real time RT-PCR Kit

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1 Gebrauchsinformation Instruction Manual virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit Für den in-vitro Nachweis von RNA des Bovinen Viralen Diarrhoe-Virus (BVDV) in Einzel- oder Poolproben von EDTA-Blut, Plasma, Serum und Gewebeproben (z.b. Ohrstanzen) von Rindern. Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach 17c TierSG zugelassen. For the in-vitro detection of Bovine Virus Diarrhea Virus (BVDV) RNA in single or pooled samples of bovine EDTA-blood, plasma, serum and tissue samples (e.g. ear notches). The German version of the Instruction Manual is approved according to 17c TierSG. Zul. -Nr.: FLI-B 637 G GmbH & Co. KG Remsstr. 1 D Kornwestheim Germany phone: +49 (0) fax: + 49 (0) info@gerbion.com Version der Gebrauchsinformation Version of the Instruction Manual: 1.2/

2 Inhaltsverzeichnis Komponenten... 3 Abkürzungen... 3 Transport und Lagerung... 3 Anwendungszweck... 3 Art und Beschaffenheit des Probenmaterials... 4 Qualitätskontrolle... 4 Produktgewährleistung... 4 Einleitung... 4 Testprinzip... 5 Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte... 5 Wichtige Hinweise... 6 Probenvorbereitung... 6 Poolen von Proben... 7 Kontroll-RNA... 7 Real time RT-PCR... 8 Durchführung... 9 Interpretation der Ergebnisse Troubleshooting... 13

3 Komponenten Die Komponenten sind ausreichend für den Ansatz von 100 Nachweisreaktionen. Bezeichnung Deckelfarbe Inhalt K1 Reaktionsmi x gelb 2 x 1035 µ l K2 Enzym blau 1 x 30 µ l K3 Positivkontroll e rot 1 x 100 µ l K4 Negativkontroll e grün 1 x 100 µ l K5 Kontrol-RN A rot 2 x 240 µ l Abkürzungen BVDV Bovine Virus Diarrhoe Virus BVD Bovine Virus Diarrhoe RNA Ribonukleinsäure PCR Polymerase Ketten Reaktion RT Reverse Transkription cdna komplementäre Desoxyribonukleinsäure Transport und Lagerung Der Transport des virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit erfolgt gefroren auf Trockeneis. Alle Komponenten des virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit sind direkt nach Erhalt lichtgeschützt bei -18 C oder niedrigeren Temperaturen zu lagern. Nach Ablauf des auf der Packung angegebenen Haltbarkeitsdatums nicht mehr verwenden! Nach Anbruch der Reagenzien sind diese für maximal sechs Monate verwendbar. Mehrmaliges Auftauen und Einfrieren (> zweimal) der Reagenzien vermeiden, da dadurch die Sensitivität verringert werden kann. Gegebenenfalls sollten die Kitkomponenten K1, K3 und K5 aliquotiert werden. Anwendungszweck Der virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit dient dem Nachweis der RNA des Bovinen Viralen Diarrhoe Virus in Einzel- oder Poolproben von EDTA- Seite 3

4 Blut, Plasma, Serum, Gewebeproben (z.b. Ohrstanzen) von Rindern. Der Test weist alle bekannten Typen des BVD-Virus vom Rind nach. Art und Beschaffenheit des Probenmaterials Das Ausgangsmaterial für die Nachweisreaktion ist virale RNA, die aus Gewebeproben (z.b. Ohrstanzen), EDTA-Blut, Plasma oder Serum isoliert wurde. Für alle Probenmaterialien ist ein Pool von bis zu 50 Einzelproben möglich. Bei einer Direktlyse von Gewebeproben ist eine Poolgröße von bis zu 24 möglich. Die geeignete Poolgröße hängt von der BVDV-Prävalenz im Gebiet, aus dem die Proben stammen, und vom Alter der Tiere ab. Qualitätskontrolle In Übereinstimmung mit dem ISO-zertifizierten Qualitätsmanagementsystem der gerbion GmbH & Co. KG wird jede Charge des virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit gegen vorgegebene Spezifikationen getestet, um eine einheitliche Produktqualität zu gewährleisten. Produktgewährleistung Diese Gebrauchsinformation gilt als vollständig und richtig zum Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung. Die gerbion GmbH & Co. KG haftet keinesfalls für Neben- oder Folgeschäden, die sich im Zusammenhang mit oder in der Folge der Benutzung dieser Gebrauchsinformation ergeben. gerbion garantiert die volle Funktionsfähigkeit, wenn die Handhabung des Produktes entsprechend der in der Gebrauchsinformation gegebenen Anleitung erfolgt. Der Käufer muss selbst bestimmen, ob das Produkt für seine spezielle Anwendung geeignet ist. gerbion behält sich das Recht vor, Produkte jederzeit zu modifizieren, um die Funktionalität oder das Design zu verbessern. Einleitung Infektionen mit dem Virus der Bovinen Virus Diarrhoe (BVD) verursachen jährlich große ökonomische Verluste in der Milch- und Fleischindustrie. Das BVD Virus (BVDV) kann spontane Aborte verursachen oder führt durch transplazentale Übertragung des Virus auf Föten zu persistent infizierten (PI) Tieren. Die Identifizierung der PI Tiere erlaubt die Eliminierung von Quellen der Reinfektion. BVDV ist zudem Auslöser der Mucosal Disease (MD). Seite 4

