Transport- und Bewegungsprozesse der Zelle Insebesondere Protein-Targeting

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1 Themenkomplex: Transport- und Bewegungsprozesse der Zelle Insebesondere Protein-Targeting Gliederung 1) Transportprozesse: aktiver und passiver Transport (Ionenkanäle, Carrier, Pumpen) 2) Das Zytoskelett und Motorproteine 3) Protein-Targeting zum Endoplasmatischen Retikulum 4) Targeting und Translokation in andere Organellen (Schwerpunkt: Proteine) a. Zellkern b. Mitochondrien c. Chloroplasten d. Peroxisomen e. Lysosomen 5) ABC-Transporter

2 Allgemeine Transportprozesse Transport durch Membranen Es werden grundsätzlich vier Transportmechanismen unterschieden: (1) einfache Diffusion durch die Lipid-Doppelschicht (2) Passiver Transport a. freie Diffusion durch Kanäle b. erleichterte Diffusion durch spezifische Bindung an Protein-Carrier in der Membran (3) aktiver Transport, angetrieben durch ATP Hydrolyse (direkt oder indirekt). Transport-Energetik Diffusion ist ein Entropie-getriebener, also exergoner Prozess, bei dem sich Substanzen von Orten hoher zu Orten niedriger Konzentration bewegen. Er basiert auf der zufälligen thermischen Bewegung von Substanzen. Die Änderung der freien Energie während des Transports eines Nichtelektrolyten über die Membran per Diffusion steht mit der Differenz der Konzentrationen auf beiden Seiten der Membran in Zusammenhang: G = [ ci ] RT ln ; bei T=25 C gilt: [ c ] a [ ci ] G = 1,4kcal / mol log [ c ] a Wenn das Verhältnis c i /c a kleiner 1 ist, resultiert ein negatives Vorzeichen für die Änderung der freien Energie. Der Transport des gelösten Stoffes von außen nach innen findet also statt (Netto Influx). Der Einstrom findet solange statt, bis ΔG null geworden ist (das System hat sein GG erreicht). Handelt es sich bei dem gelösten Stoff um einen Elektrolyten, muss die Ladungsdifferenz zwischen beiden Seiten der Membran ebenso berücksichtigt werden. Je größer die Ladungsdifferenz (Potentialdifferenz in Volt), desto thermodynamisch favorisierter ist der Transport (typisches Membran-Potential ist ΔE = -70mV). Insgesamt basiert die Diffusion eines Elektrolyten also auf seinem elektrochemischen Gradienten (bestehend aus Konzentrationsgradient und Ladungsgradient): Einfache Diffusion durch Membranen [ ci ] G = RT ln + zf E, wobei: F = 23,06kcal / V mol [ c ] a Die Membran ist durchlässig für Stoffe, welche sie direkt passieren können oder welche eine Pore in die Membran spannen, um nicht in Kontakt mit den hydrophoben Lipiden des Bilayers zu kommen. Ob ein Stoff die Membran passieren kann, hängt von seiner Größe und Polarität ab. Kleine Moleküle diffundieren schneller durch die Membran. Der Verteilungskoeffizient (Partition-koeffizent) gibt die Polarität einer Substanz an. Es handelt sich um den Quotient der Löslichkeiten in unpolarem und wässrigem Lösungsmittel. Die Permeabilität der Membran (Wanderung der Substanz innerhalb der Membran in cm/s) steigt logarithmisch mit dem Partition-Koeffizient an.

3 Diffusion von Wasser durch die Membran Diffusion von Wasser: Membranen sind semipermeabel, weil Wasser sehr viel schneller durch sie diffundiert, als andere gelöste Moleküle. Wasser bewegt sich von Regionen niedriger Stoff- Konzentration zu Regionen hoher Stoff-Konzentration. Dieser Prozess wird Osmose genannt. Das Kompartiment hoher Stoff-Konzentration ist hypertonisch relativ zu dem mit niedriger Stoff- Konzentration (Gegenteil: hypotonisch). Sind die Stoff-Konzentrationen ausgeglichen, so sind die Lösungen isotonisch. Die Zellgröße wird durch die Differenz der Stoffkonzentrationen innerhalb und außerhalb der Zelle kontrolliert: wird die Zelle in ein hypertonisches (hypotonisches) Medium transferiert, so schrumpft (wächst) sie. Nach wenigen Minuten hat sich ihre normale Größe wieder erreicht, weil sie Ionen aktiv aus dem Medium aufnimmt (ins Medium abgibt). Im Verdauungstrakt wird die Flüssigkeit durch Darmepithelzellen osmotisch reabsorbiert. Tierische Zellen sind generell isotonisch, während Pflanzenzellen hypertonisch gegenüber ihrer Umgebung sind. Dadurch strömt Wasser in die Zelle, wodurch ein Turgor auf die Zellwand entsteht (der Turgor sorgt für Stabilität von nicht-hölzernen Pflanzen und Blättern) Wenn die Pflanzenzelle in hypertonisches Medium überführt wird, schrumpft sie (Plasmolyse), es kommt zum Welken. Passiver Transport Freie Diffusion von Wasser über Aquaporine Eine Klasse von integralen Membran-Proteinen, die Aquaporine, unterstützen die passive Bewegung von Wassermolekülen entlang der Membran. Jede Untereinheit beinhaltet einen zentralen Kanal, der von hydrophoben AS ausgekleidet ist. Hochselektiv wandern billionen Wassermoleküle pro Sekunde durch den Kanal (alle Moleküle nacheinander), während Protonen den Kanal nicht passieren können. An seiner engsten Stelle weist der Kanal positive Ladungen auf, die das Sauerstoffatom des Wassermoleküls anziehen und die H-Brücken Struktur zerstören, weshalb Protonen nicht von einem Molekül zum anderen springen können. Vasopressin stimuliert die Wasseraufnahme in der Niere über die Bildung solcher Poren. Liegt eine Mutation vor, reagiert die Niere nicht auf Vasopressin, wodurch große Mengen Urin ausgeschieden werden. Freie Diffusion über Ionenkanäle Membranen sind absolut undurchlässig für Ionen. Die meisten Ionenkanäle sind hoch spezifisch für ein bestimmtes Ion und können in einer offenen und in einer geschlossenen Konformation vorliegen ("gated" channels). Das Öffnen bzw. Schließen des Kanals kann durch verschiedene Kanal-spezifische Faktoren induziert werden. Man unterscheidet zwischen voltage-gated-channels, deren Konformation von der Differenz der Ionenladungen auf beiden Seiten der Membran abhängig ist und ligand-gated-channels, deren Konformation sich verändert, wenn ein bestimmter Ligand gebunden hat. Liganden können entweder von außen (z.b. Acetylcholin bei einigen Kation-Kanälen) oder von innen (z.b. camp bei Calcium-Kanälen) an den Kanal binden. prokaryotische Kalium-Kanäle

4 Der Kcs-A-Channel (bakterieller Kalium-Kanal) ist am besten untersucht und hochspezifisch für Kalium-Ionen. Er besteht aus vier Untereinheiten. Jede Untereinheit besteht aus zwei Membrandurch-spannenden Helices M1 und M2 und einer Porenregion P am extrazellulären Ende des Kanals. P besteht aus einer kurzen Helix, die ungefähr 1/3 in die Pore hineinragt und einer nicht-helikalen Loop-Region, welche einen engen Selektivitätsfilter bildet. Die Auskleidung des Selektivitätsfilters weist ein hochkonserviertes Pentapeptid auf (GYGVT), wobei die Backbone-Carbonylgruppen (bzw. das O der Tyrosin-Seitenkette) nach innen zeigen. 4 mal 5 Sauerstoff-Atome (1x5 von jeder Untereinheit des Kanals) bilden fünf aufeinanderfolgende Ringe mit einem Durchmesser von 3Å (Kalium Ion ohne Hydrathülle: 2,7Å). Die Sauerstoffatome des Polypeptid-Rückgrats ersetzen die Hydrathülle der Kalium-Ionen, während sie die Pore durchqueren. Nach diesem Modell gibt es vier potentielle Bindestellen für das Kalium-Ion (zwischen den Sauerstoff-Ebenen), wobei jedes Kalium-Ion von 8 Sauerstoffatomen koordiniert ist und immer nur zwei Kalium-Ionen gleichzeitig gebunden sein können (elektrostatische Abstoßung). Tritt ein drittes Kalium-Ion in die Pore, wird das erste auf der anderen Seite aus der Pore entlassen. Dehydratisierte Natrium-Ionen haben einen Durchmesser von 1,9Å, weshalb sie nicht optimal mit den Sauerstoff-Atomen des Selektivitätsfilters wechselwirken können, um innerhalb der Pore stabilisiert zu werden. Deshalb können die Natrium-Ionen die hohe Energiebarriere zum Eindringen in die Pore nicht überwinden. Das Gating eines homologen prokaryotischen Kalium-Kanals (MthK; von Kcs A konnte keine Kristallstruktur im geöffneten Zustand isoliert werden) wird durch Konformations-Änderungen der cytoplasmatischen Enden der M2-Helix ermöglicht. In der geschlossenen Konformation kreuzen sich die vier linearen M2 Helices zu einem Bündel auf der zytosolischen Seite. In der geöffneten Konformation biegen sich die Helices nach außen und binden an einen spezifischen Hinge-Point (Glycin-Rest). eukaryotische Kalium-Kanäle Eukaryotische Versionen der Kalium-Kanäle sind wesentlich komplexer. Es gibt eine Vielzahl von voltage-gated Kalium-Kanälen (Kv-Channels). Sie haben 6 Membran-assoziierte Helices (S1 bis S6), die zu zwei funktionell unterschiedlichen Domänen gehören: Poren-Domäne: beinhaltet Selektivitätsfilter und die Basis-Architektur des prokaryotischen Kanals (M1/M2/P sind homolog zu S5/S6/P). S5 und S6 werden durch P zusammengehalten. Voltage-Sensor-Domäne: S1 bis S4 erkennt die Spannung über die Plasmamembran.

5 Diese 6 Helices liegen viermal pro Kanal vor und sind symmetrisch angeordnet. Die S4 Helix beinhaltet positiv geladene AS und agiert als Schlüsselelement des Volt-Sensors: das negative Potential über der Membran hält den Kanal geschlossen. Eine Änderung des Potentials zu einem positiveren Wert (Depolarisation) übt eine elektrische Kraft auf die S4 Helix aus, wodurch sie ihre positiv geladenen AS, welche im Zytoplasma exponiert sind, an eine neue Position bewegt, wo sie außerhalb der Zelle exponiert werden. Es werden zwei unterschiedliche Modelle angenommen: Im konventionellen Modell (Elektrophysiologische Studien und nicht-kristallographische Strukturanalysen) werden die vier Membran-assoziierten Segmente der VS-Domäne als typische Transmembran-Helices, welche die Lipid-Doppelschicht durchspannen, angesehen. Im neuen Modell (Röntgenstrukturanalyse) sind S4 und S3 eher parallel zur Membran-Oberfläche angeordnet. Im konventionellen Modell wandert die S4 Domäne wie eine Schraube innerhalb der Membran nach oben und unten, um die positive Ladung zu verschieben. Im neuen Modell fungiert S4 wie ein Paddel innerhalb der Membran, das zwischen extrazellulärer und intrazellulärer Oberfläche hin und her schwingt. S6 Helix agiert so wie M2, um das Gating zu ermöglichen. Die Bewegung der S4 Helix als Antwort einer Depolarisation initiiert eine Konformations-Änderung in S6, wodurch sich der Kanal öffnet. Nun können über 100 Kalium-Ionen pro ms durch den Kanal strömen (fast so viele wie durch freie Diffusion). Nach wenigen ms wird der K + Influx aufgrund eines Inaktivierungs-Prozesses gestoppt. Die Inaktivierung wird durch die Bewegung des N-terminalen cytoplasmatischen Teils der Polypeptidkette in die Pore ermöglicht. Das Inaktivierungspeptid T1 am Ende einer baumelnden Polypeptidkette gelangt durch eines von vier Fenstern einer cytoplasmatischen Domäne zur Porenöffnung. Diese zytoplasmatische Domäne entsteht durch die ausgedehnten Linker-Peptide, welche die S1 Domänen miteinander verknüpfen. Nach einer bestimmten Zeit im inaktiven Zustand, verlässt das Inaktivierungs-Peptid die Pore, wobei der Kanal wieder im geschlossenen Zustand vorliegt. Es gibt eine Vielzahl von Kalium-Kanälen (c.elegans hat 90 verschiedene Gene, die für Kalium-Kanäle codieren). Die Voltzahl, welche benötigt wird, um den Kanal zu öffnen oder zu schließen kann auch vom Phosphorylierungszustand des Kanals abhängig sein. Dieser wird durch Hormone oder andere Faktoren reguliert. Erleichterte Diffusion durch Carrier

6 In vielen Fällen bindet die über die Membran zu transportierende Substanz selektiv an ein Membrandurch-spannendes Protein, das den Diffusionsprozess erleichtert. Die Bindung bewirkt eine Konformations-Änderung im Protein, wodurch die gebundene Substanz zur anderen Oberfläche der Membran exponiert wird, von wo aus sie entlang des Konzentrationsgradienten diffundieren kann. Der Transport ist nicht gekoppelt mit einem Energie-verbrauchenden Schritt, weshalb er lediglich vom Konzentrationsgradienten abhängig ist und somit in beide Richtungen funktioniert. Die erleichterte Diffusion folgt einer Sättigungs-Kinetik im Vergleich zur einfachen Diffusion, welche eine lineare Kinetik aufweist. V max der erleichterten Diffusion ist für alle realistischen Substrat-Konzentrationen erheblich höher als der v max der einfachen Diffusion. Zusätzlich kann die erleichterte Diffusion reguliert werden. Im Vergleich zum Transport von Ionen durch Kanäle, können über erleichterte Diffusion nur hunderte bis tausende Moleküle pro Sekunde transportiert werden. Glucose-Transporter (GLUTs) Humane Zellen haben 5 verschiedene Isoformen des GLUT (Glucose-Transporters), der eine erleichterte Diffusion von Glucose aus dem Blut in die Zelle ermöglicht. Sie unterscheiden sich in ihrer Lokalisation, Kinetik und Regulatorischer Charakteristik. Eine Erhöhung des Blutzucker-Spiegels erhöht die Sekretion von Insulin aus den endokrinen Zellen des Pankreas, wodurch die Aufnahme von Glucose in Muskelzellen und Adipocyten stimuliert wird. Insulin-abhängige Zellen (Muskelzellen und Fettzellen) haben GLUT4, dessen Konzentration innerhalb der Membran erheblich erhöht wird, wenn Insulin an Oberflächenrezeptoren gebunden hat. GLUT4 liegt bereits fertig translatiert innerhalb von Vesikeln vor der Plasmamembran vor. Insulin leitet per Signal-Kaskade die Verschmelzung der Vesikel mit der Plasmamembran ein. Aktiver Transport Die notwendigen vorhandenen Ionen-Gradienten über der Plasmamembran (Innen: 100mM K +, 10-20mM Na +, 10-7 mm Ca 2+ / Außen: 5mM K +, 150mM Na +, 10-3 mm Ca 2+ ) können nur durch aktiven Transport aufrechterhalten werden. Wie bei der erleichterten Diffusion, binden Substanzen spezifisch an bestimmte Transporter, wodurch eine Konformations-Änderung den endergonen Transport einleitet. Allerdings ist an diesem Prozess ein Energie-verbrauchender exergoner Schritt gekoppelt (ATP-Hydrolyse, Lichtabsorption, Elektronentransport, Fluss von Substanzen entlang ihres Gradienten). Proteine, welche aktiven Transport unterstützen, werden als Pumpen bezeichnet. Aktiver Transport funktioniert nur in eine bestimmte Richtung. Kopplung des aktiven Transports mit ATP-Hydrolyse: Die Na + -K + -ATPase In der Na + K + -Pumpe fungiert ein einziges Protein als Transporter und als ATPase. Die Natrium- und Kalium-Gradienten werden durch diese Na + K + -ATPase aufrechterhalten. Die intra- und extrazellulären Kompartimente sind jedoch elektrisch neutral (Anionen sind ebenso ungleich verteilt: Chlorid-Ionen mehr außerhalb der Zelle, wo sie Natrium-Ionen neutralisieren; Innen befinden sich negativ geladene Nukleinsäuren und Proteine, welche Kalium-Ionen neutralisieren).

7 Die Na + K + -ATPase besteht aus zwei verschiedenen Membran-durch-spannenden Untereinheiten. Die α-untereinheit bestimmt die Transport-Aktivität und die kleinere β-untereinheit sorgt für die Assemblierung der Pumpe innerhalb der Membran. Für jedes hydrolysiertes ATP gelangen drei Natrium-Ionen aus der Zelle und zwei Kalium-Ionen in die Zelle. Es handelt sich also um einen elektrogenen Transport, da nicht nur die Stoffe, sondern auch Nettoladung transportiert wird. Die Na + K + -ATPase ist eine P-Typ Ionen-Pumpe (P=Phosphorylierung). Bei diesem Typ wird während des Transfers der Substanz ATP hydrolysiert und die frei werdende Phosphat-Gruppe auf einen Aspartat-Rest des Transport-Proteins übertragen, wodurch eine Konformations-Änderung im Protein resultiert. Diese bewirkt erstens eine Verminderung der Affinität der Polypeptidkette zu den beiden zu transportierenden Ionen (dies ist notwendig, da die Ionen von einem Medium niedriger Konzentration aufgenommen werden müssen, und in einem Medium hoher Konzentration abgegeben werden sollen) und zweitens die Exposition der Ionen auf der gegenüberliegenden Seite der Membran. Der gesamte Pump-Zyklus umfasst folgende Schritte: (1) Protein bindet 3 Natrium-Ionen im Inneren der Zelle. (2) Protein wird phosphoryliert. (3) Übergang von der E1 zur E2 Konformation. (4) Abgabe der 3 Natrium Ionen und Aufnahme von 2 Kalium-Ionen. (5) Protein wird dephosphoryliert. (6) Übergang von E2 zur E1 Konformation, wodurch die 2 Kalium-Ionen abgeben werden. Nun kann ein neuer Zyklus starten; während der Übergänge werden die Bindestellen auf der gegenüberliegenden Seite exponiert und die Affinitäten zu den zwei Ionen moduliert. Diese Pumpe benötigt 1/3 der Energie einer normalen Zelle und zweidrittel der Energie einer Nervenzelle. Das Steroid Digitalis wird gegen die kongestive Herzinsuffizienz verabreicht und bindet an die Na + K + -ATPase. Es erhöht die Herzkontraktion durch eine Inhibierung des Transporters, wodurch sich nach einer Kettenreaktion die Calcium-Ionen-Verfügbarkeit im Herzmuskel erhöht. Die Natrium-Kalium Pumpe fungiert in primitiveren tierischen Organismen zur Aufrechterhaltung des Zellvolumens. Der Na-K Gradient spielt auch eine wichtige Rolle bei der Nervenreiz-Weiterleitung. Andere ATPasen Die Epithelzellen des Magens haben eine P-Typ ATPase (H + K + -ATPase), die 0,16 N HCl in den Magen sezerniert. Im inaktiven Zustand befinden sich die Pumpen in cytoplasmatischen Membran-Vesikel von parietalen Zellen der Magenwand. Wenn Nahrung den Magen erreicht, wird eine Hormon- Kaskade induziert, die zur Freisetzung von Histamin führt. Histamin bindet an Oberflächenrezeptoren der Säure-sezernierenden parietalen Zellen und bewirkt somit den Transport der Vesikel zur apikalen Zelloberfläche, wo sie mit der Plasmamembran fusionieren. Dadurch bilden sich tiefe Falten innerhalb der Membran (Canaliculi) und die Pumpen werden aktiv. Magensäure kann zu Sodbrennen führen. Prilosec ist ein Medikament gegen Sodbrennen, welches die H + K + -ATPase inhibiert. Andere Medikamente blockieren einen Rezeptor auf der Oberfläche der parietalen Zellen, wodurch die Hormone den Transport der Pumpen nicht mehr stimulieren können.

