ÖNORM EN Die Europäische Norm EN hat den Status einer Österreichischen Norm. Ausgabe: Normengruppe N
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1 ÖNORM EN Ausgabe: Normengruppe N Ident (IDT) mit EN 14177:2003 ICS ; Lebensmittel Bestimmung von Patulin in klarem und trübem Apfelsaft und Apfelpüree HPLC-Verfahren mit Reinigung durch Flüssig/Flüssig- Verteilung Foodstuffs Determination of patulin in clear and cloudy apple juice and puree HPLC method with liquid/liquid partition clean-up Produits alimentaires Détermination de la teneur en patuline dans le jus de pommes et dans la compote de pommes, limpides et troubles Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance avec purification par partage liquide/liquide Die Europäische Norm EN hat den Status einer Österreichischen Norm. Die ÖNORM EN besteht aus diesem nationalen Deckblatt sowie der offiziellen deutschsprachigen Fassung der EN 14177:2003. Medieninhaber und Hersteller: Österreichisches Normungsinstitut, 1020 Wien Copyright ON Alle Rechte vorbehalten; Nachdruck oder Vervielfältigung, Aufnahme auf oder in sonstige Medien oder Datenträger nur mit Zustimmung des ON gestattet! Verkauf von in- und ausländischen Normen und technischen Regelwerken durch: Österreichisches Normungsinstitut (ON), Heinestraße 38, A-1020 Wien Tel.: (+43 1) , Fax: (+43 1) , sales@on-norm.at, Internet: Fortsetzung EN Seiten 1 bis 14 Fachnormenausschuss 205 Lebensmitteluntersuchungsverfahren Preisgruppe 11
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3 EUROPÄISCHE NORM EUROPEAN STANDARD NORME EUROPÉENNE EN Dezember 2003 ICS ; Deutsche Fassung Lebensmittel - Bestimmung von Patulin in klarem und trübem Apfelsaft und Apfelpüree - HPLC-Verfahren mit Reinigung durch Flüssig/Flüssig-Verteilung Foodstuffs - Determination of patulin in clear and cloudy apple juice and puree - HPLC method with liquid/liquid partition clean-up Produits alimentaires - Détermination de la teneur en patuline dans le jus de pommes et dans la compote de pommes, limpides et troubles - Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance avec purification par partage liquide/liquide Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 3.November 2003 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzen Stand befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhältlich. Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management- Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dänemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, der Slowakei, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn und dem Vereinigten Königreich. EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION Management-Zentrum: rue de Stassart, CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. B-1050 Brüssel Ref. Nr. EN 14177:2003 D
4 Inhalt Vorwort Anwendungsbereich Normative Verweisungen Kurzbeschreibung Chemikalien Allgemeines Natriumcarbonatlösung Eisessig Natriumsulfa Wasser Ethanol Ethylacetat Perchlorsäure Acetonitril Endogalacturonase Enzymlösung Mobile Phase für die HPLC Patulin-Stammlösung Patulin-Standardlösung Patulin-Standardlösung für die Kalibrierung Geräte und Hilfsmittel Allgemeines Kolbenhubpipetten Analysenwaage UV-Spektralphotometer Quarzküvetten Zentrifuge Zentrifugengefäße Rotationsverdampfer Filterpapier Einwegspritzenfilter HPLC-Gerät Rundkolben Durchführung Probenvorbereitung Extraktion des Patulins Entfernen störender saurer Bestandteile Herstellen der Probenmesslösung Zusatzversuche Klarer Apfelsaft Trüber Apfelsaft und Apfelpüree Apfelpüree HPLC-Messung Kalibrierkurve HPLC-Arbeitsbedingungen Berechnung Präzision Allgemeines Wiederholgrenze Vergleichgrenze Untersuchungsbericht Anhang A (informativ) Präzisionsdaten Literaturhinweise Seite 2
5 Vorwort Dieses Dokument (EN 14177:2003) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittel Horizontale Verfahren erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Diese Europäische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Juni 2004, und etwaige entgegenstehende nationale Normen müssen bis Juni 2004 zurückgezogen werden. Anhang A ist informativ. WARNUNG Bei der Anwendung dieser Europäischen Norm ist es möglich, dass gefährliche Substanzen, Arbeitsgänge und Geräte angewendet werden. Diese Norm erhebt nicht den Anspruch, dass alle mit ihrer Anwendung verbundenen Sicherheitsprobleme angesprochen werden. Es liegt in der Verantwortung des Anwenders dieser Norm, geeignete Vorkehrungen für den Arbeits- und Gesundheitsschutz zu treffen und vor der Anwendung festzulegen, welche einschränkenden Vorschriften gelten. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Dänemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, Slowakei, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn und Vereinigtes Königreich. 3
