POSEIDON DNA PROBES. Instruction Manual. Instruction manual

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1 POSEIDON DNA PROBES Instruction Manual Instructions For Use Mode d emploi Gebrauchsanleitung Istruzioni per l uso Instrucciones de uso Instruction manual

2 Instructions For Use GB 3 Mode d emploi F 10 Gebrauchsanleitung D 17 Istruzioni per l uso I 24 Instrucciones de uso E 31

3 Instructions For Use Using Poseidon fluorescent labeled DNA probes GB Fluorescent in situ hybridization (FISH) identifies, or labels, target genomic sequences so that their location can be studied. DNA sequences from appropriate, chromosome-specific probes are first labeled with reporter molecules. The labeled DNA probe is then hybridized to the metaphase chromosomes or interphase nuclei on a slide. After washing the specimen is screened for the reporter molecules by fluorescence microscopy. Slide Pretreatment: For use on metaphase and interphase cells from peripheral blood cultures or direct preparations prepared by standard cytogenetic methods, see: The ACT cytogenetics laboratory manual. 2nd ed. New York: Raven Press; Pre-treat dry sample slide in 2 x SSC, ph 7.0 at 37 C for 2 minutes. Dehydrate in 70%, 85% and 100% Ethanol for 1 minute each. Air dry at room temperature. For paraffin embedded tissue sections refer to Appendix I For slides with cytoplasmic background or difficult samples refer to Appendix II. Probe preparation: Of all POSEIDON probes (except the Whole Chromosome Paint probes (WC), see below) dilute 2 µl with 8 µl Cell Hybridization Buffer (CHB). For paraffin embedded tissue sections use the 7 µl Tissue Hybridization Buffer (THB) + 1 µl KREAboost. For WC use 2 µl with 8 µl Whole Chromosome Hybridization Buffer (WHB). For each additional probe add 2 µl of probe and reduce hybridization buffer by 2 µl each time. 3

4 Co-denaturation: Apply 10 µl of probe or probe-mix per 22 x 22 mm field. Cover with glass cover-slip and seal with Fixogum or Rubber Cement. Denature sample and probe on a hot plate at 75 C for 5 minutes (or 10 min for pre-treated tissue sections, see Appendix I). Continue with hybridization. Note: Probes have been qualified on half-automated hybridization machines (e.g. Hybrite, Thermobrite ) Or Separate Slide Denaturation, Optional: Denature slide in 70% Formamide/ 2X SSC, ph 7.0 at 72ºC (±1ºC) for 2 minutes. Dehydrate in ice cold (-20ºC) 70%, 80%, and 95% Ethanol for 2 minutes each. Air dry. Denature probe mix at 75 C for 10 minutes. Apply probe to denatured slide, cover with glass cover-slip, seal with rubber cement and continue with hybridization. Hybridization: Incubate overnight at 37ºC in a humidified chamber. Post-Hybridization Wash: Remove rubber cement, slide off cover-slips. If the coverslip does not come off incubate slides in 1 x Wash Buffer II at room temperature. Wash slides in 1 x Post-Wash Buffer I for 2 minutes at 72 C (±1ºC) without agitation. Wash slides in 1 x Wash Buffer II for 1 minute at room temperature without agitation. Proceed to counterstaining. Counterstain: Apply 15 µl DAPI/Antifade (final concentration 0.02 µg/ml or undiluted at 0.1 µg/ml for tissue) and apply glass cover-slip. Squeeze out remaining buffer by applying a paper tissue over the cover-slip and press gently. Proceed with Microscopy. 4

5 Procedural recommendations: Temperature and buffer concentration (stringency) of hybridization and washing are important, as lower stringency can result in non-specific binding of the probe to other sequences, and higher stringency can result in a lack of signal. Incomplete denaturation of target DNA can result in lack of signal. Material provided: 10 test format: 20 µl of probe and 100 µl Cell Hybridization Buffer. Optional: 100 µl Tissue Hybridization Buffer + 10 µl KREAboost. 5 test format: 10 µl of probe and 50 µl CHB or WHB. Note: Some probes are optimized for tissue hybridization and will be provided with Tissue Hybridization Buffer, for other probes THB can be provided upon request. Probes are labeled with a choice of green (PlatinumBright 495), red (PlatinumBright 550), or blue (PlatinumBright 415) fluorophore. Recommendations for Fluorescence Microscopy For optimal visualization use a well maintained and regularly calibrated microscope equipped with a 100 W mercury lamp and a x 63 or x 100 fluorescent objective is recommended. Triple band-pass filters (DAPI/FITC/Texas Red or DAPI/FITC/Rhodamine) are used to view multiple colors, single band-pass filters are used for individual color visualization. GB Fluorophore Excitation Emission PlatinumBright ±20 nm 475 ±30 nm PlatinumBright ±20 nm 525 ±30 nm PlatinumBright ±12 nm 580 ±30 nm Suitable excitation and emission range for Poseidon fluorophores (see graph p39) 5

