Die Europäische Norm EN hat den Status einer Österreichischen Norm.
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- Rolf Hartmann
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1 ÖNORM EN Ausgabe: Normengruppe N Ident (IDT) mit ICS Lebensmittel Bestimmung von Vitamin D mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie Bestimmung von Cholecalciferol (D 3 ) und Ergocalciferol (D 2 ) Foodstuffs - Determination of vitamin D by high performance liquid chromatography - Measurement of cholecalciferol (D 3) and ergocalciferol (D 2) Produits alimentaires - Dosage de la vitamine D par chromatographie liquide haute performance - Dosage du cholécalciférol (D 3) et de l'ergocalciférol (D 2) Die Europäische Norm EN hat den Status einer Österreichischen Norm. Die ÖNORM EN besteht aus diesem nationalen Deckblatt sowie der offiziellen deutschsprachigen Fassung der. Medieninhaber und Hersteller: Österreichisches Normungsinstitut, A-1021 Wien Copyright ON Alle Rechte vorbehalten; Nachdruck oder Vervielfältigung, Aufnahme auf oder in sonstige Medien oder Datenträger nur mit Zustimmung des ON gestattet! Verkauf von in- und ausländischen Normen und technischen Regelwerken durch: ON Österreichisches Normungsinstitut, Heinestraße 38, Postfach 130, A-1021 Wien Tel.: (+43 1) , Fax: (+43 1) , sales@on-norm.at, Internet: Fortsetzung EN Seiten 1 bis 14 Fachnormenausschuss 205 Lebensmitteluntersuchungsverfahren Preisgruppe 10
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3 EUROPÄISCHE NORM EUROPEAN STANDARD NORME EUROPÉENNE EN Februar 2000 ICS Deutsche Fassung Lebensmittel - Bestimmung von Vitamin D mit Hochleistungs- Flüssigchromatographie - Bestimmung von Cholecalciferol (D 3 ) und Ergocalciferol (D 2 ) Foodstuffs - Determination of vitamin D by high performance liquid chromatography - Measurement of cholecalciferol (D 3) and ergocalciferol (D 2) Produits alimentaires - Dosage de la vitamine D par chromatographie liquide haute performance - Dosage du cholécalciférol (D 3) et de l'ergocalciférol (D 2) Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 2.Januar 2000 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzen Stand befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Zentralsekretariat oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhältlich. Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Zentralsekretariat mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dänemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, Spanien, der Tschechischen Republik und dem Vereinigten Königreich. EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION Zentralsekretariat: rue de Stassart, CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. B-1050 Brüssel Ref. Nr. D
4 Seite 2 Inhalt Vorwort Anwendungsbereich Normative Verweisungen Prinzip Chemikalien Geräte Probenahme Durchführung Berechnung Präzision Untersuchungsbericht... 9 Anhang A (informativ) Beispiele für geeignete HPLC-Systeme Anhang B (informativ) Beispiele für geeignete Extraktions- und Verseifungsbedingungen Anhang C (informativ) Beispiele für übliche Chromatogramme in der semipräparativen und analytischen HPLC Anhang D (informativ) Präzisionsdaten Literaturhinweise Seite Vorwort Diese Europäische Norm wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 "Lebensmittelanalytik - Horizontale Verfahren" erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Diese Europäische Norm muß den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis August 2000, und etwaige entgegenstehende nationale Normen müssen bis August 2000 zurückgezogen werden. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Dänemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, Spanien, die Tschechische Republik und das Vereinigte Königreich. Dieser europäische Norm-Entwurf gibt die Grundlage für Analyseverfahren wieder. Es ist vorgesehen, daß der Analytiker anhand dieser Rahmenbedingungen seine eigene Untersuchungsweise wählt, die in Übereinstimmung mit dieser standardisierten Vorgehensweise ist.