8 Pflanzenzellen haben eine P-Typ Protonen-Pumpe in ihrer Plasmamembran. Sie spielt eine wichtige Rolle im sekundären Transport von Substanzen, in der Kontrolle des zytosolischen ph-werts und in der Kontrolle des Zellwachstums (Ansäuerung der pflanzlichen Zellwand). V-Typ Pumpen nutzen die Energie aus der ATP-Hydrolyse, ohne einen phosphorylierten Protein- Übergangszustand zu erzeugen. V-Typ Pumpen transportieren Protonen und kommen in Membranen von Lysosomen, sekretorischen Granula und Vakuolen, sowie den Plasmamembranen einiger Zellen vor. Sie befinden sich z.b. innerhalb der Plasmamembran von Nierentubuli-Zellen, wo sie den Säure-Base-Haushalt des Organismus regulieren, indem sie Protonen in den Urin sezernieren. V-Typ Pumpen haben eine homologe Struktur zur ATP-Synthase (Komplex V der Atmungskette). Die Ca 2+ -ATPase ist in den ER-Membranen lokalisiert, wo sie aktiv Calcium-Ionen vom Zytosol ins ER Lumen pumpt. ABC-Transporter (ATP-binding cassette Transporter) stellen eine Superfamilie von aktiven Transportern dar, in der jeder Transport die gleiche ATP Bindedomäne aufweist. Nutzung von Lichtenergie für den aktiven Transport Halobacterium salinarium ist ein Archaebakterium, das in Umgebungen mit hohen Salzkonzentrationen lebt. Unter anaeroben Bedingungen wird die Plasmamembran dieser Bakterien aufgrund des Proteins Bakteriorhodopsin lila. Dieses Protein beinhaltet die prosthetische Gruppe Retinal. Die Absorption von Lichtenergie durch Retinal bewirkt eine Serie von Konformations- Änderungen im Protein, wodurch ein Proton von Retinal durch einen Kanal im Protein aus der Zelle wandert. Das fehlende Proton wird durch ein zytoplasmatisches Proton ersetzt. Die lichtgetriebene Protonen-Pumpe besteht aus 7 Membran-durch-spannenden Helices, wobei die Chromophore Retinal-Gruppe im Zentrum gelegen ist. Die Absorption eines Photons (gelber Bereich: 570nm), bewirkt die Dissoziation eines Protons aus der NH + Gruppe von Retinal, das zum benachbarten Aspartat des Proteins wandert. Über ein Relay-System aus verschiedenen negativ geladenen AS-Resten gelangt das Proton zur extrazellulären Seite der Membran (der Raum zwischen den AS-Resten ist mit Wasser gefüllt, wodurch der Protonen-Transport erleichtert ist). Ein in der Nähe der cytoplasmatischen Oberfläche der Membran gelegenes Molekül Asparaginsäure fungiert als Protonen-Donor für die freie Stelle im Retinal. Aspartat wird durch ein Proton aus dem Zytosol regeneriert. Der so erzeugte Protonen-Gradient wird vom Bakterium genutzt, um ATP zu synthetisieren. Kopplung des aktiven Transports an bestehende Ionen-Gradienten Das Aufrechterhalten von Konzentrations-Gradienten ermöglicht eine Variante zur Energiespeicherung in einer Zelle. Ionengradienten werden abgebaut, wenn Arbeit verrichtet wird. Im Darmlumen werden Polysaccharide zu Monosacchariden gespalten, die von Epithelzellen absorbiert werden. Die Bewegung von einem Molekül Glucose über die apikale Plasmamembran dieser Epithelzellen gegen seinen Konzentrationsgradienten (von Darmlumen in Epithelzelle) wird durch Cotransport mit 2 Natrium-Ionen ermöglicht (Na + -Glucose-Cotransporter). Eine Na + K + -ATPase innerhalb der lateralen und basalen Plasmamembran hält eine geringe Natrium-Konzentration innerhalb der Zelle aufrecht. Nach dem Transport in die Zelle diffundieren die Moleküle auf die

9 basale Seite der Zelle und werden mittels GLUT2 über erleichterte Diffusion in den Blutstrom abgegeben. Bei einem primär aktiven Transport wird direkt Energie verbraucht (Na + K + -ATPase). Glucose wird über einen sekundär-aktiven Transport transloziert, da es die durch ein primär aktives Transportsystem gespeicherte Energie ausnutzt. Transport-Energetik: [ ci ] G = RT ln + zf E = 1,4kcal / mol log X [ c ] a + 2 3,1 kcal / mol. X ist der Glucose-Gradient, der bei einem Symport mit 2 Natrium-Ionen erzeugt werden kann. Für X resultiert 1/ In Pflanzenzellen existiert ein Protonen-Saccharose-Symport. Neben den Symportern gibt es auch Antiporter, welche auch Austauscher genannt werden. Das Zytoskelett und Motorproteine Alle Zellbewegungen werden durch ATP angetrieben und benötigen Proteine, welche die ATP-Energie in Bewegung umsetzen. An allen Zell-Bewegungen ist das Zytoskelett beteiligt. Das Zytoskelett ist ein zytoplasmatisches System aus Fasern, das die Zellmembran versteift und Schienen bildet, auf denen Organellen und andere Elemente durch das Zytosol bewegt werden können. Es hat vier Funktionen: Strukturgebend, intrazellulärer Transport, Kontraktilität und Motilität (Flagellen), räumliche Organisation (Positionierung von Organellen). Das Zytoskelett ist dynamisch. Es befindet sich ständig im Umbau und erzeugt damit seinerseits ebenfalls Bewegung. Es lässt sich in drei Kategorien klassifizieren: 7-9nm dicke Mikrofilamente, 10nm dicke Intermediärfilamente und 24nm dicke Mikrotubuli. Die einzelnen Fasern des Zytoskeletts werden durch Polymere gebildet, die aus kleineren Proteinuntereinheiten bestehen, die über nichtkovalente Bindungen zusammengehalten werden.

10 Aktin Mikrotubuli Intermediärfilamente Zellen können Bewegung auf zwei verschiedene Weisen ausführen. Der erste Mechanismus beruht auf der Aktivität der Motorproteine, welche Energie aus der ATP Hydrolyse in eine Schreit- oder Gleitbewegung entlang von Mikrofilamenten oder Mikrotubuli umwandeln. Einige Motorproteine transportieren Membran-gebundene Zellorganellen oder Membranvesikel entlang der Faserschienen, während andere diese Fasern gegeneinander verschieben. Der zweite Mechanismus kommt vorwiegend bei der Änderung der Zellgestalt zum Tragen und beruht auf dem Auf- und Abbau von Mikrofilamenten und Mikrotubuli. Manche Bewegungsabläufe erfordern beide Mechanismen. Mikrotubuli (Tubulin) Mikrotubuli und Intermediärfilamente füllen den Raum zwischen dem Zellkern und der Zellmembran aus. Oft liegen beide Filament-Typen übereinander oder parallel zueinander. Mikrotubuli bilden die Grundlage für viele zelluläre Bewegungsformen (z.b. Schlagen von Cilien und Geißeln, intrazellulärer Transport von Membranvesikeln). Alle diese Bewegungen basieren entweder auf Polymerisation und Depolymerisation von Mikrotubuli oder auf der Aktivität von Mikrotubuli-Motorproteinen (beide Mechanismen sind für die äquatoriale Anordnung der Chromosomen während der Zellteilung erforderlich). Struktur von Mikrotubuli Der Mikrotubulus ist ein Polymer aus globulären Tubulin-Untereinheiten, die zu einem zylindrischen Rohr mit 24nm Durchmesser angeordnet sind. Das Polymer kann zwischen Bruchteilen eines μm und mehreren hundert μm lang sein. Der Mikrotubulus ist dreimal so dick wie ein Mikrofilament und mehr als doppelt so dick wie ein Intermediärfilament. Er ist wesentlich steifer (aufgrund der Röhrengestalt) als die anderen beiden Typen des Zytoskeletts. Die Untereinheiten sind Heterodimere aus α-tubulin und β-tubulin (bei allen Eukaryonten, Sequenzen stark konserviert, gehören zur Familie der GTPasen, starke WW im Komplex, daher kaum dissoziiert vorliegend). γ-tubulin spielt als Polymerisationskeim bei der Bildung von αβ-mikrotubuli eine entscheidende Rolle.

11 Jedes Heterodimer bindet zwei Moleküle GTP: α-tubulin bindet GTP irreversibel (nicht hydrolysierbar; Bindestelle an Kontaktfläche des α und β Monomers) und β-tubulin bindet GTP reversibel an Moleküloberfläche, sodass es zu GDP hydrolysiert werden kann. Die Bindestelle von β-tubulin ist damit austauschbar, da GDP durch GTP ersetzt werden kann. So steuert diese Bindestelle die Anlagerung von Tubulin- Untereinheiten an den Enden der Mikrotubuli. Durch Kopf-Schwanz Verknüpfung der Untereinheiten bildet sich das Protofilament (einzelner Strang); der Komplex α-tubulin-gtp und β-tubulin-gdp misst 8nm in der Länge. Die einzelnen Protofilamente lagern sich seitwärts aneinander und bilden so die zylindrischen Mikrotubuli. Nahezu alle Mikrotubuli in einer Zelle bilden eine Röhre (= Singulettstruktur), in der die Untereinheiten seitwärts gegeneinander versetzt sind (bilden Spirale oder Schachbrettmuster ) und die aus 13 Protofilamenten besteht. Neben der üblichen Singulettstruktur können sich Protofilamente auch zu Duplett-Mikrotubuli (kommen in Cilien und Geißeln vor) oder Triplett-Mikrotubuli (kommen in Centriolen und Basalkörpern vor) zusammenlagern. Duplett-Mikrotubuli bestehen aus einem A-Tubulus aus 13 Protofilamenten und einem B-Tubulus aus 10 Protofilamenten. Bei den Triplett-Mikrotubuli kommt noch ein C-Tubulus mit 10 Protofilamenten vor. Mikrotubuli weisen aufgrund der Kopf-Schwanz Anordnung der αβ-dimere eine Polarität (Plus- und Minus-Ende) auf. Das eine Ende des Mikrotubulus hat nur α-untereinheiten, während das andere Ende nur β-untereinheiten aufweist. Beide Enden haben unterschiedliche Einbaugeschwindigkeiten.

12 Mikrotubuli bilden zwei Populationen: sowohl permanente (stabil, langlebig), als auch transiente (dynamisch, kurzlebig) Strukturen sind möglich. Dynamische Mikrotubuli finden sich dort, wo ein schneller Umbau erforderlich ist (Mitose: Zytosolisches Netzwerk verschwindet, während Tubulin- Monomere den Spindelapparat bilden. In der Interphase bildet sich das Zytosolische Netzwerk zurück, der Spindelapparat verschwindet). In normalerweise nicht mehr replizierenden Zellen findet man stabile Mikrotubuli-Strukturen (das Axonem in der Geißel von Spermien bewirkt Beweglichkeit durch Mikrotubuli; Erythrozyten werden durch sie elastisch; die Axone der Neuronen werden durch Mikrotubuli gebildet) Das Wachstum der Mikrotubuli Struktur der MTOCs Interphasezelle: das gesamte Zytosol ist von einem Netzwerk von Mikrotubuli angefüllt. Das Netzwerk geht von einem einzigen Punkt in der Nähe des Zellkerns (Mikrotubuli- Organisationszentrum: MTOC) aus, wobei die einzelnen Mikrotubuli wie Speichen von einer Nabe nach außen laufen. Das MTOC in tierischen Zellen ist das Centrosom. Es besteht aus einem Netzwerk von Proteinen, welche die Mikrotubuli verknüpft und gelegentlich zusätzlich aus zwei Centriolen. Die Centriolen bestehen ihrerseits aus einer windradähnlichen Anordnung von Triplett-Mikrotubuli im Zentrum des MTOC, die keine Verbindung mit den Enden der Mikrotubuli eingehen. Keine Centriolen findet man u.a. in den MTOCs von Pflanzen und Pilzen. Die Fähigkeit zur Organisation von zytosolischen Mikrotubuli liegt in den Proteinen des MTOC. Das Centrosom bildet den Keim für die Polymerisation von zytosolischen Mikrotubuli, wobei meist das Minus Ende am Centrosom gebunden und die Plus Enden ein Wachstum aufweisen. MTOC ist wichtigste Organisationsstruktur der Zelle und hilft bei Bildung von Mikrotubuli-assoziierter Strukturen und Organellen (z.b. Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat). Bei der Zellteilung verdoppelt sich zuerst das Centrosom und wandert zu seinen neuen Positionen in der Nähe des Zellkerns. Hier entwickeln sie sich zu den Zentren der Astral- und Spindelmikrotubuli, welche später die Chromosomen auf die Tochterzellen verteilen Das pericentrioläre Material des MTOC ist eine geordnete Struktur aus mehreren Proteinen, die das Wachstum der Mikrotubuli einleiten. Zwei dieser Proteine sind γ-tubulin und Pericentrin. Der γ-tubulin-ringkomplex (γ-turc, 25S-Komplex, enthält 80% des gesamten zellulären γ-tubulins) bildet den Keim für die Tubulin-Polymerisation. Antikörper gegen γ-tubulin verhindern die Mikrotubuli- Bildung.

13 Auf- und Abbau von Mikrotubuli und Mikrotubuli-assoziierten Proteinen Dynamik der Mikrotubuli ist komplex, da sie schnell zwischen Wachstum und Verkürzung umschalten können. Erst ab einer bestimmten kritischen Konzentration von Tubulin-Dimeren erfolgt die Polymerisation von Mikrotubuli. Bei niedrigen Konzentrationen depolymerisieren die Mikrotubuli. Auf und Abbau der Mikrotubuli erfolgen bevorzugt am Plus Ende (per Definition das bevorzugte Ende). Der Abbau erfolgt z.b. doppelt so schnell am Plus wie am Minus Ende. Mikrotubuli zeichnen sich durch zwei dynamische Phänomene aus, die bei der kritischen Konzentration besonders ausgeprägt sind: Es werden ständig gleichzeitig an einem Ende Tubulin-Einheiten angefügt, während am anderen Tubulin-Einheiten abdissoziieren (Treadmilling-Effect). Dynamische Instabilität: Ein einzelner Mikrotubulus kann zwischen Phasen des Wachstums (Rescue) und der Verkürzung (Katastrophe) hin und herpendeln. Die dynamische Instabilität ist hauptsächlich am Plus-Ende zu beobachten, da das Minus-Ende am MTOC veranktert ist. Zwei Parameter beeinflussen die dynamische Instabilität: a. Alternierendes Wachstum und Schrumpfen erfolgen um den Wert der kritischen Tubulin- Konzentration. b. Ein Mikrotubulus wird instabil und depolymerisiert vier mal schneller, wenn das Plus Ende GDP-β-Tubulin statt GTP-β-Tubulin trägt. Dies passiert, wenn rasche Depolymerisation GDPβ-Tubulin zum Vorschein bringt oder wenn das Wachstum so langsam verläuft, dass die Hydrolyse von GTP stattgefunden hat ( GTP Kappe am Plus Ende des Mikrotubulus geht verloren), bevor eine weitere Untereinheit an das Plus Ende angelagert wurde. Der Stabilitätsbestimmende Faktor ist die Geschwindigkeit mit der GTP-Tubulin ans Plus Ende angelagert wird.

14 Im Allgemeinen ist die Polymerisationd er Mikkrotubuli innerhalb der Zelle begünstigt, da die Mikrotubulikonzentration mit 10-20µM größer ist als die kritische Mikrotubulikonzentration von 0,03µM. Verschiedene Proteine kontrollieren die Häufigkeit des Hin und Herwechselns zwischen Auf und Abbau: Katanin führt zur Bildung von Keimen an den Centrosomen (es schneidet Mikrotubuli aus den Centrosomen heraus und setzt sie ins Cytosol frei; dies ist für Epithelzellen notwendig, da sie Mikrotubuli in Gegenrichtung anordnen). Op18 bindet an Tubulin-Dimere. Der Mechanismus des Abbaus ist grundsätzlich verschieden von dem des Aufbaus. Die Enden sich verkürzender Mikrotubuli erscheinen pinselartig mit auseinandergebogenen Protofilamenten, die keine seitlichen WW miteinander eingehen, während die Enden bei Polymerisation glatt sind. Ohne die seitlichen stabilisierenden WW depolymerisieren die einzelnen Protofilamente rasch, indem die Tubulin-Untereinheiten dissoziieren (Katastrophe). Die Depolymerisation verläuft schneller als die Polymerisation. Unterbindung der Dynamik der Mikrotubuli durch Colchicin Die intrazelluläre Konzentration von Colchicin, Taxol und Vinblastin kann leicht gesteuert werden. Außerdem binden sie ausschließlich an αβ-tubulin, weshalb sie für die Untersuchung der Mikrotubuli-Dynamik eingesetzt wurden. In der Medizin werden solche das Mikrotubuli-Wachstum hemmende Substanzen gegen Krebs eingesetzt, da sie die unkontrollierte Zellteilung verringern, indem sie die Ausbildung der mitotischen Spindel hemmen. Colcemid ist eine dem Colchemin verwandte Verbindung. Bei hohen Konzentrationen depolymerisieren die Mikrotubuli (nur das MTOC bleibt intakt). Es wird für cytogenetische Untersuchungen eingesetzt, da es eine antimitotische Wirkung besitzt. Tubulin-Dimere haben eine hochaffine Bindungsstelle für Colchicin (praktisch irreversible Bindung). Tubulin-Colchicin-Komplexe können an die Enden wachsender Mikrotubuli angelagert werden. Eine einzelne Einheit eines solchen Komplexes am Ende des Mikrotubulus unterbindet eine weitere Anlagerung, sowie die Dissoziation von Tubulin. Die Wachstumsdynamik wird eingeschränkt, da ein Mikrotubulus Ende vergiftet wurde. Bei niedrigen Colchicin Konzentrationen kann sich aufgrund dieser Hemmung der Mikrotubulus-Dynamik keine mitotische Spindel ausbilden. Niedrige Konzentrationen von Taxol oder dessen Derivat Vinblastin stabilisieren Mikrotubuli durch Bindung (an anderen Stellen als Colchicin) und Einschränkung der Dynamik. Hohe Konzentrationen

15 von Vinblastin fördern Depolymerisation und führen zur Bildung von Vinblastinparakristallite (kristalline Mikrotubuli). Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) MAPs vernetzen Mikrotubuli miteinander und mit anderen Strukturen und weisen eine Mikrotubuli-bindende Aktivität auf. Man unterscheidet verschiedene Gruppen, die stabilisierende und destabilisierende Effekte auf Mikrotubuli haben können. Assembly-MAPs (Typ-1 MAPs) Solche verknüpfen zytosolische Mikrotubuli untereinander. Sie weisen zwei Domänen auf: eine basische Mikrotubuli-bindende Domäne und eine saure abstehende Domäne. Die abstehende Domäne bindet an Membranen, Intermediärfilamente oder andere Mikrotubuli binden, wobei ihre Länge bestimmt, wie weit die Mikrotubuli auseinander stehen. Aufgrund ihrer AS Struktur können Assembly MAPs in zwei Klassen eingeteilt werden: MAP1A und MAP1B. Beide enthalten mehrere Wiederholungen der AS Sequenz Lys-Lys-Glu-X, welche die Bindestelle für das negativ geladene Tubulin darstellt. Sie stabilisieren die elektrostatische Abstoßung der Tubulin-Einheiten und stabilisieren so das Polymer. Es handelt sich um lange fadenförmige Proteine, die beide vom gleichen Vorläufer-Polypeptid abstammen, das in eine leichte und in eine schwere Kette gespalten wird. Typ-2 MAPs Außerdem gibt es drei verschiedene Typ 2 MAP Moleküle: MAP2, MAP4 und das Tau Protein. Diese Proteine weisen vier Wiederholungen einer 18 AS langen Sequenz in der Mikrotubuli-bindende Domäne auf. MAP2 in Dendriten: bildet faserartige Quervernetzungen zwischen Mikrotubuli und zu Intermediärfilamenten. MAP4 ist in Neuronen und anderen Zellen am weitesten verbreitet. Das Protein Tau ist ein kleines MAP und kommt in Axonen und Dendriten vor. Es vernetzt Mikrotubuli zu dicken Bündeln und ist entscheidend für die Stabilität der Axone.