6 Appendix I Pretreatment of paraffin embedded tissue sections for FISH Recommended for use with KB POSEIDON Tissue Pretreatment Kit 1. Bake 4-5 µm formalin fixed paraffin embedded tissue sections for 2-16 hours at 56ºC. 2. De-paraffinize slides by soaking in (regular refreshed) xylene for 10 minutes two times. Rehydrate by soaking in 100%, 85% and 70% Ethanol for 3 minutes each. Wash with dh 2 O for 3 minutes. 3. Pre-treat with 0.2 M HCl for 20 minutes, then wash in dh 2 O for 3 minutes. 4. Place slides in 8% sodium thiocyanate in dh 2 O at 80ºC for 30 minutes. Rinse in 2 x SSC for 3 minutes. 5. Digest in 0.025% pepsin in 0.2 M HCl at 37ºC for 30 minutes. (Time depending on tissue, fixation and pepsin activity). Wash in dh 2 O for 1 minute and in 2 x SSC for 5 minutes. 6. Dehydrate slides by soaking in 70%, 85%, and 100% Ethanol for 1 minute each time. Air dry. Note: Check protein digestion and pre-treatment by applying 15 µl DAPI counterstain and evaluate slides using a fluorescence microscope equipped with a DAPI filter. 30 minutes protein digestion is normally sufficient for a wide range of breast tumors. Remove cover-slip and soak tissue in 2 x SSC for 2 minutes and increase protein digestion by 2-20 minutes if sample is under digested. Use a fresh sample and cut protein digestion time to 20 minutes if sample is over digested. 7. Apply 10 µl of probe or probe-mix per 22 x 22 mm field. Seal with Rubber Cement. Denature sample and probe on a hot plate at 75 C for 10 min. 8. Incubate overnight in a 37ºC humidified chamber. 9. Remove rubber cement and slide off cover-slips. 10. Wash slides in 1 x Post-Wash Buffer I (0.4 x SSC/ 0.3% NP-40) for 2 minutes at 72 C (±1ºC) without agitation. 6

7 11. Wash slides in 1 x Wash Buffer II (2 x SSC/ 0.1% NP-40) for 1 minute at room température without agitation. Proceed to counterstaining. 12. Apply 15 µl counterstain (0.15 µg/ml DAPI in Antifade) and cover tissue with a 22 x 50 mm glass cover-slip. GB Apendix II Pretreatment for slides with cytoplasmic background or difficult samples Recommended for use with KB POSEIDON FISH & Digestion Kit 1. Pre-treat dry sample slide in 2 x SSC, ph 7.0 at 37 C for 2 minutes. 2. Incubate the slides 3-10 minutes in 0.005% Pepsin solution in 0.01 M HCl at 37 C. 3. Wash slide for 3 min in 1 x PBS at room temperature. 4. Post-fixate in 1% buffered formaldehyde in 1 x PBS/20 mm MgCl 2 for 10 min at room temperature. 5. Wash slide for 3 min in 1 x PBS at room temperature. 6. Dehydrate in 70%, 85% and 100% Ethanol for 1 minute each. Air dry at room temperature. Proceed with Co-denaturation as on page 4. Material required, but not supplied: - 1% buffered Formaldehyde/1 x PBS/20mM MgCl 2 - PBS - Xylene - Formamide - Ethanol 100%, 85% and 70% - Fixogum (LK-071A) or rubber cement - Hot plate (with accurate temperature control up to 80 C) - Incubator at 37 C + 60 C - Water bath with accurate temperature at 72 C and/or 37 C 7

8 - Plastic or glass coplin jars - Variable micropipettes (1 µl µl) - Fluorescence microscope equipped with suitable filters (see recommendations for Fluorescence Microscopy). Material required and not supplied, but available in the POSEIDON Tissue Pretreatment kit (KB-60001): - Sodium Thiocyanate - Pepsin M HCL - 2 x SSC - Post-Wash-Buffer I (0.4 x SSC / 0.3% NP-40) - Wash-Buffer II (2 x SSC / 0.1% NP-40) - Counterstain (DAPI/Antifade and Antifade) Material required and not supplied, but available in the: POSEIDON FISH kit (KB-60002): - 2 x SSC - Post-Wash-Buffer I (0.4 x SSC / 0.3% NP-40) - Wash-Buffer II (2 x SSC / 0.1% NP-40) - Counterstain (DAPI/Antifade and Antifade) or POSEIDON FISH & Digestion kit (KB-60003): - Pepsin M HCL - 2 x SSC - Post-Wash-Buffer I (0.4 x SSC / 0.3% NP-40) - Wash-Buffer II (2 x SSC / 0.1% NP-40) - Counterstain (DAPI/Antifade and Antifade) All solutions in the KB-60001, KB and KB except the counterstain are provided in 10x concentration. 8