5 Testprinzip Der virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit enthält spezifische Primer und Hydrolyse-Sonden für den Nachweis der RNA des Bovinen Viralen Diarrhoe-Virus in Einzel- oder Poolproben von Rindern. Geeignet sind EDTA- Blut, Plasma, Serum nach vorausgegangener RNA-Extraktion bzw. Gewebeproben (Ohrstanzen) nach vorausgegangenem Aufschluss des Gewebes. Die reverse Transkription (RT) der möglicherweise enthaltenen viralen RNA zu cdna und die anschließende Amplifikation von BVDV-spezifischen Fragmenten mittels Polymerase-Kettenreaktion erfolgen in einem Schritt. Die Detektion der Amplifikation erfolgt in Echtzeit durch die Hybridisierung und anschließende Hydrolyse der BVDV spezifischen TaqMan Sonden mittels FAM Fluoreszenz. Zusätzlich verfügt die virellabvdv 2.0 real time RT-PCR über ein zweites heterologes Amplifikationssystem, um den Erfolg der RNA-Extraktion zu überprüfen und eine mögliche Inhibition der RT-PCR Reaktion zu identifizieren. Hierzu dient die reverse Transkription und Amplifikation einer Kontroll-RNA, welche entweder vor der RNA-Extraktion zugefügt wird (z.b. bei Blutproben) und somit gleichzeitig als Extraktionskontrolle dient, oder dem Mastermix zupipettiert wird (z.b. bei Gewebeaufschlüssen). In der real time RT-PCR erzeugt die Kontroll-RNA ein Fluoreszenzsignal im Kanal VIC /HEX/JOE /TET. Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte bei Blutproben: RNA Extraktions-Kit bei Gewebeproben: Reagenz zum Gewebeaufschluss dh 2 O sterile Reaktionsgefäße mit Verschluss Pipetten (variable Volumina) sterile Pipettenspitzen mit Filter Tischzentrifuge Vortexer Thermoblock real time PCR Gerät optische PCR Gefäße mit Verschluß Optional: Pipettiergeräte zur Automation Seite 5

6 Wichtige Hinweise Die virellabvdv 2.0 real time RT-PCR muss in für diesen Zweck geeigneten Laboratorien und von speziell geschultem Personal durchgeführt werden. Die Richtlinien der Good Laboratory Practice (GLP) sind einzuhalten. Alle Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit den Proben in Berührung kommenden Gegenstände müssen als potentiell kontaminiert erachtet werden. Allgemeine Hinweise Die Anweisungen der Gebrauchsinformation sind einzuhalten. Areale für die Probenvorbereitung und den Ansatz des PCR-Master- Mix sollten strikt getrennt sein. Pipetten, Röhrchen und andere Arbeitsmaterialien dürfen nicht von einem Bereich in den anderen zirkulieren. Das Enzym (K2) ist auch bei -18 C flüssig. Das Enzym (K2) erst unmittelbar vor Gebrauch aus dem Gefrierschrank entnehmen, unmittelbar nach Gebrauch in den Gefrierschrank zurückstellen. Immer Pipettenspitzen mit Filtern verwenden. Pipetten und Arbeitsflächen regelmäßig mit geeigneter Dekontaminationslösung reinigen (keine ethanolhaltigen Mittel). Komponenten verschiedener Chargen des virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit dürfen nicht zusammen verwendet werden. Probenvorbereitung Die virellabvdv real time RT-PCR ist geeignet für den Nachweis von BVDV- RNA in Einzel- oder Poolproben von Rindern (EDTA-Blut, Plasma, Serum nach vorausgegangener RNA-Extraktion bzw. Ohrstanzproben nach vorausgegangenem Aufschluss des Gewebes). Es wird empfohlen, kommerziell erhältliche Extraktionskits zu verwenden. Extraktion von EDTA-Blut, Plasma, Serum, z.b.: ZR Viral RNA Kit (Zymo Research) High Pure Viral RNA Kit (Roche Diagnostics) RNeasy Mini Kit (Qiagen) Aufschluss von Gewebeproben (Ohrstanzproben), z.b.: NukEx Nukleinsäurefreisetzungsreagenz (gerbion) Wichtig: Bei Blutproben sollte zusätzlich zu den Proben eine Wasserkontrolle (Reinstwasser) extrahiert werden, anhand derer sich eventuell Seite 6

