LaktaseCheck real time PCR Kit

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1 Gebrauchsinformation Instruction Manual Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit Test zum Nachweis des C/T (-13910) Polymorphismus in der regulatorischen Region des Laktasegens beim Menschen. Test for the analysis of the C/T polymorphism at position within the regulatory region of the lactase gen in man. G GmbH & Co. KG Remsstr. 1 D Kornwestheim Germany phone: Fax: info@gerbion.com Version 1.8/

2 Inhaltsverzeichnis Komponenten... 3 Abkürzungen... 3 Transport und Lagerung... 3 Anwendungszweck... 4 Art und Beschaffenheit des Probenmaterials... 4 Qualitätskontrolle... 4 Produktgewährleistung... 4 Einleitung... 4 Testprinzip... 5 Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte... 5 Wichtige Hinweise... 5 Probenvorbereitung... 6 Real time PCR... 7 Schmelzkurvenanalyse... 9 Troubleshooting... 10

3 Komponenten Die Komponenten sind ausreichend für den Ansatz von 96 Nachweisreaktionen. Bezeichnung Deckelfarbe Inhalt K1 Enzyme blau 3 x 4 µ l K2 Enzyme Buffer blau 3 x 60 µ l K3 Primer-Probe Mix gelb 2 x 700 µ l K4 Positive Control Genotype T/T (tolerant) rot 1 x 50 µ l K5 Positive Control Genotype C/C (intolerant) rot 1 x 50 µ l K6 Negative Control grün 1 x 50 µ l K7 MgCl 2 klar 1 x 160 µ l Abkürzungen DNA Desoxyribonukleinsäure PCR Polymerase Ketten Reaktion Transport und Lagerung Der Transport des Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit erfolgt gefroren auf Trockeneis. Alle Komponenten des Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit sind direkt nach Erhalt bei -18 C lichtgeschützt zu lagern. Nach Ablauf des auf der Packung angegebenen Haltbarkeitsdatums nicht mehr verwenden! Mehrmaliges Auftauen und Einfrieren (> zweimal) der Reagenzien vermeiden, da dadurch die Sensitivität verringert werden kann. Gegebenenfalls sollten der Primer-Sonden- Mix (K3) und die Positivkontrollen (K4 und K5) aliquotiert werden. Seite 3

4 Anwendungszweck Der Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit dient dem Nachweis des C/T (-13910) Polymorphismus in der regulatorischen Region des Laktasegens mit Hilfe von real time Detektion im Kapillarsystem des LightCyclers 1.5 oder 2.0 (Roche). Art und Beschaffenheit des Probenmaterials Das Ausgangsmaterial für die Nachweisreaktion ist genomische DNA, die aus Wangenschleimhautabstrichen oder EDTA-Blut isoliert wurde. Qualitätskontrolle In Übereinstimmung mit dem ISO-zertifizierten Qualitätsmanagementsystem der gerbion GmbH & Co. KG wird jede Charge des Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit gegen vorgegebene Spezifikationen getestet, um eine einheitliche Produktqualität zu gewährleisten. Produktgewährleistung Diese Gebrauchsinformation gilt als vollständig und richtig zum Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung. Die gerbion GmbH & Co. KG haftet keinesfalls für Neben- oder Folgeschäden, die sich im Zusammenhang mit oder in der Folge der Benutzung dieser Gebrauchsinformation ergeben. gerbion garantiert die volle Funktionsfähigkeit wenn die Durchführung entsprechend der in der Gebrauchsanweisung gegebenen Anleitung erfolgt. Der Käufer muss selbst bestimmen, ob das Produkt für seine spezielle Anwendung geeignet ist. gerbion behält sich das Recht vor, Produkte jederzeit zu modifizieren, um die Funktionalität oder das Design zu verbessern. Einleitung In Mitteleuropa sind ca. 15 bis 20 % der Bevölkerung von einer primären Laktoseunverträglichkeit betroffen. Hauptursache ist ein C/T-Polymorphismus an Position in der regulatorischen Region des Laktasegens. Bei Menschen, die auf beiden Allelen ein C statt des T tragen, kommt es mit fortschreitendem Alter (oft ab ca. 20 Jahren) zur Manifestierung des Enzymmangels. Laktosemoleküle gelangen nun ungespalten in den Dickdarm, wo sie von Darmbakterien vergoren werden. Dies verursacht die typischen Symptome der Laktoseintoleranz: Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, Durchfall und Blähungen. Seite 4