5 Seite 3 1 Anwendungsbereich Diese Europäische Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung von Vitamin D in Lebensmitteln mit Hochleistungs- Flüssigchromatographie (HPLC) fest. In der Mehrzahl der Lebensmittel ist Vitamin D von Natur aus in Form des Cholecalciferols, Vitamin D 3, enthalten, und dies ist die zu bestimmende Form. Vitamin D 2, Ergocalciferol, liegt manchmal in angereicherten Lebensmitteln vor und kann ebenfalls unter Anwendung dieser Europäischen Norm bestimmt werden. Einige Lebensmittel enthalten sowohl Vitamin D 3 als auch Vitamin D 2. Dieses Verfahren ist nicht auf solche Lebensmittel anwendbar. 2 Normative Verweisungen Diese Europäische Norm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen. Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehend aufgeführt. Bei starren Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen dieser Publikationen nur zu dieser Europäischen Norm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation. EN ISO 3696 Wasser für analytische Laborzwecke - Spezifikation und Prüfverfahren (ISO 3696:1987) EN ISO 5555 Tierische und pflanzliche Fette und Öle - Probenahme (ISO 5555:1991) 3 Prinzip Vitamin D 2 und D 3 werden in dem Lebensmittel mit alkoholischer Kaliumhydroxid-Lösung verseift und mit einem geeigneten Lösemittel extrahiert. Die Bestimmung von Vitamin D 2 oder D 3 erfolgt aus einer geeigneten Probenmeßlösung durch semipräparative Normalphasen-HPLC mit anschließender analytischer Umkehrphasen-HPLC. Bei der Bestimmung von Vitamin D 3 wird Vitamin D 2 als innerer Standard verwendet. Bei der Bestimmung von Vitamin D 2 wird Vitamin D 3 als innerer Standard verwendet. Vitamin D wird mit Ultraviolett (UV)-Spektralphotometrie detektiert. Die Peaks werden anhand ihrer Retentionszeiten und zusätzlich, falls mit einem Dioden-Array detektiert wird, anhand eines UV-Spektrums identifiziert. Der Massenanteil wird mit dem Verfahren des inneren Standards über die Peakflächen bzw. Peakhöhen bestimmt, siehe [1] bis [9]. 4 Chemikalien Falls nicht anders angegeben, werden bei der Analyse nur analysenreine Chemikalien und Wasser von mindestens Qualität 1 nach EN ISO 3696 verwendet. 4.1 Methanol 4.2 Ethanol, Volumenanteil ϕ (C 2 H 5 OH) = 100 % 4.3 Ethanol, ϕ (C 2 H 5 OH) = 96 % 4.4 Natriumsulfat, wasserfrei 4.5 Kaliumhydroxid, (KOH)-Lösungen KOH-Lösungen für die Verseifung, in geeigneten Konzentrationen, z. B. ρ(koh) = 50 g/100 ml oder 60 g/100 ml, oder alkoholische Lösungen, z. B. 28 g KOH in 100 ml einer Ethanol/Wasser-Mischung (9+1) ( V+V) KOH-Lösungen für die Extraktion, in geeigneten Konzentrationen, z. B. ρ(koh) = 5 g/100 ml 4.6 Antioxidantien, wie Ascorbinsäure (AS), Natriumascorbat, Pyrogallol, Natriumsulfid (Na 2 S) oder Butylhydroxytoluol (BHT). 4.7 Lösemittel und Extraktionsmittel, wie Diethylether (peroxidfrei), Dichlormethan, Petroleumbenzin (Siedebereich 40 C bis 60 C), n-hexan, Ethylacetat oder geeignete Mischungen davon. 4.8 Mobile Phasen für die HPLC Beispiele geeigneter Lösemittelmischungen für die semipräparative Normalphasen-HPLC in Volumenanteilen n-hexan + 2-Propanol (98 + 2), (99 + 1) oder (95 + 5); n-hexan + Isoamylalkohol (99 +1); n-hexan + 2-Propanol + Tetrahydrofuran ( ); Isooctan + Isobutanol (99 + 1);
6 Seite 4 n-heptan + 2-Propanol (97 + 3) Beispiele geeigneter Lösemittel und Lösemittelmischungen für die analytische Umkehrphasen-HPLC in Volumenanteilen Methanol; Methanol + Wasser (95 + 5) oder (93 + 7); Acetonitril + Methanol ( ), ( ) oder ( ); Acetonitril + Chloroform + Methanol ( ). 4.9 Standardsubstanzen Ergocalciferol-Standardsubstanz (Vitamin D 2 ), M(C 28 H 44 O) = 396,7 g/mol Die Vitamin D 2 (Ergocalciferol)-Standardsubstanz muß die höchste lieferbare Reinheit aufweisen (Massenanteil von mindestens 98 %) und ist nach den Vorschriften des Herstellers aufzubewahren (unter Lichtausschluß, üblicherweise unter 4 C) Cholecalciferol-Standardsubstanz (Vitamin D 3 ), M(C 27 H 44 O) = 384,6 g/mol Die Vitamin D 3 (Cholecalciferol)-Standardsubstanz muß die höchste lieferbare Reinheit aufweisen (Massenanteil von mindestens 98 %) und ist nach den Vorschriften des Herstellers aufzubewahren (unter Lichtausschluß, üblicherweise unter 4 C) Stammlösungen Vitamin D 2 -Stammlösung Etwa 100 mg Vitamin D 2 (4.9.1) werden auf 1 mg in einen 100-ml-Meßkolben eingewogen, in Ethanol (4.3) gelöst, und die Lösung wird mit Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung enthält etwa 1 mg/ml Vitamin D 2. Die Lösung wird bei weniger als 4 C und lichtgeschützt aufbewahrt. Die