16 Allgemeine Bedeutung der MAPs Wenn die Außenwand eines Mikrotubulus von MAPs bedeckt ist, können die Tubulin-Untereinheiten nicht mehr von dem Ende des Mikrotubulus dissoziieren. Die Depolymerisation wird also durch MAPs verlangsamt. Die Polymerisation hingegen wird je nach MAP Typ unterschiedlich beeinflusst: Tau und MAP4 fördern die Polymerisation, während andere keinen Einfluss zeigen. Eine Regulation der Bindung von MAPs an die Mikrotubuli bedeutet also auch eine Regulation des Wachstums der Mikrotubuli. Dies wird über eine Phosphorylierung / Dephosphorylierung (keine Bindung möglich, Depolymerisation bevorzugt) der abstehenden Domäne des MAP erreicht. Die Phosphorylierung wird durch die MAP-Kinase (Bestandteil der zellulären Signaltransduktion) und cdc2-kinase (steuert Proteinaktivitäten während des Zellzyklus) katalysiert. intrazellulärer Transport Membran-umhüllte Vesikel, Proteine und Organellen werden intrazellulär entlang wohldefinierter Wege zu genau bestimmten Zielorten transportiert. Die dafür verwendeten Schienen sind die Mikrotubuli, auf denen Mikrotubuli-Motorproteine fahren, die genannte Lasten tragen. Schneller axonaler Transport Weder in den Axonen, noch in den Synapsen können Proteine synthetisiert werden. Die benötigten Proteine müssen im Zellkörper entstehen, wonach sie durch das Axon zur Synapse transportiert werden (axonaler Transport). Dieser Transport erfolgt entlang von Mikrotubuli, deren Plus Enden zur Spitze des Axons ausgerichtet sind. Anterograder Transport: vom Zellkörper zur Synapse (für axonales Wachstum sowie Wiederauffüllung der Membranvesikel in Synapse) Retrograder Transport: von Axon zum Zellkörper (alte Membranbestandteile aus den Synapsen zum Abbau in den Lysosomen des Zellkörpers) Nach der Geschwindigkeit des Transports kann man die transportierenden Materialien in drei Gruppen einteilen: 250mm/d = 3 μm/s: Membranvesikel Dazwischen: Organellen 1/x mm/d: polymerisierte Cytoskelett-Bestandteile

17 Dieser Transport funktioniert auch ohne intakte Zelle mit ähnlichen Geschwindigkeiten. Es ist der Transport zweier Organellen in entgegengesetzter Richtung möglich, ohne dass es zur Kollision kommt. Bewegung von Pigmentgranula Spezialisierte Pigmentzellen auf der Haut vieler Amphibien und auf den Schuppen vieler Fische ermöglichen den Transport von Pigmentgranula vom Zellinneren in die Zellperipherie und zurück. So sind diese Tiere in der Lage ihre Hautfarbe der Umgebung anzupassen. Bewegung intrazellulärer Membranvesikel Sie verläuft meist entlang von Mikrotubuli (in anderen Fällen sind auch Mikrofilamente am Transport beteiligt). Am besten bekannt ist der Transport von Golgi-Vesikeln: Mikrotubuli sind mit dem Golgi Apparat verbunden, der sich in der Nähe des MTOC befindet. Während der Mitose zerfällt der Golgi Apparat in Vesikeln, die sich in der gesamten Zelle verteilen. Sobald sich die Zytosolischen Mikrotubuli wieder bilden (Interphase) bewegen sich die Vesikel entlang der Mikrotubuli in Richtung auf das MTOC, wo sie wieder miteinander verschmelzen. Mikrotubuli sind auch mit dem ER assoziiert: Es existiert ein engmaschiges Netzwerk von tubulären Membranen im Zytosol, die an exakt den gleichen Stellen liegen wie die Mikrotubuli. Wenn Mikrotubuli (z.b. durch Colcemid) zerstört werden, verliert auch das ER seine netzwerkartige Struktur. Wird Colcemid entfernt bildet sich das ER erneut, wobei es in gleichem Maße wächst, wie die Mikrotubuli polymerisieren. Bestimmte Proteine koppeln die ER Membran an Mikrotubuli. Die Bewegung entlang von Mikrotubuli ist einer der Mechanismen mit denen das MTOC zelluläre Organellen wie ER und Golgi Apparat organisiert. Motorproteine Das Motorprotein Kinesin bewegt sich zum Plus Pol Das aus Tintenfischaxoplasma isolierte Kinesin hat ein MG von 380kDa und ist ein Dimer aus zwei schweren und zwei leichten Ketten. Es gibt auch Kinesine, die nur aus einer einzigen schweren Kette bestehen (die meisten sind allerdings Dimere). Es gliedert sich in drei Domänen: zwei große

18 globuläre Kopfdomänen, die über einen langen Stil (α-helikale Halsregion) mit einem Paar kleinerer globulärer Schwanzdomänen verbunden sind, die aus den leichten Ketten gebildet werden. Die Kopfdomänen binden an Mikrotubuli und ATP und sind für die Motoraktivität des Kinesins verantwortlich. Der Abstand beider Mikrotubuli-Bindungsstellen beträgt 5,5nm. Die Schwanzdomäne vermittelt die Bindung an Membranvesikel. Der Kinesin-Kopf zeigt einen ähnlichen Aufbau wie das Protein Ras und die Kopfgruppe von Myosin; Im Zentrum der Kopfdomäne befindet sich die Ras-Falte, an die ATP gebunden wird. Die Bindungsstellen für Mikrotubuli befinden sich an der Oberfläche der Domäne an Stellen, die den Aktin-bindenden Schleifen des Myosins entsprechen. Kinesin (vermittelt Bewegung auf Mikrotubuli) und Myosin (vermittelt Bewegung auf Mikrofilamenten) sind innerhalb der Evolution aus einem Vorgängerprotein hervorgegangen. Kinesin ist ein Motorprotein, das ausschließlich zum Plus Pol wandert. Es ist also für den anterograden Transport, sowie für den Transport sekretorischer Vesikel zur Plasmamembran und für radiale Bewegungen von ER-Membranen und Pigmentgranula verantwortlich. Kinesin wandert in Schritten von 8nm und entwickelt pro Schritt Kräfte von 6pN. Ein Schritt entspricht genau der Länge von αβ-tubulin, weshalb es nahe liegt, dass Kinesin nur an eine der beiden Untereinheiten bindet. Jedes Mitglied der Kinesin-Familie transportiert eine andere Fracht. Man kennt bisher 12 verschiedene Angehörige der Kinesin-Familie, welche alle die gleiche Kinesin-Motordomäne aufweisen, sich aber in den Schwanzdomänen und einigen weiteren Eigenschaften voneinander unterscheiden. Einteilung aufgrund der Lokalisation der Motordomäne: Motordomäne am N-Terminus: N-Typ Kinesin (wandert zum Plus Pol) Motordomäne in der Mitte: M-Typ Kinesin (wandert zum Plus Pol) Motordomäne am C-Terminus: C-Typ Kinesin (wandert zum Minus Pol) Aufgrund ihrer Funktion (=unterschiedliche Schwanzdomänen) lassen sich die Kinesine in zwei Gruppen einteilen Zytosolische Kinesine: Vesikel und Organelltransport (Bsp. K1F1B transportiert nur Mitochondrien; K1F1A transportiert synaptische Vesikel zum Axon-Ende; axonales Kinesin transportiert Lysosomen und andere Membran-umhüllte Organellen) (alle wandern zum Plus Ende)

19 Spindelkinesine = KRP (=kinsein-related-protein)-motorproteine: beteiligt bei dem Aufbau der Spindelapparates und der Trennung der Chromosomen während der Zellteilung (Bsp: BimC; wenige können auch zum Minus Ende wandern) Das Motorprotein Dynein bewegt sich zum Minus Pol Dyneine sind eine Protein-Familie großer multimerer Proteine mit Molekulargewichten von über 1MDa. Sie bestehen aus zwei oder drei schweren Ketten (470k- 540k) und einer bestimmten Anzahl mittelschwerer und leichter Ketten. Nach ihrer Funktion werden auch die Dyneine in zwei Klassen eingeteilt: Zytosolische Dyneine (beteiligt an Bewegung von Vesikel und Chromosomen) und Axonemdyneine (verantwortlich für das Schlagen von Cilien und Geißeln). Dynein ist wie Kinesin ein doppelköpfiges Molekül. Im Gegensatz zu Kinesin kann Dynein alleine keine Frachten transportieren. Es wird ein großer Komplex von Mikrotubuli-bindenden Proteinen (MBPs) benötigt. Jene MBPs verknüpfen Vesikel und Chromosomen mit Mikrotubuli, können aber selbst keine Kraft oder Bewegung hervorrufen. Das Protein Dynaktin bindet Dyneine an Vesikel. Kooperation zwischen Aktin- und Mikrotubuli-vermitteltem Transport Vesikel springen an der Zellperipherie von Aktin-vermitteltem Transport (Myosin-Motor) und Mikrotubuli-vermitteltem Transport (Kinesin- und Dynein-Motoren). Dies ist wichtig für Vorgänge wie Exozytose und Endozytose. Cilien und Geißeln Struktur und Bewegung Spermien und viele Protozoen bewegen sich schwimmend fort. Durch das Schlagen von Cilien und Geißeln (Flagellen) können Geschwindigkeiten von 1mm/s erreicht werden. Cilien und Geißeln sind peitschenähnliche Membran-umhüllte Fortsätze der Zelle, die von einigen μm bis zu 2mm (je nach Zelltyp) messen können. Beide Vertreter sind im Prinzip gleich aufgebaut, haben aber ein anderes Aussehen. Manche Zellen besitzen ein bis zwei lange Geißeln, andere viele kurze Cilien. Paramecium weist einige tausend Cilien auf, die der Fortbewegung und dem Einfangen von Nahrung dienen. Viele Epithelzellen der Säuger besitzen Cilien, mit denen sie Partikel über die Oberfläche des

20 Gewebes gleiten lassen können. Im Respirationstrakt (Nase, Pharynx, Trachea) von Säugern befinden sich über 10 7 Cilien pro mm², wobei sie dem Ablösen und Heraus befördern von Partikeln, die sich in den schleimigen Sekreten dieser Gewebe festgesetzt haben, dienen. Säugetierspermatozoen besitzen nur eine einzige Geißel zur Fortbewegung Der Schlag von Cilien und Geißeln setzt sich aus einer Serie von Wellen zusammen, die an der Basis der Cilie bzw. Geißel ihren Ursprung haben. Der Schlag kann in einer Ebene oder dreidimensional erfolgen und wird durch Amplitude, Wellenlänge und Frequenz charakterisiert. Die Zelle wird durch das Schlagen vorangetrieben; bei einem Epithel wird in analoger Weise die darüber liegende Flüssigkeitsschicht bewegt. Struktur von Cilien und Geißeln Cilien und Geißeln bestehen aus einem zentralen Mikrotubuli-Bündel, dem Axonem, das von neun Duplett-Mikrotubuli gebildet wird, die ein Paar von Einzel-Mikrotubuli umgeben ( 9+2 Struktur). Dieses Mikrotubuli-Bündel wird von der Plasmamembran umgeben. Das Axonem hat einen definierten Durchmesser von etwa 0,25 μm. Die L änge variiert von Organismus zu Organismus zwischen wenigen μm bis zu 2mm. Das Axonem ist mit dem Basalkörper verbunden (Befestigung an der Zelle). Basalkörper sind wie Centriolen zylindrische Strukturen (0,4 μm Länge und 0,2 μm Dicke) und bestehen aus neun Triplett- Mikrotubuli. Die A und B Mikrotubuli setzen sich in das Axonem fort, während die C Mikrotubuli nur bis zur Übergangszone zwischen Basalkörper und Axonem reichen. Die beiden zentralen Mikrotubuli der Geißel bzw. Cilie enden ebenfalls in dieser Übergangszone Basalkörper spielen für das Wachstum des Axonems eine entscheidende Rolle: die Verlängerung des Axonems erfolgt von der Spitze beginnend am Basalkörper An den α-tubuli jedes Duplett-Mikrotubulus (des Axonem) sind permanent zwei Dynein-Moleküle gebunden, dessen Arme nach innen in Richtung Zentrum und nach außen in Richtung Plasmamembran abstehen und zum B Tubulus des benachbarten Dupletts gerichtet sind. A und B Mikrotubuli werden durch das Protein Tektin zusammengehalten. Es ist hochgradig α-helikal und strukturell den Intermediärfilament-Proteinen sehr ähnlich. Jedes Tektin-Filament misst 2nm im Durchmesser und ist 48nm lang. Es verläuft der Länge nach an der Verbindungsstelle von A und B Tubulus und ist somit an der Bildung der gemeinsamen Wand von A- und B-Tubulus beteiligt. Das Axonem wird durch drei quervernetzende Strukturen zusammengehalten Die beiden mittleren Mikrotubuli sind über periodisch angeordnete Brücken miteinander verbunden und zudem von einer faserartigen Struktur (=zentrale Hülle) umgeben Das Protein Nexin verbindet benachbarte äußere Duplett-Mikrotubuli miteinander Die Radialspeichen gehen von dem Zentralpaar aus und gehen zu den A Tubuli der äußeren Dupletts. Es gibt 17 Polypeptide, welche Bestandteile der Radialspeichen und Speichen-Köpfe darstellen und essentiell für die Funktion der geißel bzw. Cilie sind Ausnahmestrukturen: Das parasitische Protozoon Dapilus besitzt das einfachste bekannte Axonem. Es besteht aus drei Duplett-Mikrotubuli ( 3+0 Struktur). Seine Geißel bewegt sich relativ langsam

21 (1,5 Schläge/s) in einem helikalen Schlagmuster. Außerdem wurden 6+0, sowie 9+0 Strukturen entdeckt. Je weniger Duplett-Mikrotubuli, desto niedriger ist die Schlagfrequenz der Geißel. Mechanismus der Bewegung Genauso wie die Muskelkontraktion beruht auch die Bewegung des Axonems auf dem Übereinander gleiten von Filamenten. Bei Cilien und Geißeln bestehen die Filamente aus Duplett-Mikrotubuli, deren Plus Enden alle zur äußeren Spitze des Axonems weisen. Die Krümmung des Axonems geschieht durch Kräfte, die das Übereinander gleiten von zwei Duplett-Mikrotubuli im gesamten Axonem ( Wellenbewegung ohne Dämpfung) antreiben. Dynein ist das Motorprotein in Axonemen. Die an dem A Tubuli gebundenen Dynein-Arme wandern auf den jeweils benachbarten B-Tubuli zum minus Ende. Dynein weist eine ATPase Aktivität auf, welche die Beschaffung der Energie dieses Prozesses ermöglicht. Die Gleitbewegung wird also durch wiederholtes binden und lösen der Querbrücken zwischen Dynein-Arme und B-Tubulus erzeugt Struktur der Axonemdyneine: sie weißen eine Blumenstrauß -Struktur auf. Jede Blüte dieses Straußes besteht aus einer großen globulären Domäne, die über einen kurzen Stil mit einer weiteren kleineren globulären Kopf Domäne verbunden ist. ein weiterer Stil verbindet eine oder mehrerer dieser Blüten mit der Basis. Über die Basis sind die Dyneine an den A-Tubuli verankert. Die kleinen Kopfdomänen binden an die benachbarten B-Tubuli Jeder globuläre Kopf des Dyneins wird zusammen mit dem jeweiligen Stil von einer schweren Kette (4500AS, 540k) des Dyneins gebildet. Die inneren Dynein-Arme sind immer zweiköpfig, die äußeren können bei manchen Organismen auch dreiköpfig sein. Die schweren Ketten zeigen ATPase Aktivität. Die leichten und die mittelschweren Ketten ordnen sich an der Basis der Dynein-Arme an (beteiligt an Verankerung der Arme am A-Tubulus und der Regulation der Dynein-Aktivität). Die Basisproteine entsprechen den Komplexen von MBPs, die mit Zytosolischem Dynein assoziiert sind. Umwandlung der Gleitbewegung in eine Krümmung des Axonems = Geißelschlag; Eine Krümmung kann immer dann entstehen, wenn ein Bereich, in dem die Mikrotubuli aneinander vorbeigleiten, auf einen Bereich trifft, der dieser Gleitbewegung einen Widerstand entgegen setzt. Es dürfen also nicht alle Dynein-Arme zur gleichen zeit aktiv sein. Durch zeitliche und örtliche Steuerung der Aktivität ist eine Krümmung der Geißel nach beiden Seiten von der Basis bis zur Spitze möglich. Die inneren Dynein-Arme entwickeln die für die Gleitbewegung erforderliche Kraft und sind für den Geißelschlag essentiell. Die äußeren Dynein-Arme erhöhen die Gleitgeschwindigkeit der äußeren Dupletts. Die Regulation der Geißelkrümmung wird wahrscheinlich von den Radialspeichen und dem zentralen Mikrotubuli-Paar übernommen. Der Dynein-Regulations-Komplex befindet sich an der Verbindungsstelle zwischen Radialspeichen und den inneren Dynein-Armen. Durch Phosphorylierung inaktiviert dieser Komplex die Dynein-Arme, während Dephosphorylierung sie wieder aktiviert. Intermediärfilamente (Vimentin) Vorkommen in nahezu allen vielzelligen Eukaryonten nachgewiesen. Nervenzellen enthalten mindestens zehnmal so viel IFs wie Mikrofilamente oder Mikrotubuli. IF füllen das gesamte Zytosol netzartig aus und sind mit der Plasmamembran assoziiert.

22 Intermediärfilamente haben ausschließlich strukturelle Aufgaben. Sie sind normalerweise mit einem Ende über Desmosomen oder Hemidesmosomen an der Zellmembran befestigt oder sie binden über IF-bindende Proteine an integrale Membran-Proteine. Intermediärfilamente dienen dem Zusammenhalt von Zellen in Gewebeverbänden. IF sind Strukturstabilisierend: sie verstärken die einzelnen Zellen und deren Verbindung zu Gewebsverbänden. Nägel und Haare sind tote Überreste von Epidermiszellen und bestehen größtenteils aus IF-Proteinen. Wichtigste Funktion: Verstärkung der Plasmamembran an Kontaktstellen zu anderen Zellen oder zur extrazellulären Matrix. IF sind wesentlich stabiler als Mikrofilamente oder Mikrotubuli. Unter Bedingungen, die zur Depolymerisierung der MF und MT führen, bleiben die IF polymerisiert. Der Durchmesser von 10nm ist namensgebend für die IF (liegt zwischen dem Durchmesser von MF und MT). IF bestehen aus α-helikalen stabförmigen Untereinheiten, die sich zu seilartigen Filamenten zusammenlagern. Der Zusammenbau der Untereinheiten benötigt keine Energie (es existiert keine Bindestelle für Nukleotide auf den Monomeren). Die 6 Gruppen der IF-Proteine Die Superfamilie der IF-Proteine ist hochgradig α-helikal und lassen sich aufgrund von Sequenzvergleiche in 6 Gruppen gliedern. Jede Protein-Klasse wird in jeweils bestimmten Geweben und Zelltypen gebildet. Sie unterscheiden sich im Gegensatz zu den Isoformen von Aktin und Tubulin erheblich in MG und in Sequenz. Typ I und II Proteine Saure und basische Keratine werden in Epithelzellen exprimiert. Es bilden sich Heterodimere, die sich zu heteropolymeren Keratin-Filamenten verbinden. Keiner der beiden Typen kann für sich alleine Filamente bilden. Es sind zahlreiche Keratin-Isoformen bekannt. Einteilung erfolgt in zwei Gruppen: ca. 10 Keratine sind für harte Epithelschichten spezifisch und bilden Nägel, Haare und Wolle. Ca. 20 weitere so genannte Cytokeratine werden in Epithelgeweben gefunden, welche die Körperhöhlen auskleiden. Jedes Epithelgewebe exprimiert eine charakteristische Kombination von Keratinen der Typen I und II. Typ III Proteine Vimentin, Desmin, das fibrilläre, saure Gliaprotein (GFAP) und Peripherin. Diese können homo- oder heteropolymere IF bilden. Vimentin-Filamente sind am weitesten verbreitet und haben Stützfunktion für zelluläre Membranen. Vimentin-Netzwerke und Mikrotubuli-Netzwerke sind häufig stark assoziiert. Das Vorkommen der anderen Proteine ist auf wenige Zelltypen beschränkt. Desmin stabilisiert Sarkomere im kontrahierenden Muskel, GFAP bildet IF in Gliazellen (umhüllen Nervenzellen), Peripherin liegt in Neuronen peripherer Nerven vor. Typ IV Proteine