5 Testprinzip Der Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit enthält spezifische Primer und Fluoreszenzfarbstoff-markierte Sonden für den Nachweis des C/T- (-13910) Polymorphismus in der regulatorischen Region des Laktasegens. Mit Hilfe der spezifischen Primer wird die Zielsequenz amplifiziert. Die unterschiedliche Bindungsaffinität der Hybridisierungssonden erlaubt in der Schmelzkurvenanalyse die Unterscheidung der verschiedenen Genotypen. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt im F2 Kanal des LightCycler 1.5 oder 2.0. Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte DNA Extraktionskit Pipetten (variable Volumina) sterile Pipettenspitzen mit Filter Tischzentrifuge Vortexer real time PCR Gerät (LightCycler 1.5 oder 2.0 ) Kapillaren Color Compensation Kit Optional: Pipettiergeräte zur Automation Wichtige Hinweise Die Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR muss in für diesen Zweck geeigneten Laboratorien und von speziell geschultem Personal durchgeführt werden. Die Richtlinien der Good Laboratory Practice (GLP) sind einzuhalten. Alle Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit den Proben in Berührung kommenden Gegenstände müssen als potentiell kontaminiert erachtet werden. Allgemeine Hinweise Die Anweisungen der Gebrauchsinformation sind einzuhalten. Areale für die Probenvorbereitung und den Ansatz des PCR- Master-Mix sollten strikt getrennt sein. Pipetten, Röhrchen und andere Arbeitsmaterialien dürfen nicht von einem Bereich in den anderen zirkulieren. Immer Pipettenspitzen mit Filter verwenden. Seite 5

6 Pipetten und Arbeitsflächen regelmäßig mit geeigneter Dekontaminationslösung reinigen (keine ethanolhaltigen Mittel). Komponenten verschiedener Chargen des Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit dürfen nicht zusammen verwendet werden. Probenvorbereitung Für die Durchführung der Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR wird genomische DNA benötigt, die mit geeigneten Methoden isoliert wurde. Es wird empfohlen dazu kommerziell erhältliche Extraktionskits zu verwenden, z.b. : NukEx Pure RNA/DNA Kit (gerbion, Art. Nr. G05004) Weitere Informationen zur DNA-Isolation erhalten Sie in der Gebrauchsinformation des Extraktionskits oder vom technischen Service des Extraktionskit Herstellers. Wichtig: Unabhängig vom verwendeten Probenmaterial sollte zusätzlich zu den Proben eine Wasserkontrolle (Reinstwasser) extrahiert werden, anhand derer sich eventuell auftretende Kontaminationen ablesen lassen. Diese Wasserkontrolle muss analog einer Probe behandelt werden. Falls die real time PCR nicht sofort durchgeführt wird, müssen die DNA- Extrakte entsprechend der Angaben des DNA-Extraktionskit Herstellers aufbewahrt werden. Real time PCR Wichtige Punkte bevor Sie starten: Beachten Sie bitte die Wichtigen Hinweise auf Seite 6. Bevor Sie die real time PCR ansetzen machen Sie sich mit dem real time PCR Gerät vertraut. Die Programmierung des Temperaturprofils sollte abgeschlossen sein, bevor die real time PCR angesetzt wird. Beachten Sie, dass in jedem PCR Lauf mindestens eine Positivkontrolle Genotyp T/T tolerant (K4), eine Positivkontrolle Genotyp C/C intolerant (K5), und eine Negativkontrolle (K6) enthalten sein sollten. Alle Reagenzien, bis auf das Enzym, müssen komplett aufgetaut, gevortext und kurz abzentrifugiert werden. Halten Sie die Reagenzien stets gekühlt auf Eis oder in einem Kühlblock ( C). Durchführung Seite 6

