Vorlesung: Zellbiologie Markus Gütlich

Transkript

1 Vorlesung: Zellbiologie 2008 Markus Gütlich

2 Das Cytoskelett von Fäden, Schläuchen und steifen Röhren Bilder aus: "kleinem Alberts" Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie Alberts et al., Kapitel 17

3 Komponenten des Cytoskeletts die Fäden die Schläuche die Röhren

4 Aufbau des Zytoskeletts - mechanisches Gerüst der Zelle - verantwortlich für die Form der Zelle -ermöglicht - Zellwanderung - Zellteilung - Muskelkontraktion - Transport der sekretorischen Vesikel 3 Zytoskelettsysteme in der Zelle Mikrofilamente (Aktin) Intermediärfilamente (Keratine etc. ) Mikrotubuli (Tubulin)

5 Intermediärfilamente "intermediär" dick (~10 nm) hohe Zugfestigkeit Schutz gegen mechanischen Stress

6 Intermediärfilamente bleiben erhalten, wenn die Zellen mit konz. Salzlösungen oder nichtionischen Detergenzien behandelt werden. Andere Teile des Cytoskeletts werden dabei zerstört. umringen den Zellkern bilden die Kernlamina Verstärkung unterhalb der Kernhülle enden oft an Desmosomen Zell/Zell Kontaktpunkten)

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8 Ein starkes, haltbares Netzwerk grün = Keratin

9 widerstandsfähig und seilartig hohe Zugfestigkeit N- und C-Terminus sind globulär Mittelteil ist stäbchenförmig bildet verdrillte Stränge

10 Monomere, Dimere, Tetramere α-helix im Monomer Supercoiled Helix im Dimer nichtkovalente Teramere

11 Polymere verdrillt zum "Seil" mehrer Gene "Mittelteile" sind alle ähnlich gleicher Durchmesser Kopfgruppen unterscheiden sich Kontakt zu anderen Proteinen

12 Vorkommen und Bedeutung Nervenzellen verstärken Axone von innen Muskelzellen, Epithelzellen (Haut, Blutgefäße)

13 mechanische Stabilität bei Wachstum und Bewegung mit Intermediärfilamenten Fasern werden gestreckt ohne Intermediärfilamenten Zellen zerreißen

14 mechanische Stabilität punktuell auftretende Kräfte werden verteilt "Faserverbundwerkstoff" GFK Stahlbeton Holz

15 Gruppen von Intermediärfilamenten 1. Keratinfilamente 2. Vimentin (und vimentinverwandte) Filamente 3. Neurofilamente 4. Kernlamine (bei Tieren)

16 Keratine sehr heterogene Klasse Darm Haut Fingernägel Haare(α-Keratin) Federn (β-keratin)

17 Plectin quervernetzendes Hilfsprotein bes. für Vimentin Verknüpft auch I.F. mit Actin und Tubulinfasern grün = Plektin, blau = Intermediärfilament, rot = Mikrotubuli

18 Krankheiten im Zusammenhang mit Intermediärfilamenten Epidermolysis bullosa simplex Ausbildung der Keratinfilamente ist gestört Haut ist sehr empfindlich gegen Verletzungen schon leichter Druck kann sie zerreißen lassen Mutationen im Plectingen Merkmale wie Epi. bullosa und Muskeldystrophie (reißen der I.F. im Muskel) Nervendegeneration (reißen der Neurofilamente) Mäuse sterben nach wenigen Tagen Bild:

19 Kernlamina: Unterstützung der Kernhülle Die Kernlamina eines Froscheies ist besonders regelmäßig (quadratisch)

20 Unterstützung der Kernhülle Lamine bilden ein 2D-Netzwerk Lamin Laminin Laminin = extrazelluläres Matrixprotein Laminnetzwerk zerfällt bei jeder Zellteilung Zerfall und Aufbau werden durch Kinasen und Phosphatasen gesteuert Phosphorylierung Konformationsänderung schwächere Interaktion der Tetramere Zerfall des Netzweks