9 Warnings and Precautions: 1. For in vitro diagnostic use. For professional use only. In case of emergencies check MSDS sheets for medical help. 2. DNA probes and hybridization buffers contain formamide which is a teratogen; do not breathe or allow skin contact. Wear gloves and a lab coat when handling DNA probes and DAPI/Antifade counterstain. Upon disposal, flush with a large volume of water. 3. The use of Sodium Thiocyanate could cause irritation to skin, eyes and respiratory tract and is harmful if swallowed or inhaled. It may affect the heart, blood, thyroid and central nervous system. 4. All materials should be disposed of according to your institution s guidelines for hospital waste disposal. GB Patents: These products or the use of these products is subject to proprietary rights. The probes in these products are labeled with the Universal Linkage System (ULS ). The fluorophore used in the PlatinumBright-415 labeling compound is subject to patents, owned or controlled, and manufactured by DYOMICS GmbH. The ULS technology and products are covered by US patents 5,580,990; 5,714,327; 5,985,566; 6,133,038; 6,797,818 and several foreign patents owned by KREATECH Biotechnology B.V. KREATECH is a trade name of KREATECH Biotechnology B.V., ULS and Poseidon are trademarks of KREATECH Biotechnology B.V. 9

10 Mode d emploi Utilisation de sondes ADN marquées par fluorescence Poseidon L hybridation in situ par fluorescence (FISH, pour Fluorescent in situ hybridization ) identifie, ou marque, des séquences génomiques cibles afin d étudier leur emplacement. Les séquences ADN des sondes appropriées et spécifiques à un chromosome sont d abord marquées avec des molécules rapporteuses. La sonde ADN marquée est ensuite hybridée aux chromosomes en métaphase ou aux noyaux en interphase sur une lame. Après lavage, il est possible de visionner les molécules rapporteuses sur l échantillon par microscopie en fluorescence. Prétraitement de la lame: Pour utilisation sur des cellules en métaphase ou en interphase d hémocultures périphériques ou de préparations directes effectuées par les méthodes cytogénétiques standards, voir: The ACT cytogenetics laboratory manual 2ième édition. New-York: Raven Press; Prétraiter la lame sèche dans du 2 x SSC, ph 7,0 à 37 C pendant 2 minutes. Déshydrater dans de l éthanol à 70%, 85% et 100% à température ambiante, une minute chaque. Laisser sécher à l air. Pour les coupes de tissu montées en paraffine, veuillez vous reporter à l appendice I. Pour des lames avec du cytoplasme ou des échantillons complexes, veuillez vous reporter a l appendice II. Préparation de la sonde: Pour toutes les sondes POSEIDON (à l exception des sondes de peinture chromosomique (Whole Chromosome), cf ci-après), diluer 2 µl de sonde avec 8 µl de tampon d hybridation pour cellule (Cell Hybridization Buffer, CHB). Pour les coupes de tissu montées en paraffine, utiliser 2µl de sonde avec 7µl de tampon d hybridation pour tissu (Tissue hybridization Buffer, THB) + 1 µl de KREAboost. Pour les sondes de peinture chromosomique (WC), utiliser 2µl 10