7 auftretende Inhibitionen und Kontaminationen ablesen lassen. Diese Wasserkontrolle muss analog einer Probe behandelt werden. Bei Gewebeproben sollte in der RT-PCR zusätzlich zu den Proben eine Kontrolle mit Lysereagenz mitgeführt werden. Beachten Sie bitte auch den Abschnitt Kontroll-RNA, Seite 7. Falls die real time RT-PCR nicht sofort durchgeführt wird, müssen die RNA-Extrakte entsprechend den Angaben des RNA-Extraktionskit Herstellers aufbewahrt werden. Weitere Informationen zur Isolierung von RNA erhalten Sie in der Gebrauchsinformation des Extraktionskits oder vom technischen Service des RNA-Extraktionskit Herstellers. Poolen von Proben EDTA-Blutproben, Serum- und Plasmaproben Gleichgroße Aliquots (z.b. je 100 µl) von bis zu 50 Einzelproben poolen und gut mischen (vortexen), anschließend RNA extrahieren. Gewebeproben (Ohrstanzen) Gleichgroße Aliquots (z.b. je 10 µl) der Aufschlussüberstände von bis zu 24 Einzelproben poolen und danach gut mischen (vortexen). Beachte: Verunreinigungen der Gewebeproben durch Trocknungsmittel können zu Inhibitionen der RT-PCR führen. Aufschlussüberstände, die in der Erstuntersuchung mit dem virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit stark inhibierent waren, sollten vor einem erneuten PCR-Lauf in einem geeigneten Verdünnungspuffer (z.b. NukEx Universal Verdünnungspuffer G01014) verdünnt werden. Kontroll-RNA Der virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit enthält eine Kontroll-RNA (K5), die zum einen als Kontrolle der RNA-Extraktion dient, zum anderen als Interne Kontrolle mögliche Inhibitionen der Reversen Transkription bzw. der PCR aufzeigt. Kontrol RNA (K5) als Extraktionskontrolle verwenden (Blut, Plasma, Serum etc.): Die Kontroll-RNA (K5) wird jeder Probe vor der eigentlichen Extraktion beigemischt. Dazu das für eine Extraktion benötigte Puffervolumen mit der Anzahl (N) der durchzuführenden Extraktionen multiplizieren und Seite 7

8 zum Ausgleich der Pipettierungenauigkeit einen zusätzlichen Ansatz berechnen. Von der Kontroll-RNA 5 µl pro Extraktion (also 5 µl x (N+1)) hinzupipettieren. Zymo ZR Viral RNA-Kit: 5 µl Kontroll-RNA werden vor der Probenzugabe dem Viral RNA Buffer zugegeben. Roche High Pure Viral RNA-Kit: 5 µl Kontroll-RNA werden der workingsolution zugegeben. Wird die Probe im ersten Puffer des Extraktionskit inkubiert, so wird die Kontroll-RNA (K5) erst nach der Inkubation jeder Probe einzeln zugefügt. Kontroll-RNA nicht in das ursprüngliche Probenmaterial oder das Original- Pufferbehältnis pipettieren! Folgen Sie Protokoll A zum Ansetzen der real time RT-PCR. Kontrol RNA (K5) als Interne Kontrolle der real time RT-PCR verwenden (Gewebeproben): Werden Gewebelysate ohne weitere RNA-Aufreinigung direkt in die real time RT-PCR eingesetzt, so kann die Kontroll-RNA (K5) dem PCR Mastermix zupipettiert werden und so als interne RT-PCR-Kontrolle mögliche Inhibitionen aufdecken. Folgen Sie Protokoll B zum Ansetzen der real time RT-PCR. Real time RT-PCR Wichtige Punkte bevor Sie starten: Bitte beachten sie die Wichtigen Hinweise auf Seite 6. Bevor Sie die PCR ansetzen, machen Sie sich mit dem real time PCR Gerät vertraut. Die Programmierung des Temperaturprofils sollte abgeschlossen sein, bevor die PCR angesetzt wird. Beachten Sie, dass in jedem PCR Lauf mindestens eine Positivkontrolle (K3) und eine Negativkontrolle (K4) enthalten sein sollte. Alle Reagenzien - bis auf das Enzym (K2) - müssen komplett aufgetaut, gemischt (Reaktions-Mix (K1) nicht vortexen, sondern durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren mischen) und kurz abzentrifugiert werden. Halten Sie die Reagenzien stetig gekühlt in einem Kühlblock (+2 bis +8 C) oder auf Eis. Seite 8