6 1 Anwendungsbereich Diese Europäische Norm legt ein hochleistungs-flüssigchromatographisches Verfahren (HPLC) zur Bestimmung von Patulin in Apfelsaft und Apfelpüree fest. Dieses Verfahren wurde für die Bestimmung von Patulin validiert durch Untersuchung von natürlich kontaminierten und aufgestockten Proben von klarem Apfelsaft in einem Bereich von 26 µg/l bis 128 µg/l, in trübem Apfelsaft in einem Bereich von 26 µg/l bis 106 µg/l und in Apfelpüree in einem Bereich von 23 µg/kg bis 121 µg/kg. 2 Normative Verweisungen Diese Europäische Norm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen. Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehend aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen dieser Publikationen nur zu dieser Europäischen Norm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation (einschließlich Änderungen). EN ISO 3696, Wasser für analytische Zwecke, Anforderungen und Prüfungen (ISO 3696:1987). 3 Kurzbeschreibung Trüber Apfelsaft und Apfelpüree wird mit Pektinase behandelt. Das Patulin wird aus dem Saft oder aus dem enzymbehandeltem Püree mit Ethylacetat extrahiert. Der Lösemittelextrakt wird durch Flüssig/Flüssig- Verteilung mit wässriger Natriumcarbonatlösung gereinigt. Der Ethylacetatextrakt wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Ethylacetates wird der Patulingehalt mit Hochleistungs- Flüssigchromatographie (HPLC) mit Ultraviolett (UV)-Detektor bestimmt. 4 Chemikalien 4.1 Allgemeines Falls nicht anders angegeben, werden bei der Untersuchung nur analysenreine Chemikalien und destilliertes Wasser oder Wasser der Qualität 1 nach EN ISO 3696 verwendet. Die Lösemittel müssen der für die HPLC erforderlichen Qualität entsprechen. 4.2 Natriumcarbonatlösung, Massenkonzentration ρ(na 2 CO 3 ) 15 g/l 1,5 g Natriumcarbonat werden in 100 ml Wasser gelöst. 4.3 Eisessig, Volumenanteil (CH 3 COOH) 98 % 4.4 Natriumsulfat, wasserfrei 4.5 Wasser, ph = 4 Wasser wird mit Essigsäure auf einen ph-wert von 4 eingestellt. 4.6 Ethanol, (CH 3 CH 2 OH) 99,7 % 4.7 Ethylacetat 4
7 4.8 Perchlorsäure, (HClO 4 ) = 60 % 4.9 Acetonitril 4.10 Endogalacturonase Enzymlösung, übliche Aktivität U/g Beschreibung für die Einheit U: Die Menge Enzym, die in 5 min eine 20-%-ige Viskositätsabnahme einer 1-%-Pektinlösung bei einem ph-wert von 3,4 bei 25 C hervorruft. ANMERKUNG Packungsgrößen von 100 ml bis 200 ml sind zweckmäßig Mobile Phase für die HPLC 95 Volumenteile Wasser werden mit 5 Volumenteilen Acetonitril (4.9) und 0,095 Volumenteilen Perchlorsäure (4.8) gemischt und entgast Patulin-Stammlösung WARNUNG Patulin ist vermutlich mutagen, von immunotoxischen und neurotoxischen Eigenschaften wird berichtet. Während der gesamten Untersuchung sollten Sicherheitsbrille und Handschuhe getragen werden und alle Arbeitsschritte während der Proben- oder Standardbehandlung sollten unter einem Laborabzug durchgeführt werden. 5 mg Patulin oder der Inhalt einer Ampulle (wenn Patulin als Film bezogen wurde) werden in Ethylacetat (4.7) gelöst. Die Lösung wird in einen 25-ml-Messkolben überführt und bis zur Marke mit Ethylacetat aufgefüllt, was einer Massenkonzentration von etwa 200 µg/ml Patulin ergibt. Diese Lösung wird im Kühlschrank bei unter 0 C aufbewahrt Patulin-Standardlösung µl Stammlösung (4.12) werden unter Stickstoff bis zur Trockne eingeengt und dann unverzüglich in 20 ml Ethanol (4.6) aufgelöst, was einen Massenanteil von etwa 10 µg/ml Patulin ergibt. Der exakte Patulingehalt dieser Lösung wird wie folgt bestimmt: Die Extinktionskurve dieser Standardlösung wird zwischen 250 nm und 350 nm in einer Quarzküvette (optische Länge: 1 cm) gegen Ethanol aufgenommen. Die Wellenlänge des Maximums wird bestimmt und der Massenanteil von Patulin, ρ pat, in Mikrogramm je Milliliter nach Gleichung (1) berechnet: M Hpat Amax A (1) Dabei ist A max die Extinktion der Patulin-Standardlösung im Absorptionsmaximum (hier: bei etwa 276 nm); M A das Molekulargewicht von Patulin (M = 154,12 g/mol); der relative molare Absorptionskoeffizient von Patulin in Ethanol (hier: m 2 /mol, wie in AOAC Official Methods, 1995, Natural Toxins, Patulin, C(d) die optische Schichtdicke der Küvette, in Zentimeter. Die Standardlösung wird im Kühlschrank bei unter 0 C aufbewahrt. So aufbewahrte Lösungen sind zwei Monate stabil. Die Standardlösung muss vor der Verwendung Raumtemperatur annehmen, um beim Öffnen des Kolbens einen Eintrag von Kondenswasser zu vermeiden. 5
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