11 de sonde avec 8µl de tampon d hybridation pour peinture chromosomique (Whole Chromosome Hybridization Buffer, WHB). Pour chaque sonde supplémentaire, ajouter 2 µl de sonde et diminuer le volume du tampon d hybridation de 2 µl chaque fois. Co-dénaturation: Appliquer 10 µl de sonde ou de mélange de sondes pour une surface de 22 x 22 mm. Recouvrir avec une lamelle en verre et sceller avec du Fixogum ou du mastic caoutchouc. Dénaturer l échantillon et la sonde sur une plaque chauffante à 75 C pendant 5 minutes (ou pendant 10 minutes pour les coupes de tissu montées en paraffine prétraitées, voir appendice I). Poursuivre l hybridation. Note: Les sondes ont été qualifiées pour un usage sur des systèmes à hybridation semi-automatisées (par exemple Hybrite, Thermobrite ). Ou Dénaturation séparée de la lame, optionnel: Dénaturer la lame dans de la formamide/ 2 x SSC à 70%, ph 7,0 à 72ºC (±1ºC) pendant 2 minutes. Déshydrater dans de l éthanol glacé (-20ºC) 70%, 80%, et 95% pendant 2 minutes chaque. Laisser sécher à l air. Dénaturer le mélange de sondes à 75 C pendant 10 minutes. Appliquer la sonde sur la lame dénaturée, recouvrir avec une lamelle en verre, sceller avec du mastic caoutchouc puis poursuivre l hybridation. Hybridation: Incuber à 37ºC toute la nuit dans une chambre humide. Lavage post-hybridation: Oter les lamelles en verre en retirant le mastic en caoutchouc. En cas de difficulté à retirer la lamelle, mettre la lame dans du 1 x tampon de lavage II à température ambiante. Laver la lame dans du 1 x tampon de lavage I pendant 2 minutes à 72 C (± 1 C) sans agiter. Placer la lame dans du 1 x tampon de lavage II pendant une minute à température ambiante sans agiter. Procéder à la contre coloration. 11 F

12 Contre coloration: Appliquer 15 µl de «DAPI/Antifade» (concentration finale 0,02 µg/ml ou non diluée à 0,1 µg/ml pour les coupes de tissu) et déposer une grande lamelle en verre. Eponger le reste du tampon en appliquant un mouchoir en papier sur la lamelle et presser doucement. Poursuivre avec la microscopie. Recommandations concernant la procédure: La température, les concentrations des tampons d hybridation et de lavage (conditions de stringence) sont importantes car une stringence plus faible peut provoquer une fixation aléatoire de la sonde sur d autres séquences et une stringence plus élevée peut provoquer une absence de signal. Une dénaturation incomplète de l ADN ciblé peut provoquer une absence de signal. Matériel fourni: Conditionnement 10 tests: 20 µl de sonde et 100 µl tampon d hybridation. Optionnel: 100 µl de tampon pour hybridation sur tissus + 10 µl KREAboost. Conditionnement 5 tests : 10 µl de sonde et 50 µl CHB ou WHB. Note: Certaines sondes sont optimisées pour l hybridation sur tissus et seront fournies avec du tampon d hybridation spécifique pour tissus, pour les autres sondes le «THB» peut être fourni sur demande. Les sondes sont marquées par un choix de fluorophores, vert («PlatinumBright 495»), rouge («PlatinumBright 550») ou bleu («PlatinumBright 415»). Recommandations pour la microscopie en fluorescence Pour une visualisation optimale, un microscope bien entretenu et régulièrement calibré, équipé d une lampe à mercure de 100 W avec un objectif fluorescent x 63 ou x 100 est recommandé. Les filtres triple bande-passe (DAPI/FITC/Texas Rouge ou DAPI/FITC/Rhodamine) sont utilisés pour observer plusieurs couleurs et les filtres simple bandepasse, sont utilisés pour visualiser une seule couleur. 12

13 Fluorophore Excitation Emission PlatinumBright ±20 nm 475 ±30 nm PlatinumBright ±20 nm 525 ±30 nm PlatinumBright ±12 nm 580 ±30 nm Portées d excitation et d émission appropriées pour les fluorophores Poseidon (voir graphique p39) Appendice I Prétraitement des coupes de tissu en paraffine pour la FISH Recommandé avec l utilisation du kit «KB Tissue Pretreatment Kit» 1. Faire cuire les lames de tissus 4-5 µm fixée à la formaline dans lesquels a été insérée la paraffine pendant 2 à 16 heures à 56ºC. 2. Déparaffiner les lames en les trempant dans du xylène pendant 10 minutes, deux fois. Réhydrater dans de l éthanol à 100%, 85% et 70% pendant 3 minutes chaque fois. Laver avec de l H 2 O distillée pendant 3 minutes. 3. Prétraiter les lames avec du 0,2 M HCl pendant 20 mn puis rincer avec de l H 2 O distillée pendant 3 minutes 4. Placer les lames dans une solution de 8% de thiocyanate de sodium à 80 C pendant 30 minutes. Rinser dans du 2xSSC pendant 3 minutes. 5. Digérer dans une solution de 0,025% de pepsine / 0,2 M HCl à 37 C pendant 30 minutes (la durée dépendant du tissu, de la fixation et de l activité de la pepsine). Rincer dans de H 2 O distillée pendant 1 minute puis dans du 2 x SSC pendant 5 minutes. 6. Déshydrater dans de l éthanol à 70%, 85% et 100% pendant 1 minute chaque. Laisser sécher à l air. Note: Vérifier le prétraitement et la digestion en appliquant 15 µl DAPI et évaluer les lames en utilisant un microscope à fluorescence avec un filtre DAPI. 30 minutes de 13 F