7 Der Master-Mix enthält alle für die PCR benötigten Komponenten außer der Probe. Setzen Sie für die Gesamtzahl der geplanten PCR-Ansätze mindestens einen Ansatz mehr als benötigt an, um Pipettierungenauigkeiten auszugleichen. WICHTIG: Bevor Sie den Master-Mix ansetzen, müssen Sie zunächst den Enzym-Puffer (K2) mit dem Enzym (K1) mischen, um den gebrauchsfertigen Enzym-Mix zu erhalten. Herstellung des Enzym-Mix: Überführen Sie den kompletten Inhalt eines Röhrchens Enzym-Puffer (K2) in ein Enzym-Röhrchen (K1). Mischen Sie gut durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren. Den Enzym-Mix stets gekühlt auf Eis oder in einem Kühlblock halten ( C). Tabelle 1: Herstellung des Master-Mix Reaktionsvolumen Master-Mix Volumen 14,4 µl Primer-Sonden-Mix (K3) 14,4 µl x (N+1) 1,6 µl MgCl 2 (25mM) (K7) 1,6 µl x (N+1) 2,0 µl Enzym-Mix (K1+K2) 2,0 µl x (N+1) Benötigte Anzahl Kapillaren in den Kapillarenkühlblock stellen. 18 µl des Master-Mix in jede Kapillare pipettieren. 2 µl der DNA-Extrakte, der Positivkontrollen und der Negativkontrolle in die entsprechenden Kapillaren pipettieren und Kapillaren sofort nach Zugabe der Probe verschließen, um Kontaminationen zu vermeiden. Kapillaren bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren, um die Flüssigkeit im unteren Teil der Kapillaren zu sammeln. Tabelle 2: Ansetzen der PCR Komponente Volumen Master-Mix 18,0 µl Probe 2,0 µl Gesamtvolumen 20,0 µl Für die real time PCR und die anschließende Schmelzkurvenanalyse das in Tabelle 3 beschriebene Temperaturprofil benutzen. Seite 7

8 Tabelle 3: real time PCR Temperaturprofil 1. Initiale Denaturierung 10 min 95 C 2. Amplifikation der DNA Anzahl der Zyklen 45 Denaturierung 10 sec 95 C Annealing 10 sec 55 C (aquisition mode: SINGLE) Extension 25 sec 72 C Ramping time bei allen Schritten 20 C/sec 3. Schmelzkurve 0 sec 95 C Ramping time 20 C/sec Aquisition mode: none 5 sec 50 C Ramping time 20 C/sec Aquisition mode: none 0 sec 80 C Ramping time 0,1 C/sec Aquisition mode: cont. 4. Kühlung 30 sec 40 C Aktivieren Sie den Color Compensation File (CCC) Schmelzkurvenanalyse Seite 8

9 Für die Schmelzkurvenanalyse müssen folgende Einstellungen gewählt werden: Digital filter: enabled Degrees to average: 9-10 Die Ergebnisse der Schmelzkurvenanalysen für den C/T (-13910) Polymorphismus sind in Kanal F2/F1 zu sehen. Abbildung 1 zeigt die Schmelzkurven von homozygoten und heterozygoten Proben. Positivkontrolle Genotyp T/T (tolerant) Positivkontrolle C/C (intolerant) Patientenprobe (heterozygoter Genotyp C/T) Abbildung 1: Die Peaks der Schmelzkurven liegen bei ca. 56,5 C für den Genotyp T/T, ca. 63,5 C für den Genotyp C/C. Heterozygote Proben (Genotyp C/T) weisen bei beiden Temperaturen Peaks auf. Seite 9