9 Durchführung Falls die Kontroll-RNA (K5) als Extraktionskontrolle verwendet wird, bitte Protokoll A folgen. Wird die Kontroll-RNA (K5) nur zur Kontrolle einer möglichen Inhibition der real time RT-PCR verwendet (bei direktem Einsatz der Aufschlussüberstände), bitte Protokoll B befolgen. Protokoll A (RNA Extrakte) Die Kontroll-RNA (K5) wurde zur RNA-Extraktion bereits zugegeben (siehe Kontroll-RNA, Seite 7). In diesem Fall wird der Master-Mix in einem Kühlblock bei +2 bis +8 C oder auf Eis gemäß Tabelle 1 angesetzt. Der Master-Mix enthält alle benötigten Komponenten außer der Probe. Setzen Sie für die Gesamtzahl der geplanten PCR-Ansätze mindestens einen Ansatz mehr als benötigt an. Tabelle 1: Herstellung des Master-Mix (Kontroll-RNA (K5) wurde während der RNA-Extraktion zugefügt) Reaktionsvolumen Master-Mix Volumen 20,7 µl Reaktionsmix (K1) 20,7 µl x (N+1) 0,0 µl Kontroll-RNA (K5) 0,0 µl x (N+1) 0,3 µl Enzym (K2) 0,3 µl x (N+1) Protokoll B (Aufschlussüberstände von Gewebeproben) Die Kontroll-RNA (K5) wird ausschließlich zur Kontrolle der real time RT- PCR verwendet (siehe Kontroll-RNA, Seite 7). In diesem Fall wird der Master-Mix in einem Kühlblock bei +2 bis +8 C oder auf Eis gemäß Tabelle 2 angesetzt. Der Master-Mix enthält alle benötigten Komponenten außer der Probe. Setzen Sie für die Gesamtzahl der geplanten PCR-Ansätze mindestens einen Ansatz mehr als benötigt an. Tabelle 2: Herstellung des Master-Mix (die Kontroll-RNA (K5) wird dem Master-Mix beigemischt) Reaktionsvolumen Master-Mix Volumen 20,7 µl Reaktionsmix (K1) 20,7 µl x (N+1) 0,2 µl Kontroll-RNA (K5) 0,2 µl x (N+1)* 0,3 µl Enzym (K2) 0,3 µl x (N+1) *Die durch Zugabe der Kontroll-RNA (K5) verursachte Volumenerhöhung kann vernachlässigt werden. Die Sensitivität des Nachweissystems ist dadurch nicht beeinträchtigt. Seite 9

10 Protokoll A und B: Ansetzen der real time RT-PCR Benötigte Anzahl optischer PCR-Reaktionsgefäße in den Kühlblock stellen. 21 µl des Master-Mix in jedes Gefäß pipettieren. 4 µl der RNA-Eluate bzw. Aufschlussüberstände (inklusive der Eluate der Wasserkontrolle), der Positivkontrolle (K3) und der Negativkontrolle (K4) in die entsprechenden Gefäße hinzupipettieren (Tabelle 3). Die Reaktionsgefäße sofort nachdem die Probe zugefügt wurde verschließen, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren. Tabelle 3: Ansetzen der real time RT-PCR Komponente Volumen Master-Mix 21,0 µl Probe 4,0 µl Gesamtvolumen 25,0 µl Für die real time RT-PCR das in Tabelle 4 beschriebene Temperaturprofil benutzen. Tabelle 4: real time RT-PCR Temperaturprofil 1. Reverse Transkription 20 min 45 C 2. Initiale Denaturierung 5 min 95 C 3. Amplifikation der cdna Anzahl der Zyklen 45 Denaturierung 15 sec 95 C Annealing 40 sec 56 C (Messung am Ende dieses Schrittes) Extension 15 sec 72 C Seite 10

11 Interpretation der Ergebnisse Die BVDV-spezifische Amplifikation wird im FAM-Kanal detektiert. Die Amplifikation der Kontroll-RNA (K5) wird im VIC /HEX/JOE TM /TET-Kanal gemessen. Folgende Ergebnisse können auftreten: Im FAM-Kanal wird ein Signal detektiert: Das Ergebnis ist positiv, die Probe enthält BVDV-RNA. In diesem Fall ist die Detektion eines Signals im VIC /HEX/JOE TM /TET- Kanal nicht notwendig, da eine hohe BVDV cdna-konzentration zu einem verminderten bzw. fehlenden Fluoreszenzsignal der Kontroll- RNA führen kann (Kompetition). Im FAM-Kanal wird kein Signal detektiert, jedoch im VIC /HEX/JOE TM / TET-Kanal: Das Ergebnis ist negativ, die Probe enthält keine BVDV-RNA. Das detektierte Signal der Kontroll-RNA (K5) schließt die Möglichkeit einer fehlerhaften RNA-Extraktion aus (falls die Kontroll-RNA (K5) als Extraktionskontrolle benutzt wurde). Außerdem sind weder die Reverse Transkription noch die PCR komplett inhibiert. Unterscheidet sich der C T -Wert der internen Kontrolle der Wasserkontrolle stark von dem der Probe, so liegt eine teilweise Inhibition vor, die dazu führen kann, dass schwach positive Proben nicht erkannt werden (siehe Troubleshooting, Seite 13). Weder im FAM- noch im VIC /HEX/JOE TM /TET-Kanal wird ein Signal detektiert: Es kann keine diagnostische Aussage getroffen werden. Die real time RT-PCR wurde inhibiert, oder es trat ein Fehler bei der RNA-Extraktion auf. Wurde die Kontroll-RNA (K5) während der RNA- Extraktion zugefügt und nicht direkt in den PCR Master-Mix, dann ist die Negative Kontrolle (K4) in beiden Kanälen negativ. Seite 11

12 Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen Beispiel für positive und negative real time PCR Ergebnisse. Positive Probe Negative Probe Abb 1: Die positive Probe zeigt eine starke Amplifikation im BVDV-spezifischen FAM-Kanal, während bei der negativen Probe kein Fluoreszenzsignal detektiert wird. Negative Probe Positive Probe Abb. 2: Im VIC /HEX/JOE TM /TET-Kanal zeigen sowohl die positive als auch die negative Probe ein Signal auf. In diesem Fall liegt keine Inhibition der real time RT-PCR vor, auch verlief die RNA-Extraktion erfolgreich. Die negative Probe ist somit als tatsächlich negativ zu werten. Seite 12