23 Die Axone der Nervenzellen sind von einem zentralen Stab an Neurofilamenten (NF-L, NF-M, NF-H) erfüllt. Mikrotubuli sind für Längenwachstum der Axone, Neurofilamente für ihr Dickenwachstum verantwortlich. Typ V Proteine Lamine (A, B, C), welche ausschließlich im Zellkern vorkommen. Es handelt sich um eine Gruppe aus drei verschiedenen Proteinen (zwei unterschiedliche Spleiß-Produkte eines Gens, also nur zwei verschiedene Gene). Die Lamine bilden die nukleäre Lamina, ein Netz von Filamenten an der Innenseite der Kernmembran. Lamine A und C als Masche, Lamin B als Membranbindend bilden die Kernlamina. Typ VI Proteine Nestin Gemeinsame Strukturmerkmale, Polymerisation zu Filamenten Alle IF Proteine sind in drei Domänen strukturiert: ein zentraler α-helikaler Abschnitt wird von den globulären N- und C-terminalen Domänen flankiert. Die zentrale Domäne ist bei allen IF Proteinen konserviert und besteht aus vier langen α-helices, die durch drei nicht-helikale Bereiche voneinander getrennt sind. Die α-helikalen Segmente bilden Dimere mit superhelikaler Struktur. Die Polypeptidketten eines Dimers sind parallel zueinander angeordnet. Jeweils ein Paar dieser Dimere lagert sich seitlich, antiparallel zu einem Tetramer zusammen. Die Tetramere sind die Untereinheiten der IF. Sie lagern sich mit ihren Enden zusammen und bilden Protofilamente von 2-3nm Dicke, die sich jeweils zu zweit zu Protofibrillen zusammenschließen. Aus vier Protofibrillen bildet sich ein Intermediärfilament von 10nm Durchmesser. Wegen des symmetrischen Aufbaus der Tetramere besitzen die IF keine Polarität. Untereinheiten können über die gesamte Länge des Filaments und an beiden Enden eingefügt werden. MG und Sequenz der globulären Domänen sind für jedes IF Protein spezifisch. Diese Domänen kontrollieren Stabilität der Filamente, sowie seitliche WW mit anderen zellulären Komponenten. Sie

24 sind aber dennoch (Ausnahme: Keratine) für die Polymerisation unerlässlich (experimentell nachgewiesen: Proteolyse und Deletions-Mutagense). Vimentin, Desmin, GFAP und NF bilden Homodimere und schließen sich zu Homopolymeren zusammen, sind aber auch dazu in der Lage untereinander Heterodimere und somit Heteropolymere zu bilden. Keratine können nur Heterodimere aus saurem und basischem Keratin bilden, aber nicht mit den anderen IF-Proteinen. In den NF bildet NF-L als Homopolymer das Rückgrat, während sich NF-H und NF-M anlagern, sodass die meisten Neurofilamente alle drei IF-Proteine enthalten. IF sind erheblich stabiler als Mikrotubuli und Mikrofilamente, verhalten sich aber dennoch dynamisch (Einbau und Ausbau von Grundeinheiten ist an jeder Stelle des Filaments möglich). Es wird eine schnelle Dimerisierung der Monomere und eine anschließend schnelle Bildung des Tetramers angenommen, da 1-5% des Proteins als Tetramer vorliegt. Aufgrund der Stabilität müssen die IF während der Zytokinese weitgehend abgebaut werden. Calcium und verschiedene Kinasen kontrollieren die Organisation der Mikrofilamente und Mikrotubuli während des Zellzyklus. Vor der Mitose werden auf ähnlicher Weise IF unter dem Einfluss der cdc2-kinase abgebaut (und danach wieder aufgebaut). Phosphorylierung an bestimmten AS führt somit zur Destabilisierung der Polymere, wodurch ihr Wiederaufbau verhindert wird. IF-bindende Proteine und Organisation der IF in der Zelle Intermediärfilament-assoziierte Proteine (IFAPs) vermitteln WW zwischen einzelnen Intermediärfilamenten und verknüpfen diese zu Bündeln (Tonofilamenten) oder Netzwerken. Außerdem vermitteln sie die WW zwischen IF und anderen Zell-Strukturen (z.b. Plasmamembran). Das IFAP Plektin dient als Bindeglied zwischen Mikrotubuli und IF. Es kann seinerseits WW mit weiteren Zytoskelett-Proteinen eingehen, wie Spektrin, MAP und Lamin-B. Plektin weist wie die Gruppe III der Aktin-quervernetzenden Proteine am N-Terminus eine CH-Domäne auf. Plektin gehört zur Plakin-Proteinfamilie (N- und C-terminale globuläre Domänen, verbunden durch zentrale coiledcoil Domäne) und ist Bestandteil der Hemidesmosomen (die hier lokalisierten α 6 -β 4 -Integrine wechselwirken mit Plektin). Plektin bindet über die C-terminale Domäne an intermediäre Filamente und dient somit als Kopplunsprotein zwischen Integrin und u.a. dem Keratin-Netzwerk. Die Epithelzellen der inneren Organe und der Haut werden durch Desmosomen, die den Zell-Zell Kontakt vermitteln und Hemidesmosomen, die die Zellen an der darunter liegenden Basalmembran verankern zusammengehalten. Von diesen Protein-reichen Punkten gehen IF-Bündel aus, die ins Zytosol ragen. So sind die IF verschiedener Zellen über die Desmosomen miteinander verbunden, wodurch der Zellverband gefestigt ist. Desmosomen und Hemidesmosomen sind für die Zelladhäsion und die Stabilität von Geweben von entscheidender Bedeutung.

25 IF-Netzwerke (z.b. Kernlamina) findet man an Membranen, die durch jene mechanisch versteift werden. Die Kernlamina besteht aus Lamin A und Lamin C Filamenten, die zu einem rechtwinkligen Gitterwerk verbunden sind. Die Bindung des Netzwerks an die Membran erfolgt durch die WW zwischen Lamin B und IFAP innerhalb der Kernmembran (Lamin-B-Rezeptoren). Die IF im Zytosol sind in Strängen angeordnet, die von der Kernmembran zur Plasmamembran ziehen. Vimentin bindet sich an der Plasmamembran an Ankyrin (Aktin-bindendes Protein, das in allen Zellen mit Na + K + -ATPase assoziiert ist; Ausnahme: Erythrozyten und deren Vorläufer) und das IFAP Plektin, das auch in der Kernmembran vorhanden ist. Dadurch bildet sich eine flexible Stützschicht zwischen den Membranen. Die Sarkomere von Muskelzellen sind von Strängen aus Desmin-Filamenten umgeben. Sie ziehen sich vor allem um die Z-Scheibe herum und werden von verschiedenen IFAPs (u.a. Paranemin, Synemin, Ankyrin) mit der Plasmamembran verknüpft. Außerdem ziehen sie zu benachbarten Z-Scheiben, wodurch die Myofibrille als ganzes stabilisiert wird. In Längsrichtung verlaufende Desmin-Filamente verbinden benachbarte Z-Scheiben zweier Myofibrillen miteinander. Im Bereich der Z-Scheibe erfolgt die Stabilisierung des Desmin-Gerüsts über Synemin. Im Bereich der M-Linie ist das Desmin-Gerüst über eine durch Skelemin vermittelte WW mit dem Myosin-Filament an das Sarkomer gebunden. Die Desmin-Filamente wahren die regelmäßige Anordnung der Muskelfasern. Mikrofilamente (Aktin) Sich bewegende Zellen weisen eine Polarität auf (bestimmte Strukturen befinden sich nur an der Vorderseite, andere nur an der entgegengesetzten Seite). Eine Hautzelle (Keratinocyt) zeigt schnelle amöboide Bewegungsform. Die Hautzelle bildet ein Lamellipodium (große, breite Membran- Ausstülpung) aus. Nachdem dieses Kontakt mit dem Substrat hat, bildet es spezifische Strukturen (Adhäsionsplaques). Das Lamellipodium füllt sich schnell mit Zytosol, wodurch der hintere Teil nach vorn gezogen wird.

26 Ein Fibroblast zeigt eine langsame Bewegungsform. Ausstreckung dünner Membran-Finger (Filopodien) oder Ausbildung von Lamellipodien. An den Stellen, an denen die Zelle das Substrat berührt, bilden sich auf der Unterseite der Zelle Adhäsionsplaques. Wenn die Zelle sich weiter in dieselbe Richtung bewegt, wird der hintere Teil des Zellkörpers vorwärts gezogen, wobei eine Spur kleiner Zellreste zurückbleiben kann. Nicht alle Abschnitte der Zellmembran bilden am Leitsaum der Zelle stabile Adhäsionsstellen. Sie ragen vielmehr in Form von faltenförmiger Kräuselungen nach oben, die sich wellenförmig entlang der Oberseite der Zelle zum hinteren Teil des Zellkörpers zurückbewegt. Die beschriebenen Bewegungen werden durch das Aktin-Zytoskelett angetrieben. Am Leitsaum liegen radial orientierte Faserbündel, während längs angeordnete Faserbündel (Stressfasern) den Zellkörper durchziehen. Außerdem ist die Zelle von einem Netzwerk aus einzelnen Aktin-Filamenten ausgefüllt. Die Gestalt einer Zelle wird durch den Auf und Abbau von Aktin-Filamenten bestimmt. Das Zytoskelett muss sich in beweglichen Zellen rasch aufbauen lassen und kann nicht immer hochorganisiert sein.

27 Eigenschaften und Struktur von Aktin Aktin ist das häufigste Protein in einer eukaryotischen Zelle (In Muskelzellen 10% aller Proteine, in anderen Zellen 1-5% bzw. 0,5mM im Zytosol). In bestimmten Strukturen wie den Mikrovilli kann der Aktin-Gehalt an bestimmten Stellen zehnmal höher sein. Aktin ist ein mittelgroßes Protein aus 375 Aminosäuren (42kDa) und wird von einer Familie hochkonservierter Gene codiert. Manche Einzeller haben nur ein Aktin-Gen, Menschen 6 und manche Pflanzen sogar 60, welche Isoformen des Proteins codieren. Die Aminosäure- Sequenzen von Aktin-Proteinen aus Amöben und höheren Tieren sind in 80% der Positionen identisch. In Wirbeltieren kommen vier Isoformen von α-aktin und in Nichtmuskelzellen zwei weitere Isoformen (β-aktin und γ-aktin) vor. Sie unterscheiden sich in vier oder fünf Aminosäuren, übernehmen dennoch ganz spezifische Funktionen: α-aktin ist Bestandteil kontraktiler Strukturen, β-aktin ist an der Polymerisation der Aktin-Filamente am Vorderende wandernder Zellen beteiligt. Des Weiteren existieren Aktin-verwandte Proteine (Arps), welche 50% Homologie zu Aktin aufweisen. Der Arp2/3-Komplex besteht aus Arp2, Arp3 und fünf weiteren Proteinen. Wenn er aktiviert wird, verändert sich seine Konformation, wodurch er als Kern für die Polymerisation von Aktin-Monomeren dient. Aktin-Monomere können ohne den Arp2/3-Komplex schlecht polymerisieren (Arp1 ist mit Mikrotubuli und einem Mikrotubuli-Motorprotein assoziiert). Arp2/3 wird gewöhnlich durch WASPs (Wiskott-Aldrich Syndrom Protein Familie) aktiviert. Kontaktin ist ein Protein, das nicht zu dieser Familie gehört, aber dennoch Arp2/3 aktivieren kann. Aktin kann entweder in der Form des globulären Monomers (G-Aktin) oder als filamentöses Polymer (F-Aktin) vorliegen. Das Polymer zusammen mit weiteren gebundenen Proteinen wird als F-Aktin-Filament bezeichnet. Jedes Aktin-Molekül enthält ein Mg 2+ -Ion, das mit ATP oder ADP komplexiert ist. ATP-G-Aktin und ADP-F-Aktin sind die in der Zelle dominierenden Formen.

28 Das monomere G-Aktin (tellerförmig: 5,5x5,5x3,5 nm) besteht aus zwei blättrigen Hälften, die durch eine tiefe Spalte (ATPase-Falte) voneinander getrennt sind. Von der Spalte aus werden ATP und Mg 2+ über Ionen- und H-Brücken- Bindungen an AS-Ketten fixiert. Der Boden der Falte dient als flexibles Verbindungsglied, durch das sich die beiden Hälften zueinander beugen können. ATP bzw. ADP beeinflussen die Konformation von G-Aktin (ohne Nukleotid ist Denaturierung erleichtert). Polymerisation und Stabilität von F-Aktin Mg 2+, K + und Na + Ionen induzieren die Polymerisation von G-Aktin zu F-Aktin-Filamenten. Bei Erniedrigung der Ionenstärke folgt Depolymerisation. Polymerisation und Depolymerisation sind also frei reversible Prozesse. Bei der Zusammenlagerung von G-Aktin zu F-Aktin wird ATP zu ADP und P i hydrolysiert. Die Hydrolyse von ATP bestimmt jedoch nur die Geschwindigkeit der Polymerisation (wird für die Polymerisation selbst nicht benötigt). F-Aktin hat einen Durchmesser von 7-9 nm. Die einzelnen Monomere sind in einer eng gewundenen Helix angeordnet. In dieser Anordnung ist jedes Monomer von vier weiteren umgeben. Alle Untereinheiten in einem Aktin-Filament besitzen die gleiche Polarität (sie sind in gleiche Faserrichtung angeordnet). Aus diesem Grund ist ATP-Bindungstasche einer Aktin-Untereinheit nur an einem Ende des Filaments zugänglich (Minus Ende). Die ATP-Bindungstasche am Plus Ende wird von der benachbarten Untereinheit verdeckt. Dynamik der Aktin-Polymerisation Die Polymerisation von Aktin-Filamenten erfolgt in drei Phasen. Zunächst beobachtet man eine lag-phase, während der sich nur langsam kurze und instabile Oligomere aus G-Aktin bilden. Sobald diese Oligomere eine bestimmte Länge (3-4 Untereinheiten) erreicht haben, dienen sie als Keime, welche die zweite Phase einleiten. In dieser beginnt die rasche Verlängerung des Filaments durch Anlagerung von Monomeren auf beiden Seiten der Kette. Mit zunehmender Länge von F-Aktin sinkt die Konzentration des monomeren G-Aktins, bis sich ein Gleichgewicht zwischen beiden eingestellt hat. Dies ist die dritte Phase, die als Fließgleichgewicht bezeichnet wird. Es findet lediglich ein Austausch der G-Aktine am Kettenende, aber kein weiterer Aufbau mehr statt.

29 Die lag-phase lässt sich durch den Zusatz von Keimen umgehen. Die im Fließgleichgewicht vorliegende Konzentration an G-Aktin wird auch kritische Konzentration genannt. Sie ist ein Maß für die Polymerisationsfähigkeit von G-Aktin unter bestimmten Bedingungen. Die Nukleation der Aktin-Polymerisierung kann durch das Protein Formin erfolgen. Gleichzeitig zum Einbau neuer G-Aktin Monomere in das Filament, wird das gebundene ATP zu ADP hydrolysiert. Die Filamente bestehen also hauptsächlich aus ADP-F-Aktin. ATP-F-Aktin liegt nur an den Enden der Ketten vor. Auch ADP-G-Aktin oder Aktine ohne Nukleotide können polymerisieren, weshalb ATP keine Voraussetzung für die Polymerisation darstellt. In der Abbildung oben ist ADP-G- Aktin weiß und ATP-G-Aktin rot dargestellt. Das Plus Ende wächst fünf bis zehn mal schneller als das Minus Ende. Durch Beschichtung eines wachsenden F-Aktins mit Myosin konnten die Länge der unbeschichteten, glatten Enden miteinander verglichen werden (glattes Ninus Ende war fünf bis zehn mal kürzer als glattes Plus Ende). Die unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten der beiden Enden beruhen auf unterschiedlichen kritischen Konzentrationen: 0,1 μm für das Plus ende und 0,8 μm für das Minus Ende. Geringere Konzentrationen bewirken Depolymerisation, höhere bewirken Polymerisation an den jeweiligen Enden. Liegt die Konzentration von G-Aktin zwischen 0,1 und 0,8 μm, so dissoziieren Moleküle vom Minus Ende und polymerisieren am Plus Ende. Die Filament-Länge bleibt konstant, da die neu angefügten Monomere wie in einer Tretmühle zum Minus Ende wandern und dann wieder ab dissoziieren. Die kritische Konzentration ist abhängig davon, ob G-Aktin ATP oder ADP gebunden hat. Im Falle von ADP-G-Aktin ist die kritische Konzentration am Minus und am Plus Ende gleich. Toxine: Aktin-(De-)-Polymerisations-Inhibitoren Das Gleichgewicht zwischen Aktin-Monomeren und Aktin-Filamenten lässt sich durch Toxine stören. Das Pilzalkaloid Cytochalasin D bindet sich an das Plus Ende von F-Aktin und verhindert dort die weitere Anlagerung von Monomeren. Wegen der höheren kritischen Konzentration am Minus Ende kommt es zur Depolymerisation. Das von Schwämmen sezernierte Toxin Latrunculin bindet sich an G-Aktin und verhindert dessen Bindung an das Filament. Auch in diesem Fall wird das Monomer

30 Polymer Gleichgewicht in Richtung der Dissoziation verschoben. Phalloidin ist das Toxin des Knollenblätterpilzes. Es vergiftet die Zelle, indem es die Wiederauflösung von Aktin-Filamenten verhindert. Es lagert sich zwischen die einzelnen Untereinheiten des F-Aktins und verhindert die Depolymerisation unterhalb der kritischen Konzentration. Fluoreszenzmarkiertes Phalloidin wird zum mikroskopischen Nachweis von F-Aktin verwendet. Funktion einiger Aktin-bindender Proteine in Bezug auf Abbau und Aufbau Da Zellen eine nahezu konstante Ionenkonzentration aufweisen, bedarf es anderer Mechanismen für die Steuerung der Aktin-Polymerisation. Diese Steuerung erfolgt über regulatorische Aktin-bindende Proteine, die Aktin-Bildung fördern oder hemmen können. Thymosin-β 4 bewirkt Inhibition der Aktin-Polymerisation: Aktin-Konzentration innerhalb der Zelle ist 0,5 mm, kritische Konzentration von G-Aktin ist 0,1 μm. Es sollte nahezu das gesamte Aktin in Form von Filamenten vorliegen. Dennoch: bis zu 40% liegt als G-Aktin vor. Ursache: Die G-Aktin Konzentration wird durch die Bindung von Thymosin-β 4 an ATP-G-Aktin, wodurch es im Komplex nicht mehr polymerisieren kann, über der kritischen Konzentration gehalten. Thymosin-β 4 liegt im Zytosol in hohen Konzentrationen vor. Es handelt sich um ein kleines Protein mit 5kDa. In Thrombozyten ist seine Konzentration 0,55 mm und damit ca. doppelt so hoch wie die des unpolymerisierten G-Aktins. Es lässt sich berechnen, dass ca. 70% von G-Aktin an dieses Protein komplexiert sind. Thymosin-β 4 fungiert als Reservoir für monomeres Aktin. Wird es exprimiert, so wird der Abbau gefördert, da G-Aktin und F-Aktin im Gleichgewicht stehen. Wird es dagegen wieder abgebaut, so wird die Polymerisation gestartet. Profilin bewirkt die Aktivierung der Aktin-Polymerisation: Es handelt sich um ein 15kDa schweres Protein, das ebenso ein Komplex mit ATP-G-Aktin bildet. Es kann lediglich 20% des unpolymerisierten Aktins binden und damit aus dem Polymerisationsgleichgewicht entziehen. Im Komplex wird die Bindung von Monomeren an das Plus Ende des Filaments unterstützt (Profilin bindet an das Plus Ende des Monomers, das freie Minus Ende kann also an das Plus Ende von F-Aktin binden). Nach der Assoziation von F-Aktin und dem ATP-G-Aktin-Profilin Komplex dissoziiert Profilin wieder ab. Außerdem geht Profilin eine Wechselwirkung mit Membran-Bestandteilen ein, die an Signalübertragung zwischen Zellen beteiligt sind. Es bindet an Prolin-reiche Sequenzen, die häufig in Membran-Proteinen vorkommen. Somit könnte es eine Rolle bei dem Aufbau der Aktin-Filamente an der Plasmamembran spielen. Die Profilin-Konzentration bei sich bewegenden Zellen ist in der Nähe

31 der Plasmamembran die in Bewegungsrichtung zeigt sehr groß, wodurch die Polymerisation von Aktin eingeleitet und somit die Bewegung erzeugt wird. Profilin wirkt außerdem als Nukleotid-Austauschfaktor, wodurch es ebenso den Aufbau von Aktin- Filamenten fördert. Bei der Bindung zwischen G-Aktin und anderen Proteinen wird die ATP/ADP Bindetasche blockiert, sodass ein Austausch verhindert wird. Profilin bindet aber an der Seite, die der ATP/ADP Bindetasche gegenüber liegt, weshalb ein Austausch möglich ist. So werden die freigesetzten ADP-G-Aktin Moleküle wieder in ATP-G-Aktin umgewandelt und der ATP-G-Aktin Pool wieder aufgefüllt. Profilin konkurriert mit Thymosin um die Bindung an G-Aktin. Während Profilin die Filamentbildung stimuliert, inhibiert Thymosin die Polymerisation. Eine zweite Gruppe von Aktin-bindenden Proteinen, die Fragmentierungsproteine regulieren die Länge von Aktin-Filamenten, indem sie sie in kleinere Stücke zerteilen. Nach der Bindung eines Fragmentierungsproteins an eine Untereinheit im Aktin-Filament wird deren Konformation so verändert, dass die Bindung zwischen zwei Untereinheiten gelockert (extreme Verdrillung der Monomere gegeneinander) und schließlich gelöst wird. Nachdem ein Fragmentierungsprotein ein Filament an einer Stelle zerbrochen hat, bleibt es an das Plus Ende von einem der neu entstandenen Fragmente gebunden und verhindert dort die Anlagerung neuer Aktin-Monomere. Diesen Vorgang bezeichnet man als Capping. Die Minus Enden bleiben frei und können rasch weiter verkürzt werden. Der Abbau erfolgt damit über die Zerstörung des Aktin-Netzwerkes und der Bildung neuer Minus Enden. Dieser Abbau ist für Zellbewegung und Zytokinese von entscheidender Bedeutung.