14 digestion de protéine sont normalement suffisantes pour une grande variété de tumeurs du sein. Dans le cas de digestion insuffisante, retirer la lamelle et rincer le tissu dans du 2 x SSC pendant 2 minutes puis augmenter la digestion de protéine de 2 à 20 minutes. Dans le cas de tissu trop digéré, utiliser un prélèvement frais et diminuer le temps de la digestion de protéine à 20 minutes. 7. Appliquer 10 µl de sonde ou de mélange de sondes par surface de 22 x 22 mm. Sceller avec du mastic caoutchouc. Dénaturer le prélèvement et la sonde sur une plaque chauffante à 75 C pendant 10 minutes. 8. Incuber toute une nuit à 37ºC dans une chambre humide. 9. Oter le lamelle en verre en retirant le mastic en caoutchouc. 10. Laver la lame dans du 1 x tampon Post lavage I (0.4 x SSC/ 0,3% NP-40) pendant 2 minutes à 72 C, sans agiter. 11. Rincer la lame dans du 1 x tampon de lavage II (2 x SSC/ 0,1% NP-40) pendant 1 minute à température ambiante, sans agiter. Procéder à la contre-coloration 12. Appliquer 15 µl de la contre-coloration (0.1 µg/ml DAPI/ Antifade) et déposer une grande lamelle en verre de 22 x 50 mm. Apendice II Prétraitement des lames présentant du cytoplasme ou pour des échantillons difficiles Recommandé avec l utilisation du kit «KB POSEIDON FISH & Digestion Kit» 1. Prétraiter la lame sèche dans du 2 x SSC, à ph 7.0 et 37 C pendant 2 minutes. 2. Incuber les lames pendant 3 à 10 minutes dans une solution de 0,01 M HCl, 0,005% de pepsin à 37 C 3. Laver la lame pendant 3 minutes dans du 1 x PBS à température ambiante. 4. Post-fixer dans une solution tampon de 1% en formaldehyde/1 x PBS/20mM de MgCl 2 pendant 10 minutes à température ambiante. 5. Laver la lame pendant 3 minutes dans du 1 x PBS à température ambiante. 6. Déshydrater dans de l éthanol à 70%, 85% et 100% pendant 1 minute chaque. Laisser sécher à l air. 14

15 Poursuivre avec la Co-dénaturation comme décrit en page 11. Matériel nécessaire, mais non fourni: - Solution tampon 1% en formaldehyde/1 x PBS/20mM en MgCl 2 - PBS - Xylene - Formamide - Ethanol 100%, 85%, 70% - Fixogum (LK-071A) ou du mastic caoutchouc - Plaque chauffante (avec un contrôle précis de la température jusqu à 80 C) - Incubateur à 37 C + 60 C - Bain marie avec un contrôle précis de la température à 72 C, et/ou 37 C - Récipient en plastique ou en verre - Micropipettes variables (1 µl µl) - Microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés (voir Recommandations pour la microscopie en fluorescence). Matériel nécessaire et disponible dans le kit «POSEIDON Tissue Pretreatment kit» (KB-60001): - Thiocyanate de sodium - Pepsine - 0,2 M HCl - 2 x SSC - Tampon post-lavage I (0.4 x SSC/ 0,3% NP-40) - Tampon de lavage II (2 x SSC/ 0,1% NP-40) - Contre-colorant DAPI/Antifade et l Antifade Matériel nécessaire et disponible dans le: «POSEIDON FISH kit» (KB-60002): - 2 x SSC - Tampon post-lavage I (0.4 x SSC/ 0,3% NP-40) - Tampon de lavage II (2 x SSC/ 0,1% NP-40) - Contre-colorant DAPI/Antifade et l Antifade 15 F