10 Troubleshooting Der folgende Troubleshooting Guide soll bei eventuell auftretenden Problemen mit der real time PCR behilflich sein. Sollten Sie weitere Fragen haben, wenden Sie sich bitte an unsere Wissenschaftler unter Kein Fluoreszenzsignal bei den Positivkontrollen (K4 und K5) Der gewählte Kanal entspricht nicht dem im Protokoll angegebenen Wählen Sie den F2/F1 Kanal für die Ansicht der Amplifikationskurven sowie für die Schmelzkurvenanalyse. Fehlerhaftes Ansetzen der real time PCR Überprüfen Sie Ihre Arbeitsschritte und vergleichen Sie diese mit dem in Durchführung auf den Seiten 7-8 beschriebenen. Fehlerhaftes real time PCR Temperaturprofil Vergleichen Sie das Temperaturprofil mit dem Protokoll (Tabelle 3, Seite 8). Falsche Lagerbedingungen des Kits, oder abgelaufenes Haltbarkeitsdatum Überprüfen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatum auf dem Kitetikett. Falls nötig, benutzen Sie einen neuen Kit und lagern Sie alle Komponenten wie auf Seite 3 unter Transport und Lagerung beschrieben. Detektion eines Fluoreszenzsignals in der Negativkontrolle (K6) Kontamination des real time PCR Ansatzes Wiederholen Sie die real time PCR in Replikaten. Falls das Ergebnis der Wiederholungen negativ sein sollte, so ereignete sich die Kontamination während der Befüllung der Kapillaren. Stellen Sie sicher, dass Sie die Positivkontrolle zuletzt pipettieren und verschließen Sie die Kapillaren sofort nachdem Sie die jeweilige Probe zugegeben haben. Falls die Negativkontrolle in der Wiederholung wieder ein Signal im F2/F1 Kanal ergibt, deutet dies auf eine Kontamination eines oder mehrerer Kitkomponenten hin. Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsbereiche und die Geräte regelmäßig dekontaminiert werden. Wiederholen Sie die PCR mit einem neuen Kit. Seite 10

11 Die Proben weisen kein Fluoreszensignal im F2/F1 Kanal auf PCR Inhibition Stellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Extraktionsmethode benutzen (siehe Probenvorbereitung, Seite 6) und beachten Sie die Herstellerangaben. Stellen Sie sicher, dass ethanolhaltige Waschpuffer vollständig entfernt wurden (ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt bei hoher Geschwindigkeit vor der DNA-Elution wird empfohlen). Verlust der DNA während des Aufarbeitungsprozesses Stellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Extraktionsmethode benutzen (siehe Probenvorbereitung, Seite 6) und beachten Sie die Herstellerangaben. Die Peaks der Schmelzkurven der Probe liegen nicht im Temperaturbereich der Kontrollpeaks (T/T: 56,5 C +/- 1 C; C/C: 63,5 C +/- 1 C) Vorhandensein eines weiteren Polymorphismus im amplifizierten Bereich Liegt in der von den Sonden abgedeckten Region ein weiterer Polymorphismus vor, so kann dieser zu einer Verschiebung der Schmelzkurven führen. Dies kann vor allem bei Personen nicht-kaukasischer Abstammung der Fall sein. Eine sichere diagnostische Aussage ist in diesem Fall nicht möglich. Es wird empfohlen, zur Absicherung einen Atemtest durchzuführen. Seite 11

12 Index Components... 2 Abbreviations... 2 Transport and Storage... 2 Intended Use... 2 Sample Material... 3 Quality Control... 3 Product Warranty... 3 Introduction... 3 Principle of the Test... 3 Equipment and Reagents to be Supplied by User... 4 Important Notes... 4 Preparation of Samples... 5 Real time PCR... 5 Analysis of Melting Curves... 8 Troubleshooting... 9 page 1

13 Components The reagents supplied are sufficient for 96 reactions. Labelling Lid Colour Content K1 Enzyme blue 3 x 4 µ l K2 Enzyme Buffer blue 3 x 60 µ l K3 Primer-Probe Mix yellow 2 x 700 µ l K4 Positive Control Genotype T/T (tolerant) red 1 x 50 µ l K5 Positive Control Genotype C/C (intolerant) red 1 x 50 µ l K6 Negative Control green 1 x 50 µ l K7 MgCl 2 clear 1 x 160 µ l Abbreviations DNA Desoxyribonucleic Acid PCR Polymerase Chain Reaction Transport and Storage The Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit is shipped on dry ice. All components must be stored at -18 C in the dark immediately after receipt. Do not use reagents after the date of expiry printed on the package. The reagents should not be thawed and frozen more than 2 times. If so, the Primer-Probe Mix (K3) and Positive Controls (K4 and K5) have to be aliquoted. Intended Use The Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit detects the C/T (-13910) polymorphism within the regulatory region of the lactase gene using real time detection in the capillary system of the LightCycler 1.5 or 2.0 (Roche). page 2