32 Die Aktivitäten von Capping- und Fragmentierungs-Proteinen werden über mehrere Signalübertragungs-Mechanismen reguliert: Die Bindung der Fragmentierungsproteine Cofilin (Cofiline sind eine Gruppe von Fragmentierunsproteinen, zu denen Cofilin, Depaktin und ADF gehören) und Gelsolin an Aktin-Filamente (und somit die Schneideaktivität) wird durch Bindung an PIP 2 gehemmt. Nach der Hydrolyse von PIP 2 werden die Proteine wieder aus dem Komplex freigesetzt, wodurch der schnelle Abbau der Filamente eingeleitet wird. Die Aktivität von Cofilin kann durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung gesteuert werden. Gelsolin wird durch einen Anstieg der Zytosolischen Ca 2+ Konzentration auf über 10-6 M aktiviert. Aktin-Filamente werden durch andere Capping-Proteine stabilisiert. Diese binden ebenso an die Enden von Aktin-Filamenten. CapZ bindet unabhängig von der Ca 2+ Konzentration an das Plus Ende und verhindert, dass Monomere abdissoziieren oder binden. CapZ wird durch PIP 2 inhibiert. Tropomodulin blockiert die Minus Enden. In Gegenwart von Tropomyosin ist seine Aktivität erhöht (nur im Muskel). Durch Capping am Plus und Minus Ende wird ein Aktin-Filament effektiv vor Auf und Abbau geschützt. Dies ist wichtig bei stabilisierenden Aktin-Filamenten, die nicht verändert werden dürfen, wie im Muskel-Sarkomer oder an der Erythrozyten-Membran. Struktur des Zytoskeletts Funktion Aktin-bindender Proteine in Bezug auf Zytoskelett-Anordnung Anordnung des Zytoskeletts in Bündeln und Netzwerken Im Bereich von Membran-Ausstülpungen am Rand der Zelle sind die einzelnen Filamente zu Bündeln zusammengefasst. Die Filamente strahlen in das Zellinnere aus, wo sie sich auffächern und ein Teil des Filament-Netzwerkes werden. Bündel (Filamente in paralleler Anordnung dicht gepackt) und Netzwerke (annähernd rechtwinklige Überkreuzung einzelner locker gepackter Filamente) sind die häufigsten Strukturen von Aktin-Filamenten und erfüllen die gleiche Funktion: die Plasmamembran zu versteifen und somit die Zellgestalt festzulegen. Man unterscheidet zwei Typen von Netzwerken: das zweidimensionale, direkt unter der Plasmamembran liegende und das dreidimensionale, im Zellinneren liegende, welches dem Zytosol seine Gel-artige Konsistenz verleiht. Aktin-quervernetzende Proteine In allen Fällen werden die einzelnen Filamente von Aktin-quervernetzenden Proteinen zusammengehalten. Die Länge und Flexibilität der Proteine mit je zwei Aktin-Bindestellen sind ausschlaggebend für die gebildete Struktur (kurz, starr Bündel; lang, flexibel Netzwerke). Man unterteilt diese Proteine in drei Gruppen.

33 Die Proteine der Gruppe I besitzen jeweils verschiedene Aktin-bindende Domänen Die Proteine der Gruppe II weisen eine charakteristische Bindungsdomäne mit 7kDa auf. Die meisten Aktin-quervernetzenden Proteine gehören zur Gruppe III bzw. der Superfamilie mit der Calponin-Homologie-Domäne (CH-Domäne). Alle Proteine dieser Gruppe besitzen ein Paar Aktin-bindende Domänen (zu je 24kDa) mit Sequenzen homolog zu dem Muskelprotein Calponin. Die beiden Aktin-bindenden Domänen sind durch wiederholte Superhelix- oder β-faltblattstrukturen getrennt (wie in Immunglobulinen). Fimbrin und α-aktinin (2 CH-Domänen am N-Terminus) sind kürzere Vertreter der Gruppe III und kommen in Aktin-Bündel innerhalb von Zell-Ausstülpungen vor. Die längeren Proteine Filamin, Spektrin und Dystrophin kommen in Aktin-Netzwerken in Bereichen nahe der Plasmamembran vor. Verknüpfung zwischen Aktin und Plasmamembran Die jeweilige Gestalt einer Zelle ist nicht nur von den Aktin-Filamenten, sondern auch von den Proteinen, welche diese an die Membran binden, abhängig. Diese Proteine werden als Membran- Mikrofilament-verbindende Proteine bezeichnet. Ein Membran-Abschnitt, der eng an ein Filament- Bündel geheftet ist, nimmt eine fingerförmige Gestalt an. Ein Membran-Abschnitt, der an ein Netzwerk geheftet ist, bleibt flach. Es gibt zwei Möglichkeiten: entweder sind die Aktin-Filamente direkt an integrale Membran-Proteine verknüpft, oder sie werden indirekt über periphere Membran- Proteine an integrale Membran-Proteine geheftet (Die Proteine Interaptin und Comitin sorgen für einer Verbiundung von Aktinfilamenten mit zellulären Membranen). Die höchste Dichte an Aktin-Filamenten innerhalb der Zelle liegt im Cortex (schmale Region unterhalb der Plasmamembran). Das dort befindliche enge Netzwerk hält die meisten Organellen aus dem kortikalen Zytoplasma fern. Das kortikale Aktin-Zytoskelett unterschiedlicher Zellarten ist auf unterschiedliche Weise strukturiert. Die einfachste Anordnung ist das kortikale zweidimensionale Aktin-Netzwerk im Erythrozyten. In komplizierteren Strukturen (z.b. Thrombozyten, Epithelzellen, Muskelzellen) sind die Aktin-Filamente gleichzeitig Teil des dreidimensionalen Netzwerks, welches das Zytosol ausfüllt und die Zelle mit dem Substrat verbindet. Neben den Proteinen mit CH-Domäne verknüpfen auch die Proteine der ERM Familie (benannt nach den Anfangsbuchstaben der Mitglieder Ezrin, Radixin und Moesin) verschiedene Proteine in der apikalen Membran mit Mikrofilamenten. Das Zytoskelett der Erythrozyten

34 Erythrozyten müssen Kapillaren passieren, ohne dass ihre Membran verletzt wird. Die Festigkeit und Elastizität ihrer Plasmamembran beruht auf einem dichten Aktin-Netzwerk, das an der gesamten Innenseite der Membran anliegt und an vielen Stellen angeheftet ist. Das Zytoskelett der Erythrozyten besteht hauptsächlich aus dem langen faserförmigen Protein Spektrin. Spektrin besteht aus zwei dimeren Untereinheiten zu je einer α- und einer β-polypeptidkette. Durch Kopf an Kopf Zusammenlagerung der Polypeptidketten entstehen die 200 nm langen Spektrin-Tetramere. Das gesamte Zytoskelett ist ein aus Speichen und Naben zusammengesetztes Netzwerk. Ein Spektrin-Tetramer bildet eine Speiche und vernetzt ein Paar von Naben, die als Verbindungskomplexe ("junctional complexes") bezeichnet werden. Jede Nabe besteht aus einem kurzen Aktin-Filament von nur 14 Untereinheiten, an das die Proteine Adducin, Tropomyosin und Tropomodulin gebunden sind. Die beiden letzteren Proteine stabilisieren Aktin durch verhindern einer Depolymerisation. An ein Aktin-Filament können mehrere Spektrine binden (es kommt zur Speichen-Naben Struktur des Netzwerkes). Damit der Erythrozyt seine Form behält, ist das Spektrin-Aktin Zytoskelett über zwei periphere Membran-Proteine fest mit der darüber liegenden Membran verbunden. Ankyrin verbindet die Mitte eines Spektrin-Moleküls mit dem als Anionen-Transporter fungierenden dimeren Bande-3- Protein (integrales Membran-Protein). Das Bande-4.1-Protein ist ein weiterer Bestandteil des Verbindungskomplexes und bindet an Glykophorin (integrales Membran-Protein). Die zweifache Verankerung stellt sicher, dass sowohl Speichen, als auch Naben, fest mit der Plasmamembran gekoppelt sind. Dieses kortikale Aktin-Spektrin Zytoskelett ist wahrscheinlich auch in anderen Zellen vorhanden. Es wurde an Membranen verschiedener Zellen Isoformen von Spektrin und Ankyrin nachgewiesen. Das Zytoskelett der Thrombozyten In anderen Zellen sind die Aktin-Filamente auf kompliziertere Weise angeordnet als im Erythrozyten. Ein Beispiel ist das kortikale Zytoskelett der Thrombozyten (kleine, kernlose Zellen; verantwortlich für Blutgerinnung und Wundverschluss). Das Zytoskelett von Thrombozyten muss komplizierte Neuordnungen eingehen können, welche Gestaltveränderung während der Blutgerinnung bewirken. Daher sind zusätzliche Komponenten erforderlich. Das Zytoskelett eines nicht aktivierten Thrombozyten besteht aus drei Komponenten: einem äußeren Ring von Mikrotubuli (marginales Band), dem kortikalen Aktin-Netzwerk (ähnlich dem der Erythrozyten) und dem Zytosolischen Aktin-Netzwerk. Das kortikale Aktin-Netzwerk besteht aus Aktin-Filamenten, die durch eine nicht-erythrozytäre Isoform von Spektrin zu einem zweidimensionalen Netz verknüpft und durch Ankyrin an das integrale Membran-Protein Na + /K + - ATPase gebunden sind.

35 In den Thrombozyten ist ein weiteres Aktin-Netzwerk vorhanden, das nicht in den Erythrozyten zu finden ist. Es ist über Filamin-Brücken zu einem dreidimensionalen Gel verknüpft. Dieses Gel füllt das Zytosol aus. Es ist über Filamin mit dem Glykoprotein 1b-IX in der Membran verbunden. Filamin ist ein Aktin-quervernetzendes Protein mit CH-Domäne, kann aber auch Aktin mit der Plasmamembran verbinden. Um eine Wunde verschließen zu können, müssen die Thrombozyten Gestaltveränderungen des Zytoskeletts auf das sie umgebende Blutgerinnsel übertragen können. Dies wird dadurch erreicht, dass das Zytoskelett von innen an dieselben Membran-Proteine gebunden ist wie das Blutgerinnsel von außen. Gp1b-IX ist also Bindungspartner von Filamin und der Membran-Rezeptor für die Blutgerinnungsproteine Thrombin und den von-willebrandt Faktor. Das Zusammenziehen der Zellen verfestigt das Gerinnsel, wodurch die Wunde verschlossen wird. Identische Mechanismen gibt es auch in anderen Zellen. Aktin-Bündel stabilisieren Mikrovilli und Filopodien Mikrovilli und Filopodien sind fingerförmige Fortsätze, die auf der Innenseite durch ein mit der Phospholipid-Membran verbundenem Aktin-Fasernbündel versteift werden. Durch quervernetzende Proteine sind die Bündel starr genug, um die Membran-Fortsätze in ihrer langen, schmalen Gestalt zu halten. Mikrovilli sind 0,5-10 μm lang und befinden sich an der zur flüssigen Umgebung gerichteten Seite der Plasmamembran. Sie kommen u.a. in Nierentubuliepithelzellen und Darmlumenepithelzellen vor und vergrößern dort die Membran-Oberfläche um effizienter Nahrung transportieren zu können. Die Verknüpfung zwischen Mikrovilli-Membran und Aktin-Faser wird durch Myosin I vermittelt. Filopodien dienen der Anheftung an festen Oberflächen. Sie können am Rand sich bewegender oder sich ausbreitender Zellen beobachtet werden und existieren nur vorübergehend, bis ein erster Kontakt zum Substrat hergestellt ist. Das Motorprotein Myosin Die Polymerisationsfähigkeit von Aktin kann für bestimmte Bewegungsformen genutzt werden. Viele Arten der zellulären Bewegung erfordern jedoch ein Wechselspiel zwischen Aktin und seinem Motorprotein Myosin. Es handelt sich um eine ATPase, die aus der Hydrolyse von ATP Konformations-Änderungen erfährt, die eine gerichtete Bewegung entlang der Mikrofilamente

36 ermöglicht. Allen Motorproteinen ist gemein, dass sie chemische Energie in mechanische Energie umwandeln können. Struktur und Einteilung der Myosine Bisher wurden 13 Mitglieder der Myosin-Familie entdeckt. In nahezu allen eukaryotischen Zellen findet man Myosin I und Myosin II. Myosin V ist weniger weit verbreitet. Alle Myosine unterscheiden sich in ihrer spezifischen Funktion. Myosin II liefert die Kraft für Muskelkontraktion und Zytokinese. Myosin I und Myosin V sind an der Wechselwirkung zwischen Zytoskelett und Zellmembran beteiligt (Bsp. Transport von Membranvesikel). Myosine bestehen aus einer oder zwei schweren und mehreren leichten Ketten. Die schweren Ketten sind jeweils in drei strukturell und funktionell verschiedene Domänen gegliedert. Die globuläre Kopfdomäne (Nterminale Hälfte) enthält die Bindestelle für Aktin und ATP (am höchsten konservierte Domäne, erzeugt Kraft Bewegung). Neben der Kopfdomäne liegt die α-helikale Halsregion, welche die Bindestelle für die leichten Ketten (stabilisieren Halsregion, indem sie umklammert wird) enthält. Diese regulieren die Aktivität der Kopfregion. Die Schwanzdomäne (C-terminale Hälfte) enthält weitere Bindestellen, welche die Funktion des jeweiligen Myosin- Typs bestimmen (variable Domänen, weniger konserviert). Myosin II und Myosin V sind Dimere, deren α-helikale Schwanzdomänen eine Superspirale ausbilden. In der schweren Kette von Myosin I fehlt dieses Strukturmotiv, weshalb es als Monomer vorliegt. Die Anzahl und Art der leichten Ketten, die an der Halsregion binden, sind je nach Myosin-Subtyp verschieden. Bei Myosin I und Myosin V handelt es sich um Calmodulin (Ca 2+ -bindende regulatorische Untereinheit), das bei vielen intrazellulären Enzymen vorkommt. Myosin II enthält zwei verschiedene leichte Ketten: eine essentielle und eine regulatorische. Beide binden Ca 2+, haben aber andere Ca 2+ -Binde-Eigenschaften als Calmodulin. Calcium reguliert also die Aktivität der Myosine, wobei die unterschiedlichen leichten Ketten dafür sorgen, dass die unterschiedlichen Myosine anders auf Ca 2+ -Signale reagieren.

37 Die ATPase-Aktivität der schweren Kette des Myosin-Moleküls ist in Abwesenheit von Aktin erheblich reduziert. Im Komplex mit Aktin ist die Hydrolyse-Aktivität fünf mal schneller. Die Bindung der Kopfdomäne an Aktin ist also Voraussetzung für eine maximale ATPase Aktivität. Die spezielle Funktion des jeweiligen Subtyps wird durch die Schwanzdomäne festgelegt. Myosin I und Myosin V haben Aufgaben, an denen Membranen beteiligt sind, weil sich ihre Schwanzdomänen an die Plasmamembran oder an die Membran intrazellulärer Organellen binden. Es wird eine Verbindung zwischen Plasmamembran und Mikrofilamente ermöglicht (wie in Filopodien oder Mikrovilli). Myosin V ist über die Schwanzdomäne an Melanophilin verknüpft, das wiederum an Rab27a gebunden ist. Rab27a ist mit einer seiner Domänen innerhalb der Vesikel- Membran eingebettet. Die superspiralisierten Schwanzdomänen der Myosin II Moleküle lagern sich zu dicken Filamenten (325nm breit) zusammen, von denen die Kopfgruppen abstehen und die Teil des kontraktilen Apparats der Muskeln sind. Die Kopfgruppen liegen an den Enden des Filaments und werden durch die zentrale Zone (160nm breit) voneinander getrennt, in der ausschließlich Schwanzdomänen zu finden sind (Bipolarität der quergestreiften Muskulatur). Wanderung der Myosin-Kopfgruppen entlang des Aktin-Filaments Der Gleitfilamenttest ermöglicht die Beobachtung der Bewegung von Fluoreszenz-markierten Aktin- Filamenten entlang einer Lage von Myosin-Molekülen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Dabei wurden folgende Kenntnisse gewonnen: Der Myosin-Kopf wandert entlang von Aktin zum Plus Ende. Myosin I (Transportvorgänge im Zytosol) wandert mit 0,04 μm/s langsamer als Myosin II (Muskulatur) mit 4,5 μm/s. Die Kopfdomäne von Myosin ist notwendig und ausreichend für die Erzeugung von Bewegung. Myosin II bewegt sich in Schritten von ca. 5 bis 10 nm Länge, wobei eine Kraft von 1 bis 5 pn entsteht (vergleichbar mit der Schwerkraft, die auf ein Bakterium wirkt). Der Myosin-Kopf besitzt eine große spaltenförmige Vertiefung auf seiner Oberfläche, die von der Aktin-Bindestelle an der Spitze bis zur ATP-Bindestelle auf der gegenüberliegenden Seite reicht. Die Spalte ermöglicht durch Öffnen und Schließen große Konformations-Änderungen des Kopfes. Durch Schwenken des Halses wird die Bewegung ermöglicht. Myosin und Kinesin weisen eine Ras-Falte auf, die ein Nukleotid-Molekül über Schleifenförmige Strukturen binden. Das GTP-bindende Protein Ras und diese Motorproteine könnten in der Evolution aus demselben Vorläuferprotein entstanden sein. Mechanismus der Wanderung Zu Beginn des Zyklus ist Myosin an Aktin gebunden, freie ATP-Bindestelle. (1) Nukleotid-Bindung: Kopfgruppe dissoziiert vom Filament. (2) Hydrolyse: Kopfgruppe klappt nach vorne und bindet an eine andere Aktin-Untereinheit (zwei Stellen weiter). (3) Freisetzung von Orthophosphat: Kopfgruppe klappt