13 Troubleshooting Der folgende Troubleshooting Guide soll bei eventuell auftretenden Problemen mit der real time RT-PCR behilflich sein. Sollten Sie weitere Fragen haben wenden Sie sich bitte an unsere Wissenschaftler unter Kein Fluoreszenzsignal im FAM-Kanal der Positivkontrolle (K3) Der gewählte Kanal entspricht nicht dem im Protokoll angegebenen Wählen Sie den FAM-Kanal für die Analyse der BVDV-spezifischen Amplifikation und den VIC /HEX/JOE TM /TET-Kanal für die Amplifikation der Kontroll-RNA. Fehlerhaftes Ansetzen der real time RT-PCR Überprüfen Sie Ihre Arbeitsschritte und vergleichen Sie diese mit den in Durchführung auf den Seiten 9-10 beschriebenen. Fehlerhaftes real time RT-PCR Temperaturprofil Vergleichen Sie das Temperaturprofil mit dem Protokoll (Tabelle 4, Seite 10). Falsche Lagerbedingungen des Kits oder abgelaufenes Haltbarkeitsdatum Überprüfen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatumauf dem Kitetikett. Falls nötig, benutzen Sie einen neuen Kit und lagern Sie alle Komponenten wie auf Seite 3 unter Transport und Lagerung beschrieben. Schwaches oder kein Signal der Kontroll-RNA (K5) und gleichzeitiges Ausbleiben eines Signals im FAM-Kanal Die real time RT-PCR-Bedingungen stimmen nicht mit den im Protokoll beschriebenen überein Überprüfen Sie die real time RT-PCR-Bedingungen (Seite 9-10). real time RT-PCR Inhibition Stellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Extraktionsmethode benutzen (siehe Probenvorbereitung, Seite 6-7) und beachten Sie die Herstellerangaben. Stellen Sie sicher, dass ethanolhaltige Waschpuffer vollständig entfernt wurden (ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt bei hoher Geschwindigkeit vor der RNA Elution wird empfohlen). Gewebeproben sollten in einem geeigneten Verdünnungspuffer (z.b NukEx Universal Verdünnungspuffer, gerbion Art.Nr. G01014) verdünnt werden, bevor sie erneut in die real time RT-PCR eingesetzt werden. Seite 13

14 Verlust der RNA während des Aufarbeitungsprozesses Falls die Kontroll-RNA (K5) vor der Extraktion zugefügt wurde, kann das Ausbleiben des Signals auf eine fehlerhafte RNA-Extraktion hinweisen. Stellen Sie sicher, dass sie eine geeignete Extraktionsmethode verwenden (kommerziell erhältliche Kits werden empfohlen). Halten Sie sich an das Herstellerprotokoll. Falsche Lagerbedingungen des Kits oder abgelaufenes Haltbarkeitsdatum Überprüfen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatum auf dem Kitetikett. Falls nötig, benutzen Sie einen neuen Kit und lagern Sie alle Komponenten wie auf Seite 3 unter Transport und Lagerung beschrieben. Detektion eines Signals im FAM-Kanal der Negativkontrolle (K4) Kontamination des real time RT-PCR Ansatzes Wiederholen Sie die real time RT-PCR in Replikaten. Falls das Ergebnis der Wiederholungen negativ sein sollte, so ereignete sich die Kontamination während der Befüllung der Reaktionsgefäße. Stellen Sie sicher, dass Sie die Positivkontrolle (K3) zuletzt pipettieren und verschließen Sie die Reaktionsgefäße sofort nachdem Sie die jeweilige Probe zugegeben haben. Falls die Negativkontrolle (K4) in der Wiederholung wieder ein Signal im FAM-Kanal ergibt, deutet dies darauf hin, dass eine oder mehrere Kitkomponenten kontaminiert sind. Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsbereiche und die Geräte regelmäßig dekontaminiert werden. Wiederholen Sie die real time RT-PCR mit einem neuen Kit. Seite 14

15 Index Components... 2 Abbreviations... 2 Transport and Storage... 2 Intended Use... 2 Sample Material... 3 Quality Control... 3 Product Warranty... 3 Introduction... 3 Principle of the Test... 3 Equipment and Reagents to be Supplied by User... 4 Important Notes... 4 Isolation of Viral RNA... 5 Pooling of Samples... 6 Control RNA... 6 Real time RT-PCR... 7 Procedure... 7 Data Analysis Troubleshooting... 12

16 Components The reagents supplied are sufficient for 100 reactions. Labelling Lid Colour Content K1 Reaktionsmi x yellow 2 x 1035 µ l K2 Enzym blue 1 x 30 µ l K3 Positivkontroll e red 1 x 100 µ l K4 Negativkontroll e green 1 x 100 µ l K5 Kontrol-RN A red 2 x 240 µ l Abbreviations BVDV Bovine Virus Diarrhea Virus BVD Bovine Virus Diarrhea RNA Ribonucleid Acid PCR Polymerase Chain Reaktion RT Reverse Transcription cdna complementary Desoxyribonucleid Acid Transport and Storage The virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit is shipped on dry ice. All components must be stored at -18 C in the dark immediately after receipt. Do not use reagents after the date of expiry printed on the package. After initial usage, reagents are stable for up to six months. Avoid repeated thawing/freezing of the reagents, if necessary aliquot kit components K1, K3 and K5. Intended Use The virellabvdv 2.0 real time RT-PCR is an assay for the detection of BVDV RNA in in single or pooled samples of bovine EDTA-blood, plasma, serum and tissue samples (ear notches). All known bovine types of BVD Virus are detected. page 2