Massenkonzentration der Stammlösung und der Massenanteil der Vitamin D 2 -Standardsubstanz werden nach dem in beschriebenen Verfahren berechnet Vitamin D 3 -Stammlösung Etwa 100 mg Vitamin D 3 (4.9.2) werden auf 1 mg in einen 100-ml-Meßkolben eingewogen, in Ethanol (4.3) gelöst, und die Lösung wird mit Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung enthält etwa 1 mg/ml Vitamin D 3. Die Lösung wird bei weniger als 4 C und lichtgeschützt aufbewahrt. Die Massenkonzentration der Stammlösung und der Massenanteil der Vitamin D 3 -Standardsubstanz werden nach dem in beschriebenen Verfahren berechnet Standardlösungen ANMERKUNG: Die Massenkonzentrationen der Standardlösungen können falls nötig und je nach Untersuchungsbedingungen verändert werden Vitamin D 2 -Standardlösung 1 ml Vitamin D 2 -Stammlösung (4.10.1) wird in einen 100-ml-Meßkolben pipettiert und mit Ethanol (4.3) bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung enthält etwa 10 µg/ml Vitamin D 2. Diese Lösung ist am Verwendungstag herzustellen. Die Absorption der Vitamin D 2 -Standardlösung wird in einer 1-cm-Quarzküvette bei 265 nm gegen Ethanol (4.3) gemessen. Die Massenkonzentration an Vitamin D 2, ρ D2, in der Standardlösung wird nach Gleichung (1) berechnet: Dabei ist: A 265 der Absorptionswert der Vitamin D 2 -Standardlösung bei 265 nm; 475 der E 1 % 1 cm-wert, siehe [10]. (1)
7 Vitamin D 3 -Standardlösung Seite 5 1 ml Vitamin D 3 -Stammlösung (4.10.2) wird in einen 100-ml-Meßkolben pipettiert und mit Ethanol (4.3) bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung enthält etwa 10 µg/ml Vitamin D 3. Diese Lösung ist am Verwendungstag herzustellen. Die Absorption der Vitamin D 3 -Standardlösung wird in einer 1 cm-quarzküvette bei 265 nm gegen Ethanol (4.3) gemessen. Die Massenkonzentration an Vitamin D 3, ρ D3, in der Standardlösung wird nach Gleichung (2) berechnet: (2) Dabei ist: A 265 der Absorptionswert der Vitamin D 3 -Standardlösung bei 265 nm; 480 der E 1 % 1 cm-wert, siehe [10] Lösung für den inneren Standard ANMERKUNG: Bei der Bestimmung von Vitamin D 2 wird Vitamin D 3 als innerer Standard verwendet. Bei der Bestimmung von Vitamin D 3 wird Vitamin D 2 als innerer Standard verwendet Vitamin D 2 -Lösung für den inneren Standard 10 ml Vitamin D 2 -Standardlösung (4.11.1) werden in einen 100-ml-Meßkolben einpipettiert und mit Ethanol (4.3) bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung ist am Verwendungstag herzustellen Vitamin D 3 -Lösung für den inneren Standard 10 ml Vitamin D 3 -Standardlösung (4.11.2) werden in einen 100-ml-Meßkolben einpipettiert und mit Ethanol (4.3) bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung ist am Verwendungstag herzustellen Standardlösung von Vitamin D 2 und Vitamin D 3 für das semipräparative Verfahren 5 ml Vitamin D 2 -Standardlösung (4.11.1) und 5 ml Vitamin D 3 -Standardlösung (4.11.2) werden in den Kolben eines Rotationsverdampfers einpipettiert, und das Lösemittel wird schonend (bei maximal 40 C) entfernt. Die Rückstände werden in 50 ml mobiler Phase (4.8.1) für die semipräparative HPLC aufgenommen. Die Konzentration der Standardlösung für das semipräparative Verfahren darf, falls erforderlich, je nach HPLC- System (5.3 oder 5.4) modifiziert werden Standardlösung von Vitamin D 2 und Vitamin D 3 für die Untersuchung 5 ml Vitamin D 2 -Standardlösung (4.11.1) und 5 ml der Vitamin D 3 -Standardlösung (4.11.2) werden in den Kolben eines Rotationsverdampfers einpipettiert, und das Lösemittel wird schonend (bei maximal 40 C) entfernt. Die Rückstände werden in 10 ml mobiler Phase (4.8.2) für die analytische HPLC gelöst. 5 Geräte Übliche Laborgeräte und insbesondere die folgenden: 5.1 UV-Spektralphotometer, geeignet zur Messung bei 265 nm. 5.2 Rotationsverdampfer mit Wasserbad und Unterdruckvorrichtung ANMERKUNG: Es wird empfohlen, beim Aufheben des Unterdruckes Stickstoff zu verwenden. 5.3 Semipräparatives HPLC-System, bestehend aus Pumpe, Probeninjektionsvorrichtung, UV-Detektor, einem Gefäß zum Auffangen einer festgelegten aliquoten Menge des Säuleneluats und einem Schreiber/Datenintegrator. 5.4 Analytisches HPLC-System, bestehend aus Pumpe, Probeninjektionsvorrichtung, UV-Detektor und einem Schreiber/Datenintegrator oder einem ähnlichen Datenerfassungsgerät. 5.5 HPLC-Säulen Semipräparative Normalphasensäule, z. B. mit Kieselgel oder gebundenem Cyanamin, Teilchengröße 5 µm, Durchmesser 4,0 mm bis 8,0 mm, Länge 250 mm bis 300 mm. Zu weiteren Angaben siehe Anhang A.
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