38 zurück, wodurch das Aktin-Filament bei Myosin- Molekülen mit nach hinten geschoben wird (4) Freisetzung von ADP, Zustand 1. Die Hydrolyse von einem ATP Molekül reicht exakt für einen Schritt des Myosin-Moleküls. In jedem Zyklus durchläuft Myosin 3 Konformations-Zustände. Die Spalte überträgt Konformations-Änderungen von der Nukleotid-Bindetasche zur Aktin-Bindestelle: Durch binden von ATP an die ATP-Bindetasche öffnet sich der Spalt, wodurch die Bindung zum Aktin am gegenüberliegenden Ende des Spalts gelöst wird. Nach ATP-Hydrolyse schließt sich der Spalt wieder teilweise, wodurch die Hydrolyse-Produkte nicht frei gesetzt werden können. Stattdessen wird erneut die Aktin- Bindestelle aktiviert, wobei sich der Myosin-Kopf dreht, um letztlich den Antriebsstoß ausführen zu können. Die resultierende Bewegung hängt davon ab, ob Aktin oder Myosin beweglich ist: in einem bipolaren dicken Filament sind die Myosin-II Moleküle fest an das Rückgrat des dicken Filaments gebunden, wobei die Köpfe in den beiden Enden des dicken Filaments gegensätzliche Polarität aufweisen. Deshalb schieben sich die Aktin-Filamente in der Mitte des ruhenden Myosin-Filaments zusammen. Ein einzelnes Myosin-I Molekül, das an ein Membran-umhülltes Vesikel gebunden ist, bewegt sich entlang des Aktin-Filaments, das durch das komplexe Zytoskelett verankert ist. Muskeln und kontraktile Strukturen Aktin und Myosin bilden im Muskel eine hochgradig organisierte Struktur: Actomyosin. Vertebraten besitzen drei Arten von Muskeln: Skelettmuskulatur (=quergestreifte Muskulatur), glatte Muskulatur und Herzmuskulatur. Skelettmuskeln verbinden die Knochen der Arme, Beine und Wirbelsäule und führen komplexe, koordinierte, rasche Bewegungen aus. Bewegung des Kopfes, Laufen: Isotone Kontraktion; der Muskel verkürzt sich, während er eine Kraft erzeugt. Festhalten von Gegenständen, Muskelanspannung: isometrische Kontraktion; bestimmte Paare von Muskeln üben entgegengesetzte Kräfte aus und verhindern die Kontraktion ihres jeweiligen Partners. Die Länge der Muskeln bleibt konstant, die Spannung erhöht sich. Glatte Muskeln umgeben die inneren Organe (Darm, große Blutgefäße etc.). Ihre Kontraktion bzw. Relaxation steuert den Durchmesser der Blutgefäße und befördert Nahrung durch den Darm. Ihre Kontraktion erfolgt langsam, Spannungen können aber länger aufrecht erhalten werden. Struktur der quergestreiften Muskulatur Skelettmuskeln bestehen aus einem Bündel von Muskelzellen (= Muskelfaser). Eine Muskelfaser enthält viele Filament-Bündel (=Myofibrille), die sich der Länge nach durch die gesamte Zelle

39 erstrecken. Eine Myofibrille gliedert sich in abwechselnd hellere und dunklere Banden. Der Abschnitt zwischen zwei Z Scheiben wird als Sarkomer bezeichnet. Die dunklen A-Banden (Bereich der Myosin- Filamente) sind von einer M-Linie durchzogen, während die hellen I-Banden (Bereich der Aktin- Filamente) durch die Z-Scheibe unterbrochen sind. Eine Myofibrille ist also eine Kette aus Sarkomeren (funktionelle und strukturelle Grundeinheit des Muskels). Im kontrahierten Muskel verkürzt sich das Sarkomer von 2 μm länge auf 70% dieser Länge. Jedes Sarkomer besteht aus dicken Filamenten (Myosin II) und dünnen Filamenten (Aktin). In der AI-Zone, überlappen sich beide Filamente. Die dicken Filamente (A-Bande) sind bipolar, weil die Myosin-Moleküle darin mit ihren Kopfgruppen in Richtung der Filament-Enden und mit ihren Schwanzdomänen im Zentrum angeordnet sind. Die dünnen Filamente (I-Bande) haben jeweils die gleiche Länge. Sie bestehen aus Aktin, Tropomyosin und Troponin. Die letzteren beiden Moleküle regulieren die Wechselwirkung zwischen Aktin und Myosin. Das Plus Ende der dünnen Filamente liegt immer an der Z-Scheibe. Die Kopfgruppen der Myosin- Moleküle stehen in der AI Zone von den dicken Filamenten ab und bilden Brücken zu den benachbarten dünnen Aktin-Filamenten. Die Enden der dünnen Filamente sind von den Capping- Proteinen CapZ (Plus-Ende) und Tropomodulin (Minus-Ende) besetzt, wodurch eine Depolymerisation an beiden Enden verhindert wird. Die Z-Scheibe besteht aus einem Gitter von Fasern, welche die Plus-Enden der Aktin-Filamente verankern. An dieser Verankerung sind CapZ und α-aktinin beteiligt. Kontraktion nach dem Gleitfasermodell: Innerhalb der AI Zone führen Konformations-Änderungen in den Brücken zur Bewegung der Myosin-Köpfe entlang der Aktin-Filamente. Am Ende eines Zyklus befinden sich alle Myosin-Köpfe 2 Aktin-Untereinheiten näher an der Z-Scheibe. Dadurch wurden die

40 dünnen Filamente näher zueinander gezogen. Dies kann solange fortgesetzt werden, bis die Myosin- Filamente die Z-Scheibe erreichen oder bis die Aktin-Filamente kollidieren. Drei Proteine geben der Myofibrille ihren Halt: Synemin umhüllt die Z-Scheibe Skelemin umhüllt die M-Linie. Das Protein Desmin (zu den Intermediärfilamenten gehörend) verläuft parallel zur Myofibrille und stabilisiert sie an den Rändern. (siehe IF) Die Proteine Titin und Nebulin Ein ruhender Muskel kann sogar soweit gedehnt werden, bis sich dicke und dünne Filamente nicht mehr überlappen. Nach der Dehnung sorgt eine passive Spannung dafür, dass der Muskel wieder seine ursprüngliche Struktur einnimmt. Diese Elastizität sowie die feste 3D Anordnung des Muskels wird durch ein drittes Filament-System ermöglicht. Das lange Faserprotein Titin verbindet die Enden der Myosin-Filamente mit den Z-Scheiben und zieht sich bis zur M-Linie durch. Titin ist ein sehr großes Protein (>25000AS) von etwa 1 μm Länge (halbe Länge eines Sarkomers). Die Anordnung der dünnen Filamente wird durch Nebulin aufrecht erhalten. Es bildet lange, unelastische Fasern aus Akctin-bindenden Domänen, die entlang der dünnen Filamente in Richtung Z-Scheiben verlaufen. Mit dem Fragmentierungsprotein Gelsolin lassen sich die Aktin-Filamente zerlegen und aus dem Sarkomer entfernen: es bleiben nur die kondensierten Nebulin-Moleküle an den Z-Scheiben zurück. Auslösung der Kontraktion durch Calcium Eine besondere Calcium-ATPase pumpt Calcium Ionen aus dem Zytosol ins Sarkoplasmatische Retikulum (SR), wodurch ein Calcium-Reservoir im SR angelegt und der zytosolische Calcium-Spiegel niedrig gehalten wird. Die Muskelzelle ist in der Lage ein ankommendes elektrisches Signal (Depolarisation) sofort in ein chemisches Signal (Calcium-Freisetzung) umzuwandeln. Dadurch wird die Muskelkontraktion eingeleitet. An der schnellen Signalumwandlung sind lange, faserförmige Einstülpungen der Plasmamembran beteiligt (transversale oder T-Tubuli). Sie enden in unmittelbarer Nähe des SR (Triade), wo das öffnen der Calcium-Kanäle durch Depolarisation induziert wird. In der glatten Muskulatur ist das SR weniger hoch entwickelt, weshalb die Erhöhung des Zytosolischen Calcium-Spiegels über einen Calcium-Kanal in der Plasmamembran bewerkstelligt wird. Die Erhöhung des Calcium-Spiegels findet erheblich langsamer statt, weshalb der glatte Muskel auf ein Depolarisationssignal mit einer langsam aufbauenden kontraktilen Spannung reagiert. Regulation der Kontraktion durch Tropomyosin Das Calcium-Signal wird von Aktin-bindenden Proteinen weiter vermittelt. Die Kontraktion im Skelettmuskel wird über 4 Aktin-bindende Proteine reguliert: Tropomyosin und Troponin C, I und T. Die Calcium-Konzentration hat einen Einfluss auf die Positionen der Proteine an den dünnen Filamenten, wodurch die Aktin-Myosin-WW reguliert wird. Tropomyosin (TM) ist ein seilartiges Molekül, dessen Untereinheiten sich so zusammenlagern, dass sie kontinuierliche Ketten bilden. Jedes Molekül besitzt sieben Aktin-Bindestellen, mit denen es sich an sieben Aktin-Untereinheiten bindet. Am Tropomyosin ist ein als Troponin (TN) bezeichneter

41 Komplex aus TN-T, TN-I und TN-C gebunden. Die AS-Sequenz von TN-C hat Ähnlichkeiten mit der von Calmodulin und wirkt als die Calcium-bindende Untereinheit des TN-Komplexes. TN reguliert die Lage von TM am Aktin-Filament. In Abwesenheit von Calcium (Aktin-TM-TN) kann Myosin zwar an Aktin binden. Die Gleitbewegung wird allerdings vom TM-TN Komplex blockiert. Sobald Calcium Ionen an TN-C binden (Aktin-TM-TN- Ca 2+ ), wird TM ein wenig zur Seite geschoben, wodurch die Myosin-Bindestelle am Aktin freigelegt wird. Regulation der Kontraktion in der glatten Muskulatur Hier ist nur TM, aber kein TN vorhanden. Es gibt mehrere Regulationsmechanismen. Ein Mechanismus entspricht dem TM-TN System der quergestreiften Muskulatur, verwendet aber das Protein Caldesmon. Es bindet bei niedriger Calcium-Konzentration an die Aktin-Filamente, wodurch eine Kontraktion unterbunden wird. Bei hoher Calcium-Konzentration geht es eine WW mit den Ca 2+ - CaM Komplex ein. Die Bindung von Caldesmon an Aktin wird durch Phosphorylierung mittels MAPK (Signalkaskade über PKC, Ras und heterotrimere G-Proteine) zudem inhibiert, wodurch eine länger andauernde Kontraktion ermöglicht wird. Zellbewegung Sich fortbewegende Keratinozyten und Fibroblasten zeigen die gleiche Abfolge morphologischer Veränderungen: (1) Verlängerung der Zellmembran: das Ausstrecken des Lamellipodiums geht mit einer regulierten Polymerisation von Aktin-Filamenten am Leitsaum, gefolgt von einer Quervernetzung dieser Filamente zu Bündeln und Netzwerken einher (2) Anheftung an das Substrat: Am Substrat angelangt, werden die Aktin-Bündel von innen an eine Anheftungsstelle befestigt, die sich dann zu einer Adhäsionsplaque entwickelt. (3) Vorwärtsfließen des Zytosols: Nun werden vermutlich Myosin-abhängig die im Zytoskelett eingebetteten Organellen mit nach vorne gezogen. (4) Nachziehen der restlichen Zelle: Aufgrund der Zelldynamik reißen die hinteren Adhäsionsplaque vom Substrat ab, wodurch Membranbestandteile am

42 Substrat hängen bleiben. Amöboide Bewegungen beginnen mit der Ausstülpung von Bläschen an der Plasmamembran, die sich zu Pseudopodien entwickeln und den Lamellipodien der Wirbeltierzelle entsprechen. Sobald sich das Pseudopodium an das Substrat anheftet, füllt es sich mit Zytoplasma, das von hinten nach vorne fließt, anschließend zieht sich der Zellkörper nach. Das Zytoplasma im Zellinneren (Endoplasma) ist eher eine Flüssigkeit, sodass es nach vorne fließen kann. Dort wird es wesentlich viskoser (Ektoplasma). Der Übergang in den Viskositäten wird über den Ab- und Aufbau von Mikrofilament- Netzwerken im Zytosol ermöglicht. Koordination der Zellbewegung durch "second- messenger" An einer frischen Wunde beginnen stationäre Fibroblasten zu wachsen und sich zu teilen. Sie bilden Filopodien und Lamellipodien und verschließen die Wunde, indem sie Stressfasern und Adhäsionsplaques aufbauen. Diese Prozesse erfordern Aktin-Polymerisation, den Zusammenschluss von Aktin-Bündeln und Netzwerken, sowie die Aktivierung von Myosin-Molekülen. Dies wird über Signalwege induziert, an denen drei Ras-Protein verwandte Proteine beteiligt sind: Rac, Rho und Cdc42. Eine Gruppe von Wachstumsfaktoren bewirkt die Aktivierung von Rac (SCAR/WAVEs), wodurch die Bildung von Lamellipodien induziert wird. Eine Gruppe von Wachstumsfaktoren bewirkt die Aktivierung von Cdc42 (WASPs), wodurch Cofilin aktiviert wird und Filopodien gebildet werden. Bei Bindung von Lysophosphatidsäure (LPA) an extrazelluläre Rezeptoren, wird Rho aktiviert, wodurch Myosin II die Bildung von Adhäsionsplaques und Stressfasern initiiert.

43 Die Adhäsion von Zellen an die extrazelluläre Matrix löst einen parallel verlaufenden Signalweg aus. Bei der Hydrolyse von PIP 2 durch Phospholipase C (PLC) werden die Proteine Profilin, Cofilin und Gelsolin von der Zellmembran abgespalten. Als Nebenprodukt entsteht IP 3, das die Calcium-Freisetzung aus dem ER stimuliert. Der Anstieg der Calcium-Konzentration im Zytosol aktiviert Myosin II und Gelsolin, wodurch die Fragmentierung der Aktin-Filamente stimuliert wird. Das Endoplasmatische Retikulum Allgemeine Funktionen Das ER ist in zwei Subkompartimente unterteilt: das raue und das glatte ER. Beide Typen beinhalten ein Membran-System, das ein vom Zytosol getrenntes Lumen einschließt. Fluoreszenz-markierte Proteine und Lipide sind fähig vom RER zum SER zu diffundieren, die zwei Typen sind also direkt miteinander verbunden. Die zwei ER-Typen teilen sich eine Menge derselben Proteine und Aktivitäten wie die Synthese von einigen Lipiden und Cholesterol. Einige Proteine sind zu bestimmten Zeiten allerdings nur in einem Typ zu finden, weshalb große funktionelle und strukturelle Unterschiede zwischen SER und RER existieren. Das raue ER hat auf seiner zytosolischen Oberfläche Ribosomen gebunden, das glatte ER nicht. RER ist typischerweise als ein Netzwerk aus abgeflachten Stapel (Zisternen) aufgebaut, die kontinuierlich in die Kernmembran übergehen. Die Membran-Elemente des SER sind typischerweise tubulär und bilden ein miteinander verknüpftes System aus Pipelines, die durch das gesamte Zytoplasma reichen. Unterschiedliche Zelltypen beinhalten unterschiedliche Verhältnisse von SER und RER, abhängig von den Aktivitäten der Zelle. Sekretorische Zellen haben große RER-Bereiche. Funktionen des glatten ER Das SER ist hochentwickelt in einigen Zelltypen, vor allem im Skelettmuskel, den Nierentubuli und den Steroid-produzierenden endokrinen Drüsen. Die Funktionen von SER sind: Synthese von Steroidhormonen in endokrinen Zellen der Gonaden und in der Nebennierenrinde. Entgiftung einer großen Menge organischer Verbindungen in der Leber. Darunter auch Barbiturate (Schlafmittel) und Ethanol, die zu einer Proliferation des SER innerhalb der Leberzellen führen. Die Entgiftung wird durch ein System von Oxygenasen, einschließlich der Cytochrom P450 Familie ermöglicht. Die Oxygenasen haben eine geringe Substratspezifität, um tausende verschiedene hydrophobe Substanzen in hydrophilere zu konvertieren. Die Effekte sind nicht immer positiv (gegrilltes Fleisch enthält relativ harmloses Benzo-α-pyrene, das durch Oxygenasen in eine karzinogene Verbindung überführt wird). Cytochrom P450

44 Moleküle metabolisieren einige Medikamente. Genetische Variationen in diesem Enzym bei verschiedenen Menschen korrelieren mit der Effektivität und den Nebenwirkungen der Arznei. Freisetzung von Glucose aus Glucose-6-phosphat in Leberzellen durch Glucose-6- phosphatase innerhalb der SER-Membran. Glykogen-Reserven sind in Form von Granula auf der Zytosolischen Seite der SER-Membran gelagert. Absondern von Calcium Ionen in das Zytoplasma von Skelett- und Herzmuskelzellen. Die regulierte Freisetzung von Calcium Ionen aus dem SER (im Falle von Muskelzellen: Sarkoplasmatisches Retikulum) leitet die Kontraktion ein. Funktionen des rauen ER Raues ER: Proteinsynthese an Membran-gebundenen und freien Ribosomen Polypeptide werden an zwei Orten innerhalb der Zelle synthetisiert: Sekretorische Proteine, integrale Membran-Proteine und lösliche Proteine, die in Kompartimenten des Endomembransystems lokalisiert sind, werden an Ribosomen an der Oberfläche der RER synthetisiert. Andere Polypeptide werden an freien Ribosomen synthetisiert. Solche werden nachträglich ins Zytosol entlassen. Hier handelt es sich um Proteine, die im Zytosol lokalisiert sind, um periphere Proteine der inneren Plasmamembran-Oberfläche (z.b. Spektrine, Ankyrine), um Proteine, die nach ihrer Synthese (posttranslational) in den Kern oder in Peroxisomen, Mitochondrien oder Chloroplasten transportiert werden. Der N-Terminus, welcher bei der Proteinsynthese als erster entsteht, enthält bei sekretorischen Proteinen eine Signal-Sequenz, die den Polypeptid-Ribosomen Komplex zur ER Membran dirigiert. Die Polypeptidkette wandert cotranslational durch einen Kanal in das ER-Lumen. Diese Signal- Hypothese wurde in den 70ern entwickelt (Nobelpreis). Synthese von sekretorischen Proteinen an RER Die Synthese des Polypeptids beginnt an einem freien Ribosom. Wenn die Signalsequenz aus 6-15 hydrophoben AS-Resten auftaucht, bindet SRP ("signal-recoginition particle"; besteht aus 6 Polypeptidketten und einer 7S RNA; es handelt sich um ein G-Protein) sowohl an das Ribosom, als auch an die Signalsequenz selbst. Durch SRP wird die weitere Translation gestoppt, bis die Membran des RER kontaktiert wurde. Das Translokon ist auf seiner luminalen Seite durch das Chaperon BiP abgedichtet. Die Bindung des Ribosoms wird durch das Translokon, die Bindung von SRP durch den in direkter Nähe lokalisierten SRP Rezeptor vermittelt. Nach der Bindung wird SRP durch seinen Rezeptor frei und diffundiert ins Zytosol, wodurch die Loop-konfigurierte Signal-Sequenz an eine innere Komponente des Translokons bindet, BiP ins Lumen weicht und die Öffnung des Translokons vergrößert wird. Der Rest der Polypeptidkette wird cotranslational durch das Translokon geführt, wobei die Signal- Sequenz noch innerhalb des Translokons gebunden bleibt und ein Chaperon das zurückrutschen des Polypeptid-Fadens verhindert. Nach dem Beenden der Translation, wird das Ribosom wieder ins Zytosol freigesetzt. Reguliert werden verschiedene Schritte in der Synthese und im Transport der sekretorischen Proteine durch GTP-Bindung und Hydrolyse. GTP-bindende Proteine (=G-Proteine) können in zwei