17 Sample Material Starting material for the virellabvdv 2.0 real time RT-PCR is BVDV RNA isolated from bovine tissue samples (ear notches), EDTA blood, plasma, and serum. Pools of 50 samples are possible for all types of samples from which RNA is being isolated. For crude tissue lysates (e.g. ear notch samples) pools of 24 samples are possible. Reasonable pool sizes are dependent on the prevalence of BVDV in the area the samples originate from and the age of the animals tested. Quality Control In accordance with gerbion s ISO-certified Quality Management System, each lot of the virellabvdv 2.0 real time PCR Kit is tested against predetermined specifications to ensure consistent product quality. Product Warranty gerbion guarantees the performance of all products when used according to the instructions given in the Instruction Manual. The purchaser must determine the suitability of the product for its particular use. Should any product fail to perform satisfactorily due to any reason other than misuse, gerbion will replace it free of charge or refund the price. We reserve the right to change, alter, or modify any product to enhance its performance and design. Introduction Year after year, infections with Bovine Virus Diarrhea Virus (BVDV) cause severe economic losses in the dairy and meat industry. The BVD Virus can cause spontanious aborts or, if transmitted transplacentally to the fetus, lead to persistently infected (PI) animals. The identification of such PI animals is crucial for the elimination of sources of reinfection. BVDV also is causative agent of Mucosal Disease (MD). Principle of the Test The virellabvdv 2.0 real time RT PCR Kit contains specific primers and hydrolysis probes for the detection of BVDV RNA in single and pooled bovine samples such as EDTA-blood, plasma, serum after RNA extraction and ear notch samples after tissue lysis. The reverse transcription (RT) of viral RNA to cdna and the subsequent amplification of BVDV specific fragments are performed in a one-step RTpage 3

18 PCR. The amplification can be detected when specific probes are hydrolysed by the Polymerase. The emitted fluorescence is measured in the FAM channel. Furthermore, the virellabvdv 2.0 real time PCR Kit contains a Control RNA (K5), which is detected in a second amplification system. Added during the extraction (e.g. of blood samples), the Control RNA (K5) allows not only for the detection of RT-PCR inhibition but also detects possible mistakes during RNA extraction. When using crude lysates without further RNA purification (e.g. ear notches), the Control RNA (K5) can be added to the PCR Mix directly in order to detect possible inhibition of the real time RT-PCR. Usage of the Control RNA (K5) greatly reduces the risk of false-negative results. The fluorescence of the Control RNA (K5) is measured in the VIC / HEX/JOE TM /TET channel. Equipment and Reagents to be Supplied by User for blood samples: RNA isolation kit for tissue samples: lysis reagent dh 2 O sterile microtubes pipets (adjustable volume) sterile pipet tips with filter table centrifuge vortexer incubator real time PCR instrument (e.g. Eco, Illumina) optical PCR reaction tubes with list optional: Liquid handling system for automation Important Notes The virellabvdv 2.0 real time RT-PCR must be performed by qualified personnel. Good Laboratory Practice (GLP) has to be applied. Clinical samples must always be regarded as potentially infectious material and all equipment used has to be treated as potentially contaminated. page 4

19 General Precautions Stick to the protocol described in the Instruction Manual. Set up different laboratory areas for the preparation of samples and for the set up of the RT-PCR in order to avoid contaminations. Pipettes, tubes and other materials must not circulate between those different laboratory areas. The Enzyme (K2) is liquid even at -18 C. Take it out of the freezer shortly before usage and put it back immediately. Always use filter tips. Regulary decontaminate equipment and benches with ethanohol-free decontaminant. Do not combine virellabvdv 2.0 real time RT-PCR Kit components of different lot numbers. Isolation of Viral RNA The virellabvdv 2.0 real time RT-PCR is suitable for the analysis of single or pooled BVDV RNA samples extracted from EDTA blood, plasma and serum and single or pooled BVDV RNA released from ear notch samples using suitable isolation/lysis methods. Commercially available kits for RNA isolation are recommended: For the extraction of RNA from EDTA blood, plasma, serum, e.g.: ZR Viral RNA Kit (Zymo Research) High Pure Viral RNA Kit (Roche Diagnostics) RNeasy Mini Kit (Qiagen) For the release of RNA from tissue samples (ear notches), e.g.: NukEx Nucleic Acid Release Reagent (gerbion) Important: In addition to the samples always run a water control (ultra pure water) in your extraction. Treat this water control analogous to a sample. Comparing the amplification of the Control RNA (K5) in the samples to the amplification of the internal control in the water control will give insights on possible inhibitions of the real time RT-PCR. Furthermore, possible contaminations during RNA extraction will be detectable. When analysing crude tissue lysates an additional lysis reagent control should be included in the real time RT-PCR. Please note the chapter Control RNA on page 6. page 5

