample (circa 100 mg) of the stool specimen using the inoculating loop and replace the loop into the tube to weigh the sample (a wooden applicator or toothpick can also be used in place of an inoculating loop). Add extraction buffer to the stool sample according to the sample mass, so that the final concentration equals 10 mg stool/ml extraction buffer (e.g. 70 mg stool +7 ml buffer or 100 mg stool + 10 ml buffer). Homogenisation and extraction of stool samples: Mix the stool suspension vigorously a number of times using a laboratory reagentglass shaker (e.g. Vortex mixer) at room temperature. The stool suspensions must be thoroughly homogenised in order to achieve complete extraction. After at least 15 minutes' extraction time, vortex the suspension again. Leave the extract to stand for 10 minutes at room temperature. Then remove the supernatant for use (after dilution) with the test kit. Dilution of stool extract prepared by the weighing method Preparation of 1: 40 dilution: 25 μl extracted stool sample + 1 ml sample-/washing buffer 1x Attention: Do not dilute stool extracts until the day the test is performed.

26 Assay procedure Canine Elastase 1 in Faeces Incubation of samples and standards A Blank Blank S3 S3 S11 S11 S19 S19 S27 S27 S35 S35 B STD1 STD1 S4 S4 S12 S12 S20 S20 S28 S28 S36 S36 C STD2 STD2 S5 S5 S13 S13 S21 S21 S29 S29 S37 S37 D STD3 STD3 S6 S6 S14 S14 S22 S22 S30 S30 S38 S38 E STD4 STD4 S7 S7 S15 S15 S23 S23 S31 S31 S39 S39 F CON CON S8 S8 S16 S16 S24 S24 S32 S32 S40 S40 G S1 S1 S9 S9 S17 S17 S25 S25 S33 S33 S41 S41 H S2 S2 S10 S10 S18 S18 S26 S26 S34 S35 S42 S42 < test strips > < test strips > < whole ELISA-plate, 12 test strips > Figure 2: Possible plate layout STD: CON: S1-S42: standards control patient samples Blank = wells A1 and A2; pipette 50 μl of sample/washing buffer into each well. Standards (red caps) are ready-to-use; pipette 50 μl duplicates of each standard (undiluted) into columns 1 and 2 as duplicates (see figure 2). Standard 1 = 3 μg/g faeces Standard 2 = 15 μg/g faeces Standard 3 = 70 μg/g faeces Standard 4 = 180 μg/g faeces Control, ready-to-use (yellow cap); pipette 50 μl per well into wells F1 and F2. Control = 35 μg/g faeces ± 15 %

27 Canine Elastase 1 in Faeces 27 Pipette 50 μl of diluted stool extract (see and ) from each sample into each of two adjacent wells. Incubate for 60 minutes at room temperature. Washing: Empty the wells and wash each well 3 times with sample-/washing buffer (8-channel pipette, 250 μl/well). Invert the plate and tap it firmly on a clean paper towel to remove all remaining liquid Incubation with second antibody (anti E1-bio) Important: Dilutions of the second antibody = anti E1-bio should be prepared shortly before the appropriate washing step! Add 50 μl/well of the biotin-conjugated second monoclonal antibody = anti E1- bio (violet cap), (dilute 1:100 shortly before use). For 2 test-strips (1/6 plate): 15 μl diluted anti E1-bio ml sample/washing buffer For 4 test-strips (1/3 plate): 25 μl diluted anti E1-bio ml sample/washing buffer For 6 test-strips (1/2 plate): 30 μl diluted anti E1-bio ml sample/washing buffer For 12 test-strips ( 1 plate): 60 μl diluted anti E1-bio ml sample/washing buffer Incubate for 30 minutes at room temperature. Washing: Empty the wells and wash each well 3 times with sample-/washing buffer (8-channel pipette, 250 μl/well). Invert the plate and tap it firmly on a clean paper towel to remove all remaining liquid Incubation with POD-Streptavidin Add 50 μl/well of ready-to-use POD-Streptavidin (black plastic vial with black cap) Incubate for 30 minutes in the dark at room temperature. Washing: Empty the wells and wash each well 3 times with sample-/washing buffer (8-channel pipette, 250 μl/well). Invert the plate and tap it firmly on a clean paper towel to remove all remaining liquid.

28 28 Canine Elastase 1 in Faeces Color reaction Add 100 μl of ready-to-use substrate solution (black plastic vial with red cap) to each well. Incubate for 20 minutes in the dark at room temperature. (You may need to shorten this time when using an ELISA plate-reader or a fully automated machine which reads absorbances up to only 2.5 or 3.0.) Stopping the color reaction Stop the substrate reaction by adding 100 μl of stop solution per well (ready-touse, white cap). Mix contents well by agitating the plate Measurement Read the optical density at 450 nm with a microtiter plate reader between 5 and 30 minutes after addition of the stop solution. Mix contents well before measuring. If possible 620 nm should be used as a reference wavelength. 8.3 Quantification of results Manual evaluation Calculate the mean optical densities of all duplicates after the mean blank value has been subtracted. Plot the concentration of standards versus their corresponding optical densities on log-log paper (= standard curve). The concentration of samples can be read directly from the standard curve since the dilution factor was taken into account in the production of the standards.