45 Konformationen vorliegen: eine enthält ein gebundenes GTP (Schalter an), die andere ein gebundenes GDP (Schalter aus). Beide Proteinkonformationen haben unterschiedliche Affinitäten zu anderen Proteinen. Aufgrund der unterschiedlichen Bindungseigenschaften fungieren G-Proteine als molekulare Schalter. SRP und SRP Rezeptor sind G-Proteine. Durch die Hydrolyse von GTP dissoziiert SRP ins Zytosol und gelangt die Signalsequenz ins Translokon. Nachdem die naszierende Polypeptidkette in das Lumen des ER transportiert wurde, wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase (Membran-Protein) abgespalten Prozessierung der Proteine im ER Eine Vielzahl von Enzymen innerhalb des ER-Lumens oder der ER-Membran sind in der Lage die naszierende Polypeptidkette zu modifizieren. Integrale Membran-Proteine, die in der Nähe des Translokons lokalisiert sind: Signalpeptidase: Signalsequenz wird abgespalten; Oligosaccharyltransferase: Kohlenhydrate werden angehängt. Das RER Lumen beinhaltet Chaperone wie Bip, Calnexin und Calretikulin sowie Protein- Prozessierungs-Enzyme wie Protein-disulfidisomerase (PDI); Disulfid-Brücken spielen eine wichtige Rolle, um die Stabilität von Proteinen an der extrazellulären Oberfläche der Membran bzw. im extrazellulären Raum zu erhalten. Synthese von integralen Membran-Proteinen an RER Diese Proteine werden genauso cotranslational durch die ER Membran translokiert wie die sekretorischen Proteine. Im Gegensatz zu löslichen Proteinen, besitzen integrale Membran-Proteine eine oder mehrere hydrophobe Transmembran-Domänen, welche die weitere Bewegung des Proteins in Richtung ER Lumen stoppen. Diese Transmembran-Domänen sind also zugleich Stopp- Transfer-Sequenzen bestehend aus mindestens 15 hydrophoben oder ungeladenen AS-Resten, welche die stabile Integration in die ER-Membran ermöglichen, wenn die Polypeptidkette aus dem Translokon freigelassen wird. Es wird angenommen, dass sich das Translokon an der Seite öffnet und die helikale Transmembran-Domäne lateral in die Lipid-Doppelschicht freigibt. Sobald die Stopp-Transfer-Sequenz an die Bindestelle innerhalb des Translokons gebunden ist, wird der C-terminale Teil im Zytosol translatiert, wobei das Ribosom nicht mehr an das Translokon gebunden ist. Es wird angenommen, dass ein "Gating"-Protein (evtl. BiP) während der Synthese des C-Terminus die luminale Seite des Translokons abdichtet. Somit gelangt der N-Terminus ins Lumen und der C-Terminus ins Zytosol. Membran-Proteine mit einer Transmembran-Domäne ("single-spanning") können auch die umgekehrte Orientierung aufweisen (N-Terminus im Zytosol und C-Terminus im Lumen). Determinierend für die Ausrichtung des Membran-Proteins ist die Anwesenheit von positiv geladenen AS-Resten, welche immer das zytosolische Ende der Transmembran-Domäne flankieren. Der innere Bereich des Translokons richtet dabei die Polypeptidkette so aus, dass die positiv geladenen Reste in der Nähe des Zytosols lokalisiert sind. Die nebeneinanderliegenden Transmembran-Domänen von "multi-spanning" Membran-Proteinen haben eine umgekehrte Orientierung. Hier muss jede andere Transmembran-Domäne um 180

46 rotieren, bevor sie das Translokon verlassen kann. Es wird angenommen, dass das Translokon die Ausrichtung der Polypeptidkette beeinflussen kann und somit mehr als ein einfaches Translokon darstellt. Glykosylierung im RER Fast alle Proteine, die am RER synthetisiert werden, sind Glykoproteine. KH-Gruppen stellen Bindestellen für die Wechselwirkung mit anderen Makromolekülen dar und helfen bei der Faltung des Proteins, an dem sie angehängt sind. Die Sequenz innerhalb der angehängten Oligosaccharide ist spezifisch und hoch konserviert. Die Addition von Monosacchariden aus einem Zucker-Donor (Nukleotid-Saccharide wie CMP- Sialinsäure, GDP-Mannose oder UDP-Acetylglucosamin) an eine wachsende Oligosaccharid-Kette an einem Zucker-Akzeptor wird durch Membran-gebundene Enzyme, den Glykosyltransferasen katalysiert. Die Zuckersequenz hängt von der Aktivitätsreihenfolge der einzelnen Glykosyltransferasen im Glykosylierungs-Prozess, also von der Lokalisation der spezifischen Enzyme im sekretorischen Pathway ab. Das Kernsegment jeder KH-Kette wird an einem Lipid-Carrier assembliert und anschließend an einen spezifischen Asparagin-Rest des Proteins transferiert (N-verknüpfte Oligosaccharide). Der Lipid- Carrier ist Dolichol-Phosphat und befindet sich innerhalb der ER Membran (Dolichol aus Zytosol + CTP Dolichol-P in Membran +CDP). Der Glykosylierungs- Prozess lässt sich wie folgt beschreiben, er ist hochkonserviert. Dolichol-P befindet sich auf der zytosolischen Seite; Übertragung von 2 NAG, 5 Mannose auf Dolichol-P; Dolichol-PP flippt mit dem Oligosaccharid-Gerüst auf die Lumenseite; Auf der zytosolischen Seite nehmen andere Moleküle Dolichol-P je ein Molekül Mannose bzw. Glucose auf und flippen ebenso auf die Lumenseite. Dolichol-P-Mannose und Dolichol- P-Glucose fungieren als Zucker-Donor für das Dolichol-PP mit dem Oligosaccharid-Gerüst, das somit weitere 4 Moleküle Mannose und 3 Moleküle Glucose aufnimmt. Es folgt die Übertragung der Oligosaccharid-Kette auf Asn der Sequenz Asn-X-Ser/Thr der naszierenden Polypeptidkette (Oligosaccharyl-Transferase), wonach Dolichol-PP wieder auf die zytosolische Seite flippt. Dort wird es zu Dolichol-P dephosphoryliert und steht für einen weiteren Zyklus zur Verfügung.

47 Die Dolicholphosphat-gebundenen Zucker stehen auch für andere Biosynthesen wie O-Glykosylierung und Glykosylphosphatidyinositol- Anker zur Verfügung. Die O-Glykosylierung beinhaltet den Transfer von nur kurzen Ketten an die Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin (im Fall von Kollagen an Hydroxylysin). Mutationen, die zu einem Fehlen der N-Glykosylierung führen, führen auch zum Tot der Embryos. Eine fehlerhafte N-Glykosylierung führt zu zahlreichen Erkrankungen (CDGs: congenital Diseases of Glycosylation). Beispiel: die Ursache für die Krankheit CDG1b ist eine Mutation in der Phosphomannose-Isomerase, welche aus Fructose-6-p Mannose-6-p synthetisiert und somit Mannose für die Glykosylierung zugänglich macht. Durch orale Einnahme von Mannose können die Symptome dieser Defizienz geheilt werden. Modifikationen des Kern-Oligosaccharids Zunächst werden zwei der drei terminalen Glukose-Reste entfernt (Glukosidase I). Jedes Protein, das nur ein Molekül Glucose enthält bindet nun an das Membran-gebundene Chaperon Calnexin, welches beim Faltprozess hilft. Das letzte Molekül Glucose wird nach einiger Zeit durch die Glukosidase II entfernt, wodurch das Glykoprotein die Affinität zu Calnexin verliert und freigesetzt wird. Neben Calnexin hat Calretikulin eine ähnliche Funktion. Es handelt sich bei beiden Proteinen um Lektin-ähnliche Chaperone, die mit neu synthetisierten Glykoproteinen interagieren, um die Qualitätskontrolle innerhalb des ERs zu regulieren. Sie haben eine ähnliche Spezifität, binden aber dennoch teilweise unterschiedliche Zielproteine. Nun folgt der Schlüsselschritt der Qualitätskontrolle im ER: wenn das Glykoprotein noch nicht fertig gefaltet oder falsch gefaltet ist, wird es von einem monitoring enzyme (GT-Enzym) erkannt, welches ein Molekül Glucose erneut an die Oligosaccharid-Sequenz dranhängt. Die Erkennung erfolgt aufgrund exponierter hydrophober Oberflächen, die bei korrekt gefalteten Proteinen im Zentrum liegen. Ist die Glukose wieder dran, so wird erneut Calnexin binden, das nun eine zweite Chance für den Faltprozess gibt. Wenn das Glykoprotein nach mehreren Durchgängen immer noch nicht korrekt gefaltet vorliegt, wird es durch ein Translokon ins Zytosol transportiert und im Proteaosom zerstört. Wenn das GT-Enzym die korrekte Faltung bestätigt, kann es das ER verlassen. Mechanismen zur Sicherstellung des Abbaus fehlgefalteter Proteine Fehlgefaltete Proteine, welche die Qualitätskontrolle im ER nicht bestehen, gelangen mittels reverser Translokation durch das gleiche Translokon ins Zytosol zurück, durch das sie ins ER gekommen sind. im Zytosol werden die Oligosaccharide entfernt und das Protein im Proteaosom degradiert. Unter manchen Umständen können sich ungefaltete Proteine im ER schneller anhäufen, als sie exportiert und degradiert werden können. Die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen ist für eine Zelle letal und löst eine UPR (unfolded protein response) aus. Das ER enthält Protein-Sensoren, welche die Konzentration von ungefalteten oder fehlgefalteten Proteinen im Lumen überwacht. Diese Sensoren werden durch Chaperone (BiP) inaktiv gehalten. Liegen eine große Zahl ungefaltete

48 Proteine vor, werden die Chaperone für den Faltprozess benötigt, wodurch die Protein-Sensoren nicht mehr inaktiv gehalten werden können. Die Sensoren lösen zahlreiche Signale aus, die ins Zytosol und in den Kern übertragen werden. Es wird die Expression verschiedener Gene eingeleitet: (1) ER-basierende Chaperone. (2) Proteine, welche ungefaltete Proteine aus dem ER transportieren. (3) Proteine, welche selektiv anormale Proteine degradieren. Außerdem wird der Translationsfaktor eif2α phosphoryliert, wodurch die Proteinsynthese inhibiert und der Fluss von Proteinen ins ER reduziert wird. Die UPR stellt außerdem sicher, dass sich im Falle einer nicht möglichen Wiederherstellung des stressfreien Milieus die Zelle selbst zerstört. Es werden dann Apoptose Pathways eingeleitet. Membran-Biosynthese im ER Im ER werden Proteine und Lipide synthetisiert, welche in die ER-Membran eingelagert werden. Von dort gelangen die Membran-Komponenten zu jedem weiteren Membran-Ort der Zelle. Während der Wanderung der Membran werden Proteine und Lipide von den spezifischen Organellen modifiziert, sodass die Membran eines jeden Organells eine einzigartige Zusammensetzung aufweist. Es gibt viele Faktoren, welche die Lipid-Zusammensetzung der Membranen verändern: Die meisten Membranen von Organellen enthalten Enzyme, welche einen Phospholipid-Typ in einen anderen Typ umwandeln. Bei der Bildung von Vesikel werden einige Phospholipid-Typen präferentiell eingebaut, während andere in der Organell-Membran zurück bleiben. Es gibt Zellen, welche Phospholipid-Transfer-Proteine enthalten, welche bestimmte Phospholipide durch das Zytosol von einer Membran zur anderen transportieren können (wichtig für Lipid-Transport zu Peroxisomen, Mitochondrien und Plastiden, die nicht Teil des normalen Membran-Flusses sind). Die Asymmetrie aller Membranen wird im ER etabliert, da hier Proteine und Lipide präferentiell in die eine oder andere Schicht eingelagert werden. Sie wird über den gesamten Weg der Vesikel aufrechterhalten, sodass die Kohlenhydratketten im ER ins Lumen und später in der Plasmamembran ins Exoplasma zeigen (ER-Lumen hat viele Gemeinsamkeiten mit Exoplasma: Calcium-Spiegel hoch, viele KH, oxidierendes Potential). Synthese von Membran-Lipiden Die meisten Membran-Lipide werden vollständig im ER synthetisiert (Ausnahmen: Sphingomyelin und Glykolipide werden im Golgi-Komplex fertig gestellt; seltene Lipide in den mitochondrialen und plastidären Membranen werden von Enzymen in diesen Organellen synthetisiert). Die Enzyme, welche Phospholipide synthetisieren befinden sich in der ER Membran (aktive Seite im Zytosol), wodurch Phospholipide in die äußere Membran eingelagert werden. Flippasen katalysieren den Transfer der Lipide in die innere Membran.

49 Protein-Translokation: Übersicht Es gibt insgesamt vier Translokations-Wege für Proteine in Prokaryoten und Eukaryoten. Sec-abhängiger Weg: transportiert ungefaltete Polypeptide mit der N-terminalen Signalsequenz posttranslational durch das Sec-Translokon. Tat-abhängiger Weg: transportiert gefaltete Polypeptide (Metalloproteine und Proteinkomplexe) durch das Tat-Translokon. SRP-abhängiger Weg: transportiert integrale Membranproteine cotranslational durch das Sec-Translokon. YidC-abhängiger Weg: transportiert integralte Membranproteine in die innere Membran. Tat-abhängiger Weg: e/vsc/de/ch/8/bc/transport/protein_bakt_tat.vscml.html Die Twin-Arginin-Translokationsmaschinerie (Tat) ist hauptsächlich für die Translokation gefalteter Proteine zuständig, die exportiert werden sollen und typischerweise Metallhaltige Cofaktoren enthalten. Außerdem spielt sie in der Biogenese einiger bakterieller Membranproteine eine Rolle. ER-Signal-Sequenzen Signalsequenzen sind hochvariabel und haben keine primären Strukturähnlichkeiten, was die spezifische Erkennung durch einen einzigen Rezeptor (SRP bzw. SecA) zu einer Besonderheit macht. Dennoch zeigen sie gemeinsame Eigenschaften. Eine Signalsequenz ist AS lang und kann immer in drei Domänen gegliedert werden. Geladener N-terminaler Bereich: N-Domäne (meist basisch = positiv). Hydrophober Kern: H-Domäne (ca. 10 AS lang; bis zu 15 AS, endet mit einem Turn-bildenden Rest). C-Domäne enthält die Peptidase- Cleavage site AXA (6-8 AS; weniger hydrophob, aber meist ungeladen). Die gemeinsamen Eigenschaften sind universal und charakterisieren Signalsequenzen von Prokaryoten, Hefen und Säugern gleichermaßen. Viele verschiedene Signalsequenzen innerhalb dieser Organismen werden entweder von SecA oder SRP erkannt.

50 Alle Signalpeptide, hauptsächlich ihre Kernregionen, haben die intrinsische Fähigkeit α-helices zu bilden, was in künstlicher Umgebung gezeigt wurde. Darüberhinaus zeigen Signalsequenzen die Fähigkeit in die Lipddoppelschicht zu insertieren, wobei ihre Targeting-Funktion bei Mutationen, welche diese Insertionsfähigkeit stören ebenso inhibiert ist. Für die Targeting- und Insertionsfähigkeit wird ein Signalpeptid mit einem Gemisch aus gleichen Mengen von Ala und Leu benötigt. Die optimale Länge für die Sekretion beträgt 10 AS. Zusätzlich zur Signalsequenz scheinen Einschränkungen für den N-terminalen Proteinbereich zu existieren, der direkt an die Signalsequenz anschließt. Insertionsfähigkeiten der Signalsequenzen werden nicht durch die anschließenden Proteinsequenzen gestört. Mutationen in der Proteinsequenz, die der Signalsequenz folgt, haben jedoch oft Auswirkungen auf das korrekte Targeting. Gegenüberstellung der Signalsequenz-Rezeptoren Naszierende Präproteine interagieren zuerst mit dem Trigger-Factor (weniger hydrophob), dann mit SRP (hydrophob) und zuletzt mit SecB, wenn mindestens 200 AS bereits synthetisiert wurden. SRP erkennt hydrophobere Sequenzen als SecA/B. Der SRP-Pathway wird cotranslational eingeleitet und ist für das Targeting von Membranproteinen verantwortlich. Der SecA/B Pathway wird posttranslational induziert und sorgt für das Targeting von sekretorischen Proteinen. Protein-Translokation ist in allen Reichen des Lebens konserviert

51 Cotranslationales Protein-Targeting Cotranslationales Trageting sekretorischer Proteine und Membranproteine zur Translokationsmaschinerie wird in allen drei Reichen des Lebens durch SRP und den SRP-Rezeptor vermittelt. Der erste Schritt im SRP-vermittelten Protein-Targeting ist die Erkennung der Signalsequenz am naszierenden Protein. Die spezifische Bindung von SRP an Signalsequenzen dient als kritischer Sortierungsschritt während der Proteinlokalisation innerhalb der Zelle. SRP ist in der Lage Signalsequenzen sowie hydrophobe TM-Domänen zu erkennen. Das GTP-abhängige Targeting und der Mechanismus, mit dem SRP die neu synthetisierten Proteine zu ihrer finalen Lokalisation dirigiert sind in allen Reichen des Lebens hochkonserviert und essentiell. SRP dient als strukturell flexibler Komplex, der durch die Interaktionen mit dem Komplex aus Ribosom und naszierender Kette (RNC), dem Translokon und dem SRP-Rezeptor reguliert und moduliert wird. Er fungiert als Adaptor zwischen Proteinsynthese- und Translokationsmaschinerie. Der SRP-Zyklus Ribosom-assoziiertes SRP erkennt und bindet Signalpeptide naszierender sekretorischer Membranproteine (in Eukaryoten) oder integraler Plasmamembranproteine (in Prokaryoten). Durch die Bindung dieser hydrophoben Bereiche wird die Elongation des Polypeptids durch das Ribosom blockiert (Elongation arest). Im zweiten Schritt wird die naszierende Kette dann durch SRP zum SRP- Rezeptor dirigiert, der innerhalb der ER- Membran (in Eukaryoten) oder innerhalb der Plasmamembran (in Prokaryoten) verankert ist (Membran-Targeting). SRP und SRP-Rezeptor weisen beide homologe GTP-Bindedomänen auf. Infolge der Interaktion zwischen SRP und SRP-Rezeptor wird das Translokon gebunden (Translokon- Docking) und anschließend die GTP Hydrolyse-Aktivitäten stimuliert und die naszierende Kette in den Translokationskanal transportiert. Nach Insertion des Polypeptids in das Translokon erfolgt die simultane GTP-Hydrolyse in SRP und SR, wodurch der Translationsarest aufgehoben wird und SRP im GDP-gebundenen Zustand aus dem Komplex freigesetzt wird. Die Translokation wird nun durch die fortschreitende Translation vermittelt. Ist die Polypeptidkette vollständig translokiert, so dissoziiert auch das Ribosom von dem Translokon ab. Anschließend wird das Signalpeptid abgespalten. BiP verschließt das Translokon von Innen, bis die Polyppeitdkette gebunden hat.

52 Diversität der SRP-Komplexe in verschiedenen Organismen Das eukaryotische SRP ist ein zytoplasmatisches Ribonukleinprotein, das aus sechs nach ihrem Molekulargewicht benannten Polypeptiden (SRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72) und einer 7SL RNA (300 bp) besteht. Gram-positive Bakterien und Archeen weisen SRP-Assemblierungen unterschiedlicher Komplexität auf. Die minimale funktionelle Einheit aus SRP, wie sie in Gramnegativen Bakterien gefunden wurde, besteht aus nur einem Protein (Ffh) und einer 4,5S RNA (115 bp). Archeen besitzen eine 7S RNA (310 bp) und die Proteine SRP19 und SRP54. SRP aus Chloroplasten dient sowohl dem cotranslationalen als auch dem posttranslationalen Proteintransport zur Thylakoid-Membran. Es besteht ausschließlich aus SRP54 und weist damit keine RNA-Komponente auf. SRP54 liegt im Komplex mit SRP43 vor, wenn es den posttranslationalen Transport von LHC-Proteinen vermittelt. SRP43 ist einzigartig für das plastidäre SRP.