20 If the real time RT-PCR is not performed immediately, store extracted RNA according to the instructions given by the RNA extraction kit s manufacturer. Further information about RNA isolation is to be found in the extraction kit manual or from the extraction kit manufacturer s technical service. Pooling of samples EDTA-blood samples, serum- and plasma samples Combine equivalent aliquots (e.g. 100 µl each) of up to 50 single samples, mix gently on a vortex, isolate RNA. Tissue samples (ear notches) Combine equivalent aliquots (e.g. 10 µl each) of up to 24 single samples, mix gently on a vortex. Note: Remains of desiccant in tissue samples may inhibit the real time RT-PCR. Crude lysates with a strongly inhibited signal of the internal control should be diluted in an appropriate dilution buffer (e.g. NukEx Universal Dilution Buffer, gerbion Cat.No. G01014) Control RNA A Control RNA (K5) is supplied to be used as extraction control. This allows the user to control the RNA isolation procedure and to check for possible real time RT-PCR inhibition. Control RNA (K5) used as extraction control (blood, plasma, serum etc.): virellabvdv 2.0 Control RNA (K5) is added prior to the RNA extraction. To this end, multiply the buffer volume needed per extraction with the number of samples (including at least one water control) (N) plus 1 to compensate for inaccuracies in pipetting (N+1). Add 5 µl Control RNA (K5) per extraction (5 µl x (N+1)). Mix well. Perform the RNA isolation according to the manufacturer s instructions. Zymo ZR Viral RNA-Kit: Add 5 µl of Control RNA (K5) to the Viral RNA Buffer prior to adding the sample. Roche High Pure Viral RNA-Kit: Add 5 µl of Control RNA (K5) to the working-solution. If the extraction protocol includes an incubation step of the sample in the first buffer, the Control RNA (K5) is to be added to each sample individually after incubation. page 6

21 The Control RNA (K5) must not be added to the sample material directly. Follow protocol A for the set up of the real time RT-PCR. Control RNA (K5) used as Internal Control for the real time RT-PCR (crude tissue lysates): When using crude tissue lysates without further purification of the RNA, the Control RNA (K5) can be added to the PCR Master Mix directly in order to detect possible inhibition in the real time RT-PCR. Follow protocol B for the set up of the real time RT-PCR. Real time RT-PCR Important Points Before Starting: Please pay attention to the Important Notes on page 4. Before setting up the real time PCR familiarise yourself with the real time PCR instrument and read the user manual supplied with the instrument. The programming of the thermal profile should take place before the PCR set up. In every PCR run at least one Positive Control (K3) and one Negative Control (K4) should be included. Before each use, all reagents - except the Enzyme (K2) - should be thawed completely at room temperature, thouroughly mixed (do NOT vortex the Reaction Mix (K1) but mix by pipetting up and down repeatedly), and centrifuged very briefly. Then place all reagents on ice or on a cooling block (+2 to +8 C). Procedure If the Control RNA (K5) is used as an extraction control, please follow protocol A. If the Control RNA (K5) is used only to detect possible inhibition/failure of the real time RT-PCR, please follow protocol B. Protocol A (extracted RNA) The Control RNA (K5) was added during the RNA extraction (see Control RNA, page 6). In this case, prepare the Master Mix on ice or in a cooling block (+2 to +8 C) according to Table 1. The Master Mix contains all of the components needed for RT-PCR except the sample. Prepare a volume of Master Mix for at least one sample more than required, in order to compensate for pipetting inaccuracy. page 7

22 Table 1: Preparation of the Master Mix (Control RNA (K5) was added during RNA extraction) Reaction Volume Master Mix Volume 20.7 µl Reaction Mix (K1) 20.7 µl x (N+1) 0.0 µl Control RNA (K5) 0.0 µl x (N+1) 0.3 µl Enzyme (K2) 0.3 µl x (N+1) Protocol B (lysates of tissue samples) The Control RNA (K5) is used for the control of the real time RT-PCR only (see Control RNA, page 8). In this case, prepare the Master Mix on ice or in a cooling block (+2 to +8 C) according to Table 2. The Master Mix contains all of the components needed for real RT-PCR except the sample. Prepare a volume of Master Mix for at least one sample more than required, in order to compensate for pipetting inaccuracy. Table 2: Preparation of the Master Mix (Control RNA (K5) is added directly to the Master Mix) Reaction Volume Master Mix Volume 20.7 µl Reaction Mix (K1) 20.7 µl x (N+1) 0.2 µl Control RNA (K5)* 0.2 µl x (N+1) 0.3 µl Enzyme (K2) 0.3 µl x (N+1) *The increase in volume caused by adding the Control RNA is not taken into account when preparing the PCR assay. The sensitivity of the detection system is not impaired. Protocol A and B: real time RT-PCR set up Put the number of optical PCR reaction tubes needed into the cooling block. Pipet 21 µl of the Master Mix into each optical PCR reaction tube. Add 4 µl of RNA eluates (including the eluate of the water control) or crude tissue lysates, the Positive Control (K3), and the Negative Control (K4) to the corresponding optical PCR reaction tube (Table 3). Close the optical PCR reaction tubes immediately after filling in order to reduce the risk of contamination. Table 3: Preparation of the real time PCR Component Volume Master Mix 21.0 µl Sample 4.0 µl Total volume 25.0 µl page 8