29 Canine Elastase 1 in Faeces Optical Density 1.0 (0.67) Stool: (48 μg/g) μg/g Stool E1 Concentration Figure 3: Typical example of a standard curve Example: The average OD after the mean blank has been subtracted was This corresponds to a canine pancreatic elastase 1 concentration of 48 μg/g (see figure 3) Evaluation by ELISA - software Define blank, standards and samples according to the plate layout (figure 2). Use the curve - fit method (linear regression) with log - log scale. Do not enter a dilution factor, since the dilution of the samples has been taken into account in the production of the standards Reference concentration for canine pancreatic elastase 1 normal: > 40 μg E1/g faeces borderline range ("grey zone"): μg E1/g faeces severe exocrine pancreatic insufficiency: < 10 μg E1/g faeces These canine elastase 1 concentrations refer to formed faecal samples. In case of pathological canine pancreatic elastase 1 concentrations (<10 μg E1/g faeces) in watery stool samples a second formed stool sample should be requested (see section 1.7). Spillmann et al. found that a reference concentration of <10 μg E1/g faeces in the stool sample from a single day corresponds to a sensitivity of 95% (sensitivity of 97%

30 30 Canine Elastase 1 in Faeces for three consecutive days stool) at a specificity of 92% for clinical exocrine pancreatic insufficiency (Spillmann et al. 2000). They also reported a negative predictive value of 100% for single day samples >20 μg E1/g faeces. As controls, both healthy patients and dogs with chronic enteropathy were tested. Borderline values within the range μg E1/g faeces represent the grey zone and a new sample should be obtained and tested. The following two-step measurement procedure (see figure 4) is recommended in the case of an initial borderline result of μg E1/g faeces, which could be due to daily intra-individual variation of E1 concentration: 1 st Measurement: The result is clear-cut if values are > 40 μg E1/g faeces (normal) or < 10 μg E1/g faeces (severe exocrine pancreatic insufficiency). A second independent sample must be analyzed if the result is in the borderline range of μg E1/g faeces. 2 nd Measurement: The result becomes clear-cut with values > 40 μg E1/g faeces (normal) or < 10 μg E1/g faeces (severe exocrine pancreatic insufficiency). If the result is again within the range of μg E1/g the patient should be tested two months later since there is a suspicion of the onset of exocrine pancreatic insufficiency. In addition, the patient should undergo further investigation to establish a diagnosis (e. g. laparoscopy).

31 Canine Elastase 1 in Faeces 31 1 st Measurement E1 Conc.: < 10 μg E1/g faeces? Yes EPI No E1 Conc.: > 40 μg E1/g faeces? Yes normal No Grey zone E1 Conc μg E1/g faeces? E1 Conc.: < 10 μg E1/g faeces? 2 nd Measurement Yes 2 nd measurement, new specimen EPI No E1 Conc.: > 40 μg E1/g faeces? Yes normal No Grey zone E1 Conc μg E1/g faeces? Test in 2 months (suspicion of the onset of EPI) Figure 4: Two-step measurement procedure for canine faecal elastase 1 Conc. = Concentration; EPI = Exocrine Pancreatic Insufficiency

32 32 9 Literatur - References Canine Elastase 1 in Faeces BATTERSBY I. A., PETERS,I. R., DAY M. J., GERMAN A. J., HALL E. J. (2005) Effect of intestinal inflammation on fecal elastase concentration in dogs Vet Clin Pathol 34 (1): BUNCH, S. E. (1992) The exocrine pancreas In: Essentials of Small Animal Internal Medicine. Nelson R. W., Xouto C.G. (eds.) St. Louis: Mosby Year Book EIM C. (1998) Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen die Pankreaselastase 1 des Hundes zur Entwicklung eines ELISA für die Pankreasdiagnostik, Inauguraldissertation am Fachbereich Verterinärmedizin, Justus-Liebig-Universität, Giessen LÖSER C., FÖLSCH U. R. (1996) Diagnostik der chronischen Pankreatitis Dtsch med Wschr 121: LÖSER C., MÖLGAARD, A., FÖLSCH, U. R. (1996) Faecal elastase 1: a novel, highly sensitive, and specific pancreatic function test Gut 39: REUSCH C. (1986) Photometrische Chymotrypsinbestimmung im Kot des Hundes. Eine neue Methode in der Diagnostik der chronischen exokrinen Pankreasinsuffizienz. Tierärztl Prax 14: SCHEEFERS-BORCHEL U., SCHEEFERS H., ARNOLD R., FISCHER P., SZIEGOLEIT A. (1992) Pankreatische Elastase 1: Parameter für die chronische und akute Pankreatitis Lab med 16: SPILLMANN T. (1996) Zur Diagnostik der exokrinen Pankreasinsuffizienz beim Hund Möglichkeiten und Grenzen der Labordiagnostik chronischer Pankreatopathien. Kleintierpraxis 41: SPILLMANN T., CHAUDHRY, Y.S., WIBERG M., EIGENBRODT E. SZIEGOLEIT A., WESTERMARCK E. (1999) Aktueller Stand der Labordiagnostik chronischer Pankreaserkrankungen beim Hund Ein Methodenvergleich. Abstract von der 45. Jahrestagung der Deutschen Veterinämedizinischen Gesellschaft Fachgruppe Kleintierkrankheiten, , Giessen SPILLMANN T., EIGENBRODT E., SZIGOLEIT A. (1998) Die Bestimmung und klinische Relevanz der fäkalen pankreatischen Elastase beim Hund. Tierärztl Prax 26 (K): SPILLMANN T., EIGENBRODT E., SZIGOLEIT A. (1999) Faecal Pancreatic Elastase in Dogs Determination and Diagnostic Value. Abstract of the 7th Annual Congress of the European Society of Veterinary Internal Medicine, September 11 13, 1997, Lyon, France