53 Säuger-SRP Domänenarchitektur Basierend auf die Behandlung mit Nukleasen kann SRP in zwei verschiedene Domänen gegliedert werden: Die Alu und die S Domäne. Die Alu-Domäne besteht aus dem SRP9/14-Heterodimer, gebunden an die 5 und 3 Endpunkte der 7SL RNA. Sie ist verantwortlich für die Inhibition der Polypeptid-Elongation, indem sie an die Grenzfläche der ribosomalen Untereinheiten (genauer: elongation factor binding site) bindet. Der SRP9/14 Heterodimer bildet eine extendierte β-faltblatt Oberfläche, auf der die gefaltete 5 Domäne der 7SL RNA (einschließlich Helices 2-4) durch spezifische Interaktionen mit SRP14 fixiert wird. Der Alu-Domänen-Teil der RNA Helix 5 bindet SRP9, wodurch ein kompaktes Partikel entsteht. Die S-Domäne besteht aus dem zentralen Teil der RNA und den vier größeren Proteinen. Die S-Domäne der archealen und eukaryotischen SRP wird durch SRP19 zusammengehalten, das auch für die Assemblierung von SRP essentiell ist. SRP19 bindet die Spitze der aufgrund tertiärer RNA-RNA Interaktion aneinander ausgerichteten SRP RNA Helices 6 und 8. Bakterien codieren nicht für SRP19 und besitzen auch keine Helix 6 innerhalb der SRP-RNA. Der konservierte Ribonuleoprotein-Kern von SRP besteht aus SRP54, gebunden an Helix 8 der SRP-RNA. Er ist Teil der S-Domäne und verantwortlich für die Bindung des Signal-Peptids und der GTP-abhängigen Interaktion mit dem Rezeptor. Funktion und Struktur der konservierten Komponente Ffh Die Protein-Untereinheit aus SRP in E.coli, genannt Ffh, ist das prokatyotische Homolog zur 54 kda Untereinheit des eukaryotischen SRP (SRP54). Ffh sowie SRP54 ist die Untereinheit, welche für die Bindung der Signalsequenz verantwortlich und in allen SRPs hochkonserviert ist. Ffh besteht aus drei Domänen. Die N-terminale Domäne (N-Domäne) hat eine 4-Helix Bündel-Struktur, die für die Interaktion mit dem Ribosom verantwortlich ist. Die G-Domäne besteht aus einer konservierten Ras-ähnlichen GTPase-Domäne mit einer einzigartigen Insertion-Box Domäne (I-Box oder IBD). Die G-Domäne enthält die GTP-Bindestelle und ermöglicht die Interaktion mit der homologen Domäne des SRP- Rezeptors. Nicht wie bei anderen kleinen GTPasen, ist die SRP-GTPase in der Nukleotid-freien Form stabil. Ffh-Domänen N, G, M, RNA Die G-Domäne ist eng mit der N-Domäne assoziiert und bildet zusammen mit dem N-terminalen 4-Helix Bündel die strukturell stabile Einheit SRP54NG. Das 10-AS-Segement, welches die N- und G-Domäne verbindet ist Teil der G-Domäne, jedoch eng an die N-Domänenoberfläche gepackt, was die NG-Struktureinheit ausmacht. Die strukturellen Elemente an der NG Grenzfläche ermöglichen die dynamische Kommunikation zwischen diesen Domänen. Die C-terminale Domäne von Ffh hat einen hohen Methionin-Anteil (M-Domäne) und zeigt ausschließlich helikale Strukturen. Innerhalb der Met-reichen, hydrophoben Bindetasche, die von einem konservierten hydrophoben Loop (Finger-Loop) geschlossen wird, liegt vermutlich die

54 Polypeptid-Bindestelle ( Methionin-Bürste bindet Signalsequenz). Die M-Domäne ist von sich aus aufgrund des Finger-Loops flexibel, wobei die Bindung der 4,5S RNA die M-Domäne stabilisiert, was für die Funktion von SRP essentiell ist. Die M-Domäne enthält auch die RNA-Bindestelle, obwohl auch die N-Domäne bei der Bindung der RNA beteiligt sein könnte. Der konservierteste Teil der SRP RNA bildet einen symmetrischen Loop innerhalb der Helix 8, dessen einzigartige kleinere Tasche durch das Helix-Turn-Helix Motiv von SRP54M erkannt wird. Zusätzlich wird der nachfolgende interne asymmetrische Loop einer vorgewölbten Plattform aus SRP54M präsentiert. Funktion der SRP-RNA Die SRP RNA ist essentiell für den zentralen Schritt des Protein-Targetings, indem sie die Interaktion zwischen SRP und dem SRP-Rezeptor katalysiert. Die RNA beschleunigt die GTPase Aktivität des SRP-SRP-Rezeptor-Komplexes auf ähnliche Weise wie GTPase-aktivierende Proteine. Die RNA scheint zusätzlich in die Kommunikation zwischen den individuellen Domänen von Ffh und der Koordination verschiedener Schritte während der Targeting-Reaktion involviert zu sein. Bindung des Signalpeptids durch SRP Es wird vermutet, dass die M-Domäne auch in die Bindung der Signal-Sequenz beteiligt ist. Sie enthält eine hochkonservierte hydrophobe Bindetasche mit Met Seitenketten sowie einen Finger- Loop der als Deckel der Kavität dienen könnte. Andere Arbeiten zeigten jedoch, dass die NG- Domäne für eine effiziente Signal-Peptid-Bindung notwendig ist. So ist eine isolierte NG-Domäne in der Lage Signalpeptide zu binden. Methode: Welche Domäne ist in Bindung involviert? Signalpeptid N-terminal an Biotin koppeln. Crosslinken über in der Signalsequenz inserierten Verbindungen während der Interaktion, Trennung der M und NG Domänenen, Detektion des Peptids mittels Chemolumineszens (ECL). Es wurden zwei Crosslinking Methoden angwendet: - Crosslink über das Cystein in Signalsequenz durch PICUB, das nicht-modifizierte Proteine ohne Spacer-Arm verknüpft. Dadurch auch gutes Mapping der Bindestelle möglich. PICUP erzeugt bevorzugt Radikale von Tyr, His oder Met, die durch benachbarte Nukleophile (hier Cystein in Signalpeptid) angegriffen werden. - BPM-Crosslinking, indem Benzophenon in das Signalpeptid integriert wurde (über Modifikation von Cys mit 4- maleimido-benzophenone) wodurch 1,2 nm langer flexibler Linker zwischen Signal Peptid Rückgrat und photoaktivierbarer Gruppe entsteht. Durch Synthese kann Benzophenon direkt in die Signalsequenz integriert werden, wodurch der Linker nur 0,6 nm lang ist. Durch UV-Bestrahlung wird ein Benzophenon-Diradikal erzeugt, das in die Elektronen-reiche sigma-bindung inseriert, wodurch Crosslinking zwischen benachbarten C-H Bindungen möglich ist, die leicht H abspalten können (zb. Met, Leu, Val). PICUB-Crosslinking erzeugte NG-Signalpeptid Verknüpfungen, während nach BPM-Crosslinking mit einem längeren Spacer M-Signalpeptid Verknüpfungen resultierten. Die Plastizität der hydrophoben Tasche der M-Domäne ermöglicht die Bindung hydrophober Sequenzen, wobei die NG-Domäne spezifischer die Signalsequenz bindet. Beide Domänen scheinen daher eine Rolle in der Bindung zu spielen.

55 Ein Modell für den ersten Schritt innerhalb des SRP-Zyklus Die Bindung von SRP54 an das Ribosom erhöht die Affinität von SRP54 für GTP. Wenn das Signalpeptid und GTP an verschiedene Domänen von SRP54 gebunden haben, muss eine intramolekulare Kommunikation zwischen den Domänen existieren, die durch Interaktionen mit externen Bindepartnern (RNC, SR) induziert wird. Vor der Bindung an das Ribosom, liegt der SRP- Kern in einer kompakten Struktur vor. Die G-Domäne interagiert dabei mit der RNA Helix 8. In Abwesenheit eines Signalpeptids ist die Interaktion zwischen SRP54 und Ribosom nicht stark, weshalb SRP im Gleichgewicht zwischen Ribosom-gebundenem und freiem Zustand existiert (Scan-Modus). Wenn ein Signal-Peptid am Polypeptid- Ausgang des Ribosoms verfügbar ist, bindet SRP54 über seine M-Domäne und bildet damit einen stärkeren Kontakt mit dem Ribosom. Die Signalpeptid-Bindung induziert die Verschiebung des Finger-Loops und richtet den gesamten N-terminalen Teil der M-Domäne über vier konservierte Hinge-Motive neu aus. Diese erlauben die Rotation und/oder Translation der M-Domäne relativ zur NG- Domäne sowie der N-Domäne relativ zur G Domäne. Die erste Rotation zwischen M und G Domäne öffnet die Interaktionsfläche zwischen G-Domäne und RNA Helix 8. Die zweite Rotation (zwischen N und G Domäne) ist abhängig von der Nukleotid- Beladung und bewirkt die Kommunikation zwischen Signalpeptid-Bindestelle und GTP-Bindestelle. Durch diese strukturellen Änderungen wird SRP für die Interaktion mit dem SRP-Rezeptor vorbereitet. Der SRP-Rezeptor Der SRP-Rezeptor ist ein Membran-gebundener Rezeptor für Ribosomen, naszierende Polypeptidketten sowie den SRP Komplex.

56 In Eukaryoten besteht der SRP Rezeptor aus zwei GTPase-Untereinheiten, wobei SRα ein peripheres und SRβ ein integrales Membranprotein darstellt. In Bakterien und Archeen fungiert FtsY als monomerer SRP-Rezeptor (SRα-Homolog), das nicht permanent an die Membran gekoppelt ist. FtsY und SRα bestehen aus drei Domänen (A, N, G). Die Struktur der NG-Domäne aus FtsY ist homolog zur Struktur der NG Domäne aus SRP54. Die A-Domäne entspricht einer sauren N-terminalen Domäne, die in der Membranbindung involviert sein könnte. SRβ hat die Eigenschaften von Ras-ähnlichen GTPasen und dient vermutlich als ADP-ribosylation factor (Arf). Die mit SRβ interagierende SRα-Domäne (SRX) bildet eine kompakte αβ-faltung, ähnlich zu Proteinen, die im Vesikel-Trafficking involviert sind (SNARE Sec22b). FtsY vermittelt das Membran-Targeting über die Fähigkeit Membranlipide sowie die SecYEG Translokase zu binden. Nach der GTP-Hydrolyse durch SRP und FtsY, kann SRP von FtsY freigesetzt werden und die naszierende Polypeptidkette kann weiter in die Sec-Translokase insertiert werden. Die Struktur des RNC-SRP-SR Komplexes SRP54 befindet sich in der Nähe des Polyppeitd-Ausgangs des Ribosoms, während die Alu-Domäne von SRP an der Grenzfläche der ribosomalen Untereinheiten positioniert ist. Im SRP-SR Komplex sind die zwei NG- Domänen parallel ausgerichtet, sodass die zwei Nukleotid-Substrate an der Protein- Grenzfläche gepaart werden. Die 3 OH Gruppen der Ribosen des einen Nukleotids bilden H-Brücken zum γ-phosphat des anderen Nukleotids und zu konservierten Resten innerhalb der Proteine. Dadurch können die Proteine in trans agieren. Posttranslationales Protein-Targeting Sec-Pathway (kurze Zusammenfassung) Nach der vollständigen Translation und der Freisetzung aus dem Ribosom, binden die meisten sekretorischen Preproteine, die für den Sec Pathway bestimmt sind, an das molekulare Chaperon SecB. Die Bindung erfolgt über die reifen Regionen des Preproteins und gewährleistet, dass es in einem Translokations-fähigen Zustand bleibt. Dieser SecB-Preprotein Komplex wird zu SecA dirigiert, das SecB, die N-terminale Signalsequenz sowie einen reifen Teil des Preptroteins erkennt und bindet. Der neue trernäre Komplex wird nun zum SecYEG Translokon dirigiert. Er bindet an die Membran durch die Interaktion zwischen SecA und SecY sowie die Membraninsertion von SecA, wodurch SecB freigesetzt wird. Durch Ausnutzung der ATP-Hydrolyse und der protonenmotorischen Kraft erfolgen

57 dramatische Konformationsänderungen innerhalb von SecA, wodurch das Preprotein über die innere Membran translokiert wird. Das Chaperon SecB SecB ist ein 17 kda schweres Protein, das in den meisten Gram-negativen Bakterien vorkommt. In Lösung bildet sich ein Homotetramer (Dimer eines Dimers) aus, der einen Peptid-Bindekanal enthält. Es erkennt keine Signal-Sequenzen, bindet aber langsam faltende Proteine, da es hydrophobe Ausdehnungen und β-faltblätter erkennt. Es handelt sich um ein molekulares Chaperon, welches das Protein in einem kompetenten Zustand hält. Die Abbildungen zeigen die Tertiär- und Quartiärstrukturen von SecB. Die Preprotein-Bindetasche muss an der Oberfläche lokalisiert sein, was eine sehr stabile Struktur im oligomeren Zustand vorraussetzt. Sie ist sehr hydrophob, da die hydrophoben Interaktionen die treibende Kraft für die Bindung der Preproteinbindung darstellt. Außerdem muss sie flexibel sein, da sie ein breites Spektrum an Peptid-Substraten hat. Die Abbildung zeigt die Preprotein-Bindetasche von SecB. Rot dargestellt ist eine tiefe Bindetasche, welche aromatische und konservierte Reste enthält und hydrophobe Regionen erkennt. Blau dargestellt ist eine flache Bindetasche, welche hydrophobe, aber keine aromatischen Reste enthält und möglicherweise β-faltblätter bindet. SecA als Signalsequenz-Rezeptor SecA ist ein einzigartiger Rezeptor für Signalsequenzen, der nur in Bakterien und endosymbiotisch entstandenen Organellen vorkommt, dort aber essentiell ist. Er ist Teil des Sec-Pathways in Bakterien für das Targeting extrazytoplasmatischer Proteine. Dieser Pathway wird eingeleitet, wenn eine Signalsequenz eines neu synthetisierten Vorläuferproteins durch SecA erkannt wird. SecA ermöglicht im Gegensatz zu SRP neben der Erkennung des Substrats weitere kritische Schritte während des Protein-Targetings. So agiert SecA als prozessiver ATP-getriebener Motor, um die Translokation von Preproteinen über die Membran zu beschleunigen. SecA interagiert selektiv

58 während des Sec-Pathways mit der Signalsequenz, mit SecB sowie mit SecY und unterliegt großen Konformationsänderungen. Struktur und Konformationszustände von SecA SecA ist ein 102 kda schweres Multidomänen Protein, das sowohl als Monomer oder Homodimer vorliegen kann. Konformationsänderungen, die im Wesentlichen Umorientierungen von Domänen entsprechen, konvertieren SecA von einer Wasser-löslichen dimeren Form (geschlossene oder offene Konformation) in ein integrales Membranprotein (weit geöffnete Konformation), dessen oligomerer Zustand bisher unbekannt ist. In der geschlossenen Konformation ist die PPXD dicht an die HWD gepackt. In der offenen Konformation sind die Domänen voneinander weg rotiert. Die Umorientierungen der Domänen werden direkt durch die Bindung eines Liganden induziert und durch intramolekulare Interaktionen stabilisiert. Eine Schwächung dieser intramolekularen Interaktionen, wie sie im Ligand-freien Zustand vorliegt, führt zur partiellen Dissoziation der Domänen. Hat ein Ligand gebunden, so liegt die geschlossene Konformation vor (Ligand festgeklemmt), rotieren die Domänen voneinander weg, so dissoziiert der Ligand wieder ab. In der SecY-gebundenen Konformation liegt SecA in einer geöffneten Konformation vor, wobei die PPXD im Vergleich zum Ligand-gebundenen offenen Zustand, noch weiter von der HWD weg rotiert ist und Kontakte mit der NBD2 eingeht (siehe Abbildungen). So wird der Ligand in die SecY Pore zwecks Translokation freigesetzt. In Bezug auf die geschlossene Konformation rotiert PPXD in der SecY-gebundenen Konformation mithilfe einer Hinge-Region (2 kurze β-faltblätter zwischen PPXD und NBD1) um 80 in Richtung NBD2 und um 10 in Richtung Membran. Ein konservierter Loop innerhalb der PPXD kontaktiert nun sowohl NDB1 als auch NBD2, wodurch er in die Nähe der Nukleotid-Bindestelle gelangt.die Grenzfläche zwischen PPXD und NBD2 ist perfekt am lateralen Gate von SecY ausgerichtet, sodass eine kontinuierliche Naht auf der Oberflche des SecA-SecY Komplexes erzeugt wird.

59 Die Struktur der löslichen, geschlossenen Form zeigt eine einzigartige Multiple-Domänenorganisation (siehe Abbildung, links Monomer, rechts Homodimer). SecA besteht aus zwei RecA-ähnlichen Nukleotid- Bindedomänen (NBD1 und NBD2), welche Nukleotide genau an ihrer Grenzfläche binden. Der Übergang von der ADP-gebundenen Form zu einer intermediären Form, die während der ATP-Hydrolyse auftritt beinhaltet eine Rotation der NBD2 um 15. Dabei bewegt sich auch der für die Hydrolyse essentielle Arg-Finger der NBD2 (Arg570) in Richtung des γ-phosphats, welcher die ATP-Hydrolyse vermittelt. Die Funktion der weiteren Domänen und der Mechanismus mit dem SecA die Polypeptide durch das Translokon SecYEG drückt ist nicht sicher bekannt. Ein Modell ist in Abschnitt SecYEG-SecA Komplex beschrieben. Die Liganden-vermittelte Domänen-Dissoziation führt zur Insertion der C-terminalen Region von SecA in die Membran und zur Aktivierung der Translokase-Funktion. Eine spezifische Region innerhalb des C-Terminus dient als intramolekularer Regulator der ATPase Aktivität (IRA1). Es wird angenommen, dass die Bindung des Liganden die Freisetzung bzw. Entsperrung von IRA1 induziert, wodurch die Translokase funktional wird. Es existiert eine zweite Region, die synergistische Effekte hat (IRA2) und in der zweiten Helikase-Domäne lokalisiert ist.

60 Erkennung der Signalsequenz durch SecA Die exakte Bindestelle der Signalsequenz in der zytoplasmatischen SecA Form ist über NMR- Spektroskopie ermittelt worden. Es handelt sich um eine elongierte Bindetasche aus apolaren Resten, umgeben von sauren Resten. Nach der durch die Bindung des Preproteins und SecB ausgelösten Konformationsveränderung in die offene Form wird die Signalsequenz mit einer erhöhten Affinität gebunden. Dies lässt auf die Existenz von zwei Bindestellen schließen, einer mit niedriger Affinität im zytosolischen SecA und eine mit hoher Affinität in der aktivierten Form. IRA1 agiert dabei als molekularer Schalter um die Bindung der Signalsequenz zu regulieren. Es wird angenommen, dass die Rotation der PPXD in SecA das Festhalten des Substrats in einer Klemme bewirkt. Im offenen Zustand kann das Substrat die Klemme betreten, wonach die durch Substratbindung induzierte Schließung der Klemme das Festhalten des Substrats im geschlossenen Zustand induziert. Diese Klemme wird durch PPXD, NBD2 und Teile der HSD gebildet. Das Innere der Klemme enthält konservierte Reste und einen hydrophoben Bereich. Der Membran-nahe Bereich der Klemme wird durch den Zwei-Helix- Finger gebildet, welcher auch die Öffnung des SecY-Translokons induziert. So ist das Substrat bereits für die Translokation korrekt positioniert. SecB-vermitteltes Protein-Targeting und Interaktion mit SecA SecB (D27, E31, I84, E86) bindet die 22 C-terminalen, positiv geladenen Reste aus SecA. Es wird angenommen, dass beide C-Termini von SecA an beide Seiten von SecB binden, wie eine Struktur von SecB im Komplex mit einem 27 AS langen Peptid aus dem C-Terminus von SecA zeigt (Abbildung).

61 Das zytosolische Chaperon SecB interagiert mit der C-terminalen Domäne aus SecA. Diese Domäne ist auf der Membran-abgewandten Seite von SecA lokalisiert, sodass SecB und SecY an entgegengesetzten Seiten von SecA binden. Diese Anordnung erlaubt den schrittweisen Transfer von Polypeptidketten von SecB über SecA auf SecY. Die Bindung zwischen SecA C-Terminus und SecB wird durch Zink vermittelt, das in SecA gebunden ist. Die an der Koordination von Zink beteiligten Reste im SecA C-Terminus sind hochkonserviert.

62 Kernkomponenten und Akzessorische Komponenten des Sec-Translokons Struktur von SecY im SecYEG-Komplex Der konservierte, heterotrimere Membranprotein-Komplex (SecYEG-Komplex in Bakterien und Archeen, Sec61-Komplex in Eukaryoten; Allgemein: Protein-Conducting-Channel, PCC) besteht aus einer großen α-untereinheit (SecY, Sec61α) und zwei kleineren β- und γ-untereinheiten (SecG, Sec61β und SecE, Sec61γ). Archeen weisen bis auf die β-untereinheit (Secβ) die bakteriellen Komponenten SecY und SecE im PCC auf (SecYEβ-Heterotrimer). Der Kanal kann mit verschiedenen Interaktionspartnern assoziieren, sodass verschiedene Interaktionspartner die treibende Kraft für die Translokation aufbringen können. In Bakterien kann der SecY-Kanal entweder an das Ribosom binden, um Polypeptide während ihrer Synthese zu translokieren, oder mit der SecA ATPase assoziieren, um sekretorische Proteine nach vollständiger Synthese zu transportieren. Post-translationale Translokation in Bakterien benötigt neben SecYEG auch die ATPase SecA, welche das Polypeptid durch den SecY Kanal drückt, wobei der SecY Kanal ein wässriges Milieu im Innern aufweist. In Bakterien bildet SecY (in Säugern Sec61α) alleine den Membrankanal, über den Preproteine sekretiert werden. Es handelt sich um die größte Untereinheit des heterotrimeren Translokationskanals. Betrachtet vom Zytosol, hat SecY eine quadratische Form und