14 Sample Material Sample material to be detected is genomic DNA, isolated from a buccal (cheek) swab or from EDTA blood. Quality Control In accordance with gerbion s ISO certified Quality Management System, each lot of the Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit is tested against predetermined specifications to ensure consistent product quality. Product Warranty gerbion guarantees the performance of all products when used according to the instructions given in the instruction manual. The purchaser must determine the suitability of the product for its particular use. Should any product fail to perform satisfactorily due to any reason other than misuse, gerbion will replace it free of charge or refund the price. We reserve the right to change, alter, or modify any product to enhance its performance and design. Introduction About 15 to 20% of the population in Central Europe suffer from a primary lactose intolerance. This is mainly due to a C/T polymorphism at position within the regulatory region of the lactase gene. Individuals carrying C instead of T on both alleles develop a manifestation of a lactase deficiency with aging (often around the age of 20). In the absence of lactase, lactose remains uncleaved and passes intact into the colon, where the lactose is fermented by the bacteria in the large intestine, causing the typical symptoms of lactose intolerance: abdominal pain, nausea, diarrhea and flatulence. Principle of the Test The Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit contains specific primers and hybridization probes for the analysis of the C/T polymorphism at position within the regulatory region of the lactase gene. The specific primers allow the amplification of the target sequence. The identification of different genotypes in each single sample is characterized by melting curve analysis determining the binding affinity page 3

15 of the hybridization probe to the DNA template. The fluorescence is measured in the F2 channel (LightCycler 1.5 or 2.0). Equipment and Reagents to be Supplied by User DNA isolation kit Sterile microtubes Pipets (adjustable volume) Sterile pipet tips with filter Table centrifuge Vortexer real time PCR instrument (LightCycler 1.5 or 2.0 ) Capillaries Color Compensation Kit Optional: Liquid handling system for automation Important Notes The Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR must be performed in adequate laboratories by qualified personnel. Good Laboratory Practice (GLP) has to be applied. Clinical samples must always be regarded as potentially infectious material and all equipment used has to be treated as potentially contaminated. General precautions Stick to the protocol described in the instruction manual. Set up different laboratory areas for the preparation of samples and for the set up of the PCR in order to avoid contaminations. The Enzyme Mix is liquid even at -18 C. Take it out of the freezer shortly before usage and put it back immediately. Pipettes, tubes and other material must not circulate between those different laboratory areas. Always use filter tips. Regulary decontaminate equipment and benches with alcoholfree decontaminant. Do not combine Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR components of different lot numbers. page 4

16 Preparation of Samples For the procedure of the Dr. Schröders LaktaseCheck DNA isolated by adequate methods is needed. Commercially available kits for DNA isolation such as the following are recommended, e.g. : NukEx Pure RNA/DNA Kit (gerbion, Cat. No. G05004) Further information about DNA isolation is to be found in the extraction kit manual or from the extraction kit manufacturer s technical service. Important: In addition to the samples always run a water control in your extraction. Treat this water control analogous to a sample. The water control will show you possible contaminations. If the real time PCR is not performed immediately, store extracted DNA due to the declaration of the manufacturer of the DNA isolation kit. Real time PCR Important points before starting: Please pay attention to the important notes on page 4. Before setting up the PCR familiarise yourself with the real time PCR instrument and read the user manual supplied with the instrument. The programing of the thermal profile should take place before the real time PCR set up. In every PCR run at least one Positive Control Genotype T/T (K4) and Genotype C/C (K5) as well as one Negative Control (K6) should be included. Before each use, all reagents - except the Enzyme - should be thawed completely at room temperature, briefly vortexed, and centrifuged very briefly. Afterwards place all reagents on ice or on a cooling block (+2 to +8 C). Procedure The Master Mix contains all of the components needed for PCR except the sample. Prepare a volume of reaction mix with at least one extra (virtual) sample more than required for the total number of PCR assays to be performed due to the reason of imprecise pipetting. page 5