16 ou «POSEIDON FISH & Digestion kit» (KB-60003): - Pepsine - 0,01 M HCl - 2 x SSC - Tampon post-lavage I (I (0.4 x SSC/ 0,3% NP-40) - Tampon de lavage II (2 x SSC/ 0,1% NP-40) - Contre-colorant DAPI/Antifade et l Antifade Toutes les solutions pour les références KB-60001, KB et KB à l exception de la contre coloration sont fournies 10X concentrés. Mise en garde et précautions: 1. Utilisation pour diagnostique in vitro. Uniquement à usage professionnel. 2. Les sondes ADN et les tampons d hybridation contiennent de la formamide qui est un tératogène; ne pas respirer ou permettre une mise en contact avec la peau. Porter des gants et une blouse de laboratoire lors de manipulations de sondes ADN et de l utilisation de contre colorant comme le DAPI/Antifade. Lors du traitement des déchets, rincer à grande eau. 3. Tout le matériel doit être éliminé selon les instructions de votre institution concernant les déchets hospitaliers. Brevets: Ces produits ou l utilisation de ces produits sont sujets aux droits de propriété. Les sondes dans ces produits sont marquées avec le «Universal Linkage System» (ULS ). Le fluorophore utilisé dans l agent marqueur «PlatinumBright-415» est sujet aux brevets, de la propriété ou contrôlé, et fabriqué par DYOMICS GmbH. La technologie ULS et ses produits sont couverts par les brevets US 5,580,990; 5,714,327; 5,985,566; 6,133,038; 6,797,818 et plusieurs brevets étrangers de la propriété de Kreatech Biotechnology B.V. Kreatech est un nom déposé de KREATECH Biotechnology BV. ULS et Poseidon sont des modèles déposés de KREATECH Biotechnology BV. 16

17 Gebrauchsanleitung Für die Verwendung vom Poseidon Fluoreszenzmarkierter DNA-Sonden Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) identifiziert, oder markiert genomische DNA, um deren Lokalisierung zu untersuchen. DNA-Sequenzen geeigneter, chromosomspezifischer Bereiche werden zunächst mit Reporter-Molekülen markiert. Die markierte DNA-Sonde wird auf Metaphase-Chromosomen oder Interphasenzellkernen die auf Objektträger fixiert sind hybridisiert. Nach verschiedenen Waschschritten wird die Probe mit einem Fluoreszenzmikroskop auf das Vorhandensein der Reporter-Moleküle überprüft. Vorbehandlung der Objektträger: Für den Einsatz auf Metaphasen- und Interphasenzellen aus fixierten Kulturen peripheren Bluts oder auf durch zytogenetische Standardmethoden direkt hergestellten Direkt-Präparaten, siehe: The ACT cytogenetics laboratory manual. 2. Ausgabe. New York; Raven Press; Getrocknete Präparate in 2 x SSC, ph 7,0, für 2 Minuten bei 37 C vorbehandeln. In einer Alkohol-Reihe (70%, 80%, 95%) bei Raumtemperatur für jeweils 2 Minuten dehydrieren. An der Luft trocknen lassen. D Für Paraffinschnitten wird auf Anhang I verwiesen Für Präparate mit hohem Cytoplasmagehalt oder Membrananteilen wird auf Anhang II verwiesen Sondenvorbereitung: Alle Poseidon Sonden, mit Ausnahme der Whole Chromosome Paints (WC) (siehe unten), 2 µl Sonde mit 8 µl Zell Hybridisierungs- Puffer (CHB=Cell hybridization buffer) verdünnen. Für Paraffin-eingebettete fixierte Gewebeschnitte 7 µl Gewebe Hybridisierungs-Puffer (THB=Tissue Hybridization Buffer) + 1 µl KREAboost verwenden. 17

18 Für WC-Sonden 2 µl Sonde mit 8 µl Whole Chromosome Hybridization Buffer (WHB) verdünnen. Für jede weitere Sonde 2 µl Sonde hinzufügen und den Hybridisierungspuffer um jeweils 2 µl verringern. Co-Denaturierung: 10 µl Sonde oder Sondenmix pro 22 x 22 mm Fläche auftragen. Glasplättchen auflegen und mit Fixogum oder Gummilösung versiegeln. Probe und Sonde für 5 Minuten auf einer Heizplatte bei 75 C denaturieren (oder für 10 Minuten bei vorbehandelten Gewebeschnitten, siehe Anhang I). Mit der Hybridisierung fortfahren. Anmerkung: Die Sonden wurden auf halbautomatischen Hybridisierungsmaschinen (z. B. Hybrite, Thermobrite ) qualifiziert. oder Getrennte Denaturierung, optional: Objektträger für 2 Minuten in 70%igem Formamid/2 x SSC, ph 7,0, bei 72ºC (±1ºC) denaturieren. In einer Folge eiskalter (-20 C) Ethanolkonzentrationen (70%, 80% und 95%) jeweils für 2 Minuten dehydrieren. An der Luft trocknen lassen. Den Sondenmix für 10 Minuten bei 75 C denaturieren. Die Sonde auf den denaturierten Objektträger auftragen, Glasplättchen auflegen und mit Gummilösung versiegeln und mit der Hybridisierung fortfahren. Hybridisierung: Über Nacht in einer feuchten Kammer bei 37 C hybridisieren. Post-Hybridisierungs-Waschschritte: Fixogum oder Gummilösung mit einer Pinzette entfernen. Zum Ablösen der Deckgläser, die Objektträger bei Raumtemperatur in Waschpuffer II eintauchen. Die Objektträger ohne Schütteln für 2 Minuten in 1 x Post- Waschpuffer I bei 72 C (±1 C) waschen. Den Objektträger für 1 Minuten in 1 x Waschpuffer II bei Raumtemperatur in eine Glas (oder Plastik) Küvette stellen. Zur Gegenfärbung übergehen. Gegenfärbung: 15 µl DAPI-Antifade-Lösung (Endkonzentration 0,02 µg/ml oder 18