21 Mikrotubuli die steifen Röhren

22 Mikrotubuli radial angeordnet wichtig für die Organisation der Zelle zerfallen vom Ende her und werden wieder aufgebaut in tierischen Zellen entspringen Microtubuli am "Zellzentrum" (Centrosom) "Schienensystem" für Transport von Vesiklen, Organellen u. a. Zellbestandteilen bestimmen die Lage membranumhüllter Organellen

23 Rolle der Microtubuli Interphasezelle cytoplasmatische Microtubuli geben der Zelle Struktur Mitose cytoplasmatische M. zerfallen M. bilden Mitosespindeln ziehen die Chromosomen auseinander

24 Microtubuli brauchen einen Ursprung Microtubuli brauchen ein organisierendes Zentrum Centrosom Spindelpol Basalkörper

25 Microtubuli in Fagellen und Cilien Flagellen und Cilien sind stabile Strukturen überdauern eine Zellteilung sitzen auf der Zelloberfläche sorgen für Bewegung (Flagellen) oder Flüssigkeitstransport (Cilien) in der Mitte tragen sie ein Bündel aus Microtubuli (bakterielle Falgellen sind völlig anders aufgebaut)

26 Struktur der Microtubuli bestehend aus Tubulin ( α und β ) α und β sind globulär und strukturell sehr ähnlich nicht kovalent verknüpft stapelbar α und β wechseln sich ab polarer Aufbau, β-ende = -Ende α-ende = Ө-Ende polarere Aufbau Richtung der Schiene

27 Microtubuli sind Hohlröhren zu seitlichem Kontakt fähig 13 parallele Protofilamente bilden eine Röhre zuerst ein Initialring dann werden immer neue Dimere angebaut in vitro geht's an beiden Enden aber am -Ende geht's schneller daher der Name

28 Microtubuli im EMI

29 Bildung der Microtubuli in speziellen Zentren bei Tieren am Centrosom (meist nahe am Zellkern) von hier aus strahlenförmig am Centrosom Ringe aus γ-tubulin jeder γ-tubulinring ist Ausgangspunkt für eine α/β-tubulinröhre

30 Centriolen Centrosom Centriolen Centriolen nur bei Tieren Funktion noch unbekannt ähneln den Basalkörpern der Cilien

31 Wachstum in vivo Ө-Ende im Centrosom Wachstum nur noch am -Ende ohne γ-tubulin keine Polymersiation in vivo in vitro geht's bei sehr hoher Konzentration dennoch

32 dynamische Instabilität zuerst nur Wachstum am -Ende dann spontan stop weiteres Wachstum Schrumpfung (vom -Ende aus) vollständiger Abbau gesteuert durch GTP

33 GTP als Steuerung jedes Tubulindimer kann GTP oder GDP binden Tubulin ist eine GTPase GTP haltige Dimere haben höhere Tendenz zur Multimerisierung sind dichter gepackt

34 Kinetik der Polymerisation es gibt immer Monomere im Cytosol bei schneller Polymerisation ist das Wachstum schneller als die Hydrolyse -Ende ist immer GTP beladen (GTP-capping) Microtubulus wächst immer weiter

35 aber: durch statistische Schwankungen ist manchmal die Hydrolyse schneller -Ende ist jetzt GdP beladen kann nicht mehr weiter wachsen Mikrotubulus schrumpft

36 Störung des Gleichgewichts Colchicin (aus der Herbstzeitlose) verhindert die Polymerisation Taxol (aus Eiben) verhindert die Depolymerisation verschiedene Ursache, gleiche Wirkung: keine Zellteilung mehr Colchicin Taxol

37 selektive Stabilisierung Anheftung von "capping"-proteinen Zelle wird polarisiert "wenn Fisch anbeist" bleibt die Schnur im Wasser ansonsten wird sie schnell wieder eingeholt

38 Microtubuli: die "Schienen" der Zelle Nervenzellen benutzen Tubulin als Transportweg bis zu 10 cm/tag Diffusion wäre viel zu langsam (Jahre)

39 Bewegung sekretorischer Vesikel nicht: durch Diffusion im Zytoplasma sondern: gerichtet entlang des Zytoskeletts ATP-verbrauchende molekulare Motoren

40 Vesikel bewegen sich entlang der Mikrotubuli anterograd: zur Zellperipherie hin (Richtung Plasmamembran) retrograd: zum Zellinneren hin (Richtung ER) retrograd anterograd wie kommt die Gerichtetheit zustande??