23 For the real time RT-PCR use the thermal profile shown in Table 4. Table 4: real time RT-PCR thermal profile 1. Reverse Transcription 20 min 45 C 2. Initial Denaturation 5 min 95 C 3. Amplification of cdna Number of cycles 45 Denaturation 15 sec 95 C Annealing 40 sec 56 C (Aquisition at the end of this step) Extension 15 sec 72 C page 9

24 Data Analysis The BVDV-specific amplification is measured in the FAM channel. The amplification of the Control RNA (K5) is measured in the VIC /HEX/JOE TM / TET channel. Following results can occur: A signal in the FAM channel is detected: The result is positive, the sample contains BVDV RNA. In this case, detection of a signal of the Control RNA (K5) in the VIC / HEX/JOE TM /TET channel is inessential, as high concentrations of BVDV cdna may reduce or completely inhibit amplification of the Control RNA (K5). No signal in the FAM channel, but a signal in the VIC /HEX/JOE TM /TET channel is detected: The result is negative, the sample does not contain BVDV RNA. The signal of the Control RNA (K5) excludes the possibilities of RNA isolation failure (in case the Control RNA (A5) is being used as an extraction control) and/or real time RT-PCR inhibition. If the C T value of a sample differs significantly from the C T value of the water control, a partial inhibition occured, which can lead to negative results in weak positive samples (see Troubleshooting, page 12). Neither in the FAM nor in the VIC /HEX/JOE TM /TET channel a signal is detected: A diagnostic statement cannot be made. The RNA isolation was not successful or an inhibition of the RT-PCR has occurred. In case the Control RNA (K5) was added during RNA isolation and not directly to the PCR Master Mix, the Negative Control (K4) is negative in both channels. page 10

25 Figure 1 and Figure 2 show examples for positive and negative real time RT-PCR results. Positive sample Negative sample Figure 1: The positive sample shows BVDV-specific amplification in the FAM channel, whereas no fluorescence signal is detected in the negative sample. Negative sample Positive sample Figure 2: The positive sample as well as the negative sample show a signal in the Control RNA-specific VIC /HEX/JOE TM /TET channel. The amplification signal of the Control RNA (K5) in the negative sample shows, that the missing signal in the BVDV-specific FAM channel is not due to RT-PCR inhibition or failure of RNA isolation, but that the sample is a true negative. page 11

26 Troubleshooting The following troubleshooting guide is included to help you with possible problems that may arise when performing a real time RT-PCR. If you have further questions, please do not hesitate to contact our scientists on info@gerbion.com. No fluorescence signal in the FAM channel of the Positive Control (K3) The selected channel for analysis does not comply with the protocol Select the FAM channel for analysis of the BVDV-specific amplification and the VIC /HEX/JOE TM /TET channel for the amplification of the Control RNA (K5). Incorrect configuration of the real time RT-PCR Check your work steps and compare with Procedure on pages 7-9. The programming of the thermal profile is incorrect Compare the thermal profile with the protocol (Table 4, page 9). Incorrect storage conditions for one or more kit components or kit expired Check the storage conditions and the date of expiry printed on the kit label. If neccessary, use a new kit and make sure kit components are stored as described in Transport and Storage, page 2. Weak or no signal of the Control RNA (K5) and simultaneous absence of a signal in the BVDV-specific FAM channel real time RT-PCR conditions do not comply with the protocol Check the real time RT-PCR conditions (page 7-9). real time RT-PCR inhibited Make sure that you use an appropriate isolation method (see Isolation of Viral RNA, page 5) and follow the manufacturer s instructions. Make sure that the ethanol-containing washing buffer of the isolation kit has been completely removed. An additional centrifugation step at high speed is recommended before elution of the RNA. Crude tissue lysates should be diluted in an appropriate dilution buffer (e.g. NukEx Universal Dilution Buffer, gerbion Cat. No. G01014) before re-testing. page 12

27 RNA loss during isolation process In case the Control RNA (K5) was added before extraction, the lack of an amplification signal can indicate that the RNA isolation was not successful. Make sure that you use an appropriate isolation method (commercial kits are recommended) and stick to the manufacturer s protocol. Incorrect storage conditions for one or more components or kit expired Check the storage conditions and the date of expiry printed on the kit label. If neccessary, use a new kit and make sure kit components are stored as described in Transport and Storage, page 2. Detection of a fluorescence signal in the FAM channel with the Negative Control (K4) Contamination during preparation of the RT-PCR Repeat the real time RT-PCR in replicates. If the result is negative in the repetition, the contamination occured when the samples were pipetted into the optical PCR reaction tubes. Make sure to pipet the Positive Control (K3) last and close the optical PCR reaction tube immediately after adding the sample. If the same result occurs, one or more of the kit components might be contaminated. Make sure that work space and instruments are decontaminated regularly. Use a new kit and repeat the real time RT-PCR. page 13