19 unverdünnt mit 0,1 µg/ml für Gewebe) auf den Objektträger pipettieren und mit einem Deckglas verschließen. Den verbleibenden Puffer ausdrücken: hierzu ein Papiertuch über das Deckglas legen und leicht drücken. Zur Mikroskopie übergehen. Verfahrensempfehlungen: Temperatur und Salzkonzentration der Lösungen (Stringenz) der Hybridisierung und Waschschritte sind wichtig, da eine geringere Stringenz zu einer unspezifischen Bindung der Sonde an andere Sequenzen und eine höhere Stringenz zu schwächeren Signalen führen kann. Eine unvollständige Denaturierung der Ziel-DNA kann zum vollständigen Fehlen von Signalen führen. Geliefertes Material: Format für 10 Tests: 20 µl Sondenmenge und 100 µl Zell Hybridisierungspuffer. Optional: 100 µl Gewebe Hybridisierungspuffer + 10 µl KREAboost. Format für 5 Tests: 10 µl Sondenmenge und 50 µl Zell CHB oder WHB. Anmerkung: Einige Sonden sind für Hybridisierungen an Gewebeschnitten optimiert und werden mit Gewebe Hybridisierungs-Puffer (THB) geliefert. Für andere Sonden ist THB auf Anfrage kostenlos erhältlich. Bitte bei der Sondenbestellung angeben. Die Sonden sind in einer Auswahl von grünen (PlatinumBright 495), roten (PlatinumBright 550) oder blauen (PlatinumBright 415) Fluorochromen markiert. Empfehlungen für die Fluoreszenzmikroskopie Für eine optimale Visualisierung empfehlen wir ein gut unterhaltenes und regelmäßig kalibriertes Mikroskop, das mit einer 100-Watt-Quecksilberlampe und einem 63x oder 100x Fluoreszenzobjektiv ausgestattet ist. Dreifach und Zweifach Bandpassfilter (DAPI/FITC/Texas Red, DAPI/FITC/Rhodamin, FITC/ Texas Red, FITC/Rhodamin) werden zur Beobachtung mehrerer Farben und einfache Bandpassfilter für die Visualisierung einzelner Farben verwendet. 19 D

20 Fluorochrom Absorption Emission PlatinumBright ±20 nm 475 ±30 nm PlatinumBright ±20 nm 525 ±30 nm PlatinumBright ±12 nm 580 ±30 nm Geeignete Absorptions- und Emissionsspektren der Poseidon Fluorochrome (Siehe graphik p39) Anhang I Vorbehandlung von Paraffinschnitten für eine FISH-Analyse Empfohlen für den Einsatz mit dem Gewebe-Konvertierungs- Kit KB Mit Formalin fixierte Paraffinschnitten von 4-5 µm Dicke für 2-16 Stunden bei 56 C austrocknen. 2. Das Paraffin entfernen: hierfür die Objektträger zweimal für 10 Minuten in frisches Xylol stellen. Durch Inkubieren in 100%, 85% und 70% Ethanol für 3 Minuten rehydrieren. Bei Raumtemperatur für 3 Minuten in destilliertem Wasser spülen. 3. Für 20 Minuten in 0,2 M HCl bei Raumtemperatur vorbehandeln. 3 Minuten in destilliertem Wasser spülen. 4. Objektträger für 30 Minuten in 8% Natrium-Thio-Cyanat wässrige Lösung stellen. Zweimal 3 Minuten in 2 x SSC spülen. 5. Präparate in 0,025% igem Pepsin (in 0,2 M HCl) bei 37 C für etwa 30 Minuten verdauen (die genaue Zeit ist abhängig vom verwendeten Gewebe, der Fiaxtion und Pepsin Aktivität, und muß experimentell ermittelt werden. Die angegebene Zeit ist ein Richtwert). Für 1 Minute in destilliertem Wasser und 5 Minuten in 2 x SSC waschen. 6. Objektträger in einer Alkohol-Reihe (70%, 85%, 100%) jeweils für 1 Minuten dehydrieren. An der Luft trocknen lassen. Hinweis: Der Proteinaufschluß und die Vorbehandlung durch Auftragen von 15 µl DAPI- Gegenfärbung prüfen und die Objektträger mit einem DAPI spezifischen Filter auswerten. 30 Minuten der Proteinaufschließung reicht bei den meisten Fällen von Brusttumoren normalerweise aus. Deckglas entfernen und Gewebe für 2 Minuten in 2 x SSC waschen; Proteinaufschluß um 2-20 Minuten erhöhen, falls die Probe nicht genügend aufgeschlossen ist. Eine frische Probe nehmen und die 20