17 Important: Before pipetting the Master Mix, pipet one vial of Enzyme Buffer (K2) into one vial of Enzyme (K1) to receive the ready to use Enzyme Mix. Preparation of the ready to use Enzyme Mix: Transfer the complete amount of one vial Enzyme Buffer (K2) into one vial of Enzyme (K1). Mix gently by pipetting. Keep the ready to use Enzyme Mix on ice or in a thermal block (+2 to +8 C). Table 1: Preparation of the Master Mix Reaction Volume Master Mix Volume 14.4 µl Primer-Sonden-Mix (K3) 14.4 µl x (N+1) 1.6 µl MgCl 2 (25mM) (K7) 1.6 µl x (N+1) 2.0 µl Enzym-Mix (K1+K2) 2.0 µl x (N+1) Put the number of capillaries needed into the LightCycler Capillary cooling block. Pipet 18 µl of the Master Mix into each capillary. Then add 2 µl of the eluates from the DNA isolation (including the eluate of the water control), the Positive Controls (K4 and K5) and the Negative Control (K6) to the corresponding capillary. Close capillaries immediately after filling in order to reduce the risk of contamination. Table 2: Preparation of the PCR Component Volume Master Mix 18.0 µl Sample 2.0 µl Total volume 20.0 µl Centrifuge capillaries at low speed to collect the prepared reaction volume in the bottom of the capillary. For the real time PCR and the following analysis of the melting curves use the thermal profile shown in Table 3. Table 3: real time PCR thermal profile page 6

18 1. Initial Denaturation 10 min 95 C 2. Amplification of DNA Number of cycles 45 Denaturation 10 sec 95 C Annealing 10 sec 55 C (aquisition mode: SINGLE) Extension 25 sec 72 C Ramping time for all steps 20 C/sec 3. Melting Curve 0 sec 95 C Ramping time 20 C/sec 5 sec 50 C Ramping time 20 C/sec 0 sec 80 C Ramping time 0.1 C/sec Aquisition mode: cont. 4. Cooling 30 sec 40 C Activate the Color Compensation File (CCC) Analysis of Melting Curves page 7

19 For the analysis of the melting curves choose the following adjustments: Digital filter: enabled Degrees to average: 9-10 The results of the melting curves analysis for the C/T (-13910) polymorphism are shown in the channel F2 /F1. Figure 1 shows the melting curves of homozygous and heterozygous samples. Positive Control Genotype T/T (tolerant) Positive Control C/C Genotype (intolerant) Clinical Sample with heterozygous C/T Genotype Figure 1: The melting curves show peaks at a temperature of about 56.5 C for the T/T genotype and about 63.5 C for the C/C genotype. Heterozygous samples (genotype C/T) show peaks at both temperatures. Troubleshooting page 8

20 The following troubleshooting guide is included to help you with possible problems that may arise when performing a real time PCR. If you have further questions on the protocol or the instruction manual, please do not hesitate to contact our scientists on info@gerbion.com. No fluorescence signal of the Positive Controls (K4 and K5) The selected channel for analysis does not comply with theprotocol Select channel F2/F1 for analysis of melting curve. Incorrect configuration of the real time PCR Check your work steps and compare with procedure on the pages 5-7. The programming of the thermal profile is incorrect Compare the thermal profile with the protocol (table 3, page 7) Incorrect storage conditions for one or more kit components or kit expired Check the storage conditions and the date of expiry printed on the kit label. If neccessary, use a new kit and make sure kit components are stored as described in Transport and Storage, page 2. Detection of a fluorescence signal of the Negative Control (K6) Contamination during preparation of the real time PCR Repeat the real time PCR in replicates. If the result is negative in the repetition, the contamination occured when the samples were pipetted into the capillaries. Make sure to pipet the Positive Controls at last and close the capillaries immediately after adding the sample. If the same result occurs, one or more of the kit components might be contaminated. Make sure that work space and instruments are decontaminated regularly. Use a new kit and repeat the PCR. No fluorescence signal in channel F2/F1 page 9

21 PCR inhibited Make sure that you use an appropriate isolation method (see Preparation of samples, page 5) and follow the manufacturer s instructions. Make sure that the ethanol containing washing buffer of the isolation kit has been completely removed. An additional centrifugation step at high speed is recommend before elution of the DNA. DNA loss during isolation process Make sure that you use an appropriate isolation method (commercial kits are recommended) and stick to the manufacturer s protocol (see Preparation of samples, page 5). The peaks of the melting curve of the samples are not located in the temperature range of the control peaks (T/T: 56.5 C +/- 1 C; C/C: 63.5 C +/- 1 C) Existence of a further polymorphism within the region of amplification. The presence of a further polymorphism in the region of amplification may lead to a shift of the melting curves. This can particularly happen in the case of people of non-caucasian origin. Therefore a safe diagnosis cannot be made. If confirmation is necessary, a hydrogen breath test is recommended. page 10

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