41 Motorproteine je 400 msec Mitochondien bewegen sich entlang der Mikrotubuli hierzu dienen die Motorproteine

42 Bewegung eines Motorproteins

43 Bewegung braucht ATP Wanderung entlang der Mikrotubuli Bewegungsenergie aus ATP Spaltung

44 Bewegungsmechanismus

45 Motorproteine: Kinesin und Dynein je zwei globuläre Kopfgruppen binden ATP hydrolysieren ATP (ATPasen) Bindung an Mikrotubuli ist gerichtet (vektoriell)

46 Kinesine und Dyneine Kinesin wandert zum -Ende vom Centromer weg auswärts gerichtet anterograd Dynein wandert zum Ө-Ende einwärts gerichtet retrograd

47 Frachttransport Für jeden Zweck der richtige Transporter

48 Bewegungen sichtbar machen Riesenaxon eines Tintenfisches Cytoplasma auspressen ATP zugeben Bewegungen verfolgen

49 in vitro Bewegungstest je 1 sec Mikrotubuli wandern auf dem Objektträger Kinesine ziehen sie vorwärts

50 in vitro Bewegungstest je 30 sec ein einzelnes Kinesinmolekül bewegt eine SiO 2 Kugel Kraftmessungen möglich

51 Strukturierung der Zelle Mikrotubuli ER Golgi Kern

52 Cilien und Flagellen Transport von Schleim (mit Staub) nach oben Epitheloberfläche des menschlichen Respirationstrakts (1 Mrd Cilien / cm²) im Eileiter: Transport des Eis zum Uterus

53 zwei Bewegungsmuster Kraftschlag Cilie ist gestreckt Erholungsschlag Cilie ist gebogen ergibt eine gerichtete Bewegung Transport von Flüssigkeiten oder Staub über die Zellen

54 Flagellen bei der Arbeit Spermien und Protozooen werden durch Flagellen angetrieben Flagellen sind meist länger als Cilien 400 Aufnahmen / sec Bewegung erfolg symetrisch in beide Richtungen wellenförmig als Antrieb geeignet

55 Topologie der Mikrotubuli in Flagellen 9+2 Anordnung von Microtubuli Dimeren Ciliendynein sorgt für eine Verbiegung des Flagellums

56 Bewegung durch Verbiegung freies Tubulin: Dynein verschiebt die Microtubuli arretiertes Tubulin mit Proteinbrücken Dynein verbiegt die Microtubuli

57 Actinfilamente die "dünnen Fäden"

58 Actinfilamente: Wir sorgen für Bewegung Mikrovilli am Bürstensaum des Darmepithels kriechen von Zellen auf Oberflächen Muskelbewegung kontaktiler Ring bei der Zellteilung

59 Entstehung der Aktinfilamente G(lobuläres)-Aktin = monomer ATP-abhängige Polymerisierung F(ilamentöses)-Aktin = polymer Aktinfilament sind polar: -Ende und Ө-Ende + - Aufbau Abbau

60 Topologie des Aktins Durchmesser 7 nm dünner als Mikrotubuli meist kürzer aber ca. 30 x mehr und Ө-Ende bilden häufig quervernetzte Netzwerke

61 Polymerisation von Aktin Aktinmonomere im Cytosol tragen stets ATP oder ADP die ATP haltige Form polymerisiert ATP Hydrolyse veringert die Stabilität des Aktin Polymers

62 Aktin und seine Partner Thymosin Profilin Gelsolin Myosin Filamin Fodrin

63 Quervernetzung durch: -Filamin -Fodrin -etc. 3-D Netzwerk

64 Beeinflussung der Aktinpolymerisation Inhibitoren der Polymerisierung Aktin-Bindeproteine Thymosin Profilin Cytochalasine (Pilzgifte) Inhibitoren des Abbaus Aktin-Bindeproteine Capping Proteine Jasplakinolide (Schwammgifte)