21 Proteinaufschließung auf 20 Minuten reduzieren, falls die Probe zu stark aufgeschlossen ist µl Sondenmenge oder Sondenmix pro 22 x 22 mm Fläche auftragen. Mit Fixogum oder Gummilösung versiegeln. Probe und Sonde für 10 Minuten auf einer Heizplatte bei 75 C denaturieren. 8. Über Nacht in einer feuchten Kammer bei 37 C hybridisieren. 9. Fixogum oder Gummilösung mit einer Pinzette entfernen. 10. Zum Ablösen der Deckgläser, die Objektträger bei Raumtemperatur in Waschpuffer II eintauchen. 11. Die Objektträger ohne Schütteln für 2 Minuten in 1 x Waschpuffer I bei 72 C (±1 C) waschen. Den Objektträger für 1 Minuten in Waschpuffer II bei Raumtemperatur in eine Glas (oder Plastik) Küvette stellen. Zur Gegenfärbung übergehen µl Gegenfärbung (0,1 µg/ml DAPI in Antifade) auftragen und Gewebe mit einem Deckglas von etwa 22 x 50 mm abdecken. Anhang II Vorbehandlung von Präparate mit hohem Zytoplasmagehalt oder Membrananteilen Empfohlen für den Einsatz mit dem POSEIDON FISH& Zell- Aufschluss-Kit KB Getrocknete Präparate in 2 x SSC, ph 7,0, für 2 Minuten bei 37 C vorbehandeln. 2. Objektträger für 3-10 Minuten in 0,005% Pepsin in 0,01 M HCl bei 37 C inkubieren Minuten bei Raumteperatur in 1 x PBS waschen. 4. In einer Lösung aus 1% gepuffertem Formaldehyd in 1 x PBS/20 mm MgCl 2 für 10 Minuten bei Raumtemperatur nachfixieren. 5. Objektträger 3 Minuten in 1 x PBS bei Raumtemperatur waschen. 6. In einer Alkohol-Reihe (70%, 80%, 95%) bei Raumtemperatur für jeweils 2 Minuten dehydrieren. An der Luft trocknen lassen. Mit der Co-Denaturierung wie auf Seite 18 beschrieben fortfahren. D Erforderliches, jedoch nicht mitgeliefertes Material: - 1% gepuffertes Formaldehyd/1 xpbs/20 mm MgCl 2 - PBS 21

22 - Xylol - Formamid - Ethanol 100%, 85%, 70% - Fixogum (LK-071A) oder Gummi-Kleber - Heizplatte (mit einer präzisen Temperatursteuerung bis 80 C) - Brutschrank bei 37 C, bzw. 60 C - MgCl 2 - Wasserbad mit genauer Temperatur bei 72 C, bzw. 37 C - Coplin-Küvetten aus Kunststoff oder Glas - Verschiedene Feinpipetten (1 µl µl) - Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern (siehe Empfehlungen für die Fluoreszenzmikroskopie). Erforderliche Materialen nicht geliefert, aber unter POSEIDON Tissue Pretreatment Kit (KB-60001) erhältlich: - Natrium Thio-Cyanat - Pepsin - 0,2 M HCl - 2 x SSC - Post-Waschpuffer I (0,4 x SSC / 0,3% NP-40) - Waschpuffer II (2 x SSC / 0,1% NP-40 - Gegenfärbung (DAPI/Antifade und Antifade) Erforderliche Materialen nicht geliefert, aber unter POSEIDON FISH Kit (KB-60002) erhältlich: - 2 x SSC - Post-Waschpuffer I (0,4 x SSC / 0,3% NP-40) - Waschpuffer II (2 x SSC / 0,1% NP-40 - Gegenfärbung (DAPI/Antifade und Antifade) oder Erforderliche Materialen nicht geliefert, aber unter POSEIDON FISH & Digestion Kit (KB-60003) erhältlich: - Pepsin 22