65 Phalloidin aus: products/buffers/phdr1.html grüner Knollenblätterpilz aus: Phalloidin bindet an F-Actin inhibiert die Depolymerisation

66 Aktin ca. 5% der Gesamtproteinmenge davon ½ in polymerer Form die Konzentration an freiem Aktin ist viel höher als K D warum polymerisiert es nicht spontan? Thymosin und Profilin regulieren die Polymerisiation Thymosin bindet an Aktinmonomere und verhindert deren Polymerisation Gelsolin kann Aktinnetze zerteilen und löslich machen

67 Kriechbewegung von Zellen aktiv kriechende Zellen Amöben (Dictyostelium discoideum), Makrophagen neutrophile Granulocyten an der Vorderseite stülpt der Leitsaum Fortsätze aus (Filopodien) die Fortsätze haften am Substrat an die Zelle zieht sich darüber hinweg

68 Der Cellcortex ist ein Aktinnetzwerk sitzt unterhalb der Membran stabilisiert diese vernetzt Spectrin und Ankyrin (Erythrocyten)

69 Lamellipodien und Filopodien Lamellipodien blattartig Filopodien aus Aktinfilamenten -Ende zeigt nach außen 0,1 µm breit 5-10 µm lang (bei Nervenzellen bis 50 µm lang) bilden die Spitze des Wachstumskegels am Axon Zelle "tastet" damit die Umgebung ab Filopodium können umgebaut werden und sich zurückziehen

70 Aktinfilamente in einem Lamellipodium capping Y-Verbindungen TEM Bild von Aktinfasern aus einem Frosch-Keratinocyten (sehr beweglich)

71 ARPs, Integrine und Myosin ARPs: actin-related proteins binden an vorhandene Aktinfilamente bilden Keime für neue Stränge Integrine Ankerpunkte für Aktingerüst in der Zellmembran Myosine Motorproteine für Aktin

72 Leitsaum eines Lamellipodiums neue Aktinfilamente entstehen durch Vermittlung des ARP- Komplexes an vorhandenen Filamenten wird seitlich angebaut wachsende Filamente schieben die Plasmamembran vorwärts rot = neuer Actinstrang orange = ARP-Komplexe blau = Capping-Protein grün = depolymerisierendes Protein am hinteren Ende erfolgt ATP Hydrolyse und Depolymerisation

73 Die Enden von Actinfasern A) Reflexions-Interferenzmikroskopie Aufnahme B) anti-aktin-antikörper Aktinfilamente enden dort, wo die Zelle an der Oberfläche haftet ( Integrine)

74 Das Motorprotein: Myosin-I Myosin bindet und hydrolysiert ATP Energie sorgt für Bewegung am Aktin entlang zum -Ende Aktin + Myosin Muskel

75 Die Myosine Myosin-I kommt in allen Zelltypen vor hat einen Kopf und einen Schwanz Kopfdomäne bindet an Aktin Kopfdomäne bindet und hydrolysiert ATP Schwanzdomänen unterscheiden sich jeder Schwanz bindet an einen bestimmten Zellbestandteil (z. B. Membranvesikel), der gezogen wird Myosin-II in Muskelzellen

76 G-Proteine steuern das Aktingerüst a) ruhender Fibroblast b) Mikroinjektion von aktiviertem Rac blattartige Lamellipodium c) Mikroinjektion von aktiviertem Cdc42 (Cell division cycle 42 homolog, GTP bindendes Protein, 25kDa) Bündelung des Aktingerüsts zu Filopodien

77 Muskeln glatte Muskeln Darm Blutgefäße quergestreifte Muskeln Skelettmuskeln Herzmuskeln

78 Myosin-II zwei Köpfe, zwei Schwänze coiled-coil Struktur im Dimer bipolare Struktur im Polymer nackte Zone in der Mitte besteht nur aus Schwänzen

79 Actin / Myosin Bindung jeder Myosinkopf bindet an Actin in Richtung -Ende Myosinfasern werden gegeneinander verschoben

80 Muskelzellen riesige Zellen (Muskelfasern) entstehen durch Verschmelzung viele einzelner Muskelzellen viele Zellkerne in einer Hülle im Cytoplasme vor allem Myofibrillen zylinderförmig 1-2 µm Durchmesser bestehen aus Ketten von Sarkomeren

81 Das Sarkomer ca. 2.2 µm lange Einheit dünnes Filament Actin dickes Filament Myosin ca. 300 Myosinköpfe pro Filament Z-Scheibe Ankerpunkt für Actinstränge

82 Kontraktion eines Sakomers

83 Muskelkontraktion gleichzeitiges Verkürzen der Sarkomere Actin und Myosin gleiten aneinader vorbei behalten ihre unrsprüngliche Länge Bewegung erfolgt unter ATP Verbrauch ca. 5 nm/einzelschritt bis zu 15 µm/sec ein Sarcomer voll entspannt ca. 3 µm voll kontrahiert ca. 2 µm in weiger als 1 µsec voll kontrahiert

84 Bewegung des Myosinkopfes 1) angeheftet - ohne ATP - rigor Konfiguration 2) frei - mit ATP 3) aufgerichtet - nach ATP Hydrolyse 4) vor dem Kraftschlag - Pi wird freigesetzt 5) Kraftschlag - ADP wird freigesetzt

85 Vermeidung einer Überdehnung Alberts et al. Molecular Biology of the Cell 4 th Edn., Seite 963 Titin verhindert das "heraus springen" der Filamente bindet an der Z-Scheibe an Teletonin ist aus zahlreichen Doänen aufgebaut der Titan unter den Proteinen 2 MiobpGen 363 Exons 82 KB mrna Aminosäuren 4200 kda

86 Steuerung durch Ca 2+ T-Tubuli (transversal) durchziehen jede Muskelfaser quer stellen Verbindung zum Sarcoplasmatischen Retikulum her

87 Sarcoplasmatischen Retikulum spezialisierte Form des ER kommt nur in Muskelzellen vor enthält eine sehr hohe Konzentration an Ca 2+ setzt nach membrandepolarisation Ca 2+ ins Cytosol frei

88 Ca 2+ -Kanäle im SR regieren auf Depolarisation in den T-Tubuli Ca 2+ wird aus dem SR freigesetzt Ca 2+ wird unter ATP Verbrauch wieder ins SR gepumpt

89 Steuerung der Kontraktion durch Ca 2+, Troponin und Tropomyosin Tropomyosin ist stäbchenförmig lagert sich seitlich an Actin an überspannt 7 Actin Monomere verhindert die Bindung von Myosin

90 Steuerung der Kontraktion durch Ca 2+, Troponin und Tropomyosin Troponin sitzt am Kopfende von Tropomyosin bindet Ca 2+ verursacht ein Konformationsänderung von Tropomyosin

91 Nervenzelle "feuert" Plasmamembran der Muskelzelle wird depolarisiert T-Tubuli werden depolarisiert Ca 2+ wird aus dem SR freigesetzt Ca 2+ Spiegel im Cytosol steigt Ca 2+ bindet an Troponin Troponin bewirkt Änderung der Struktur von Tropomyosin Tropomyosin gibt Myosinbindestelle frei Myosin bindet an Actin Muskel kontrahiert Muskel relaxiert Myosin lässt Actin im nächsten Zyklus los und kann nicht erneut binden Tropomyosin verhindert Myosin Bindung Tropomyosin bindet fest an Actin Troponin bewirkt Änderung der Struktur von Tropomyosin Troponin lässt Ca 2+ frei Ca 2+ Spiegel sinkt Ca 2+ wird ins SR zurück gepumpt

92 Mensch tot Ca 2+ "blutet" aus dem SR aus Ca 2+ Spiegel im Cytosol steigt Ca 2+ bindet an Troponin Troponin bewirkt Änderung der Struktur von Tropomyosin Tropomyosin gibt Myosinbindestelle frei Myosin bindet an Actin Muskel kontrahiert Totenstarre (rigir mortis) Muskel bleibt kontrahiert Ca 2+ Spiegel sinkt nicht mehr Ca 2+ wird nicht mehr ins SR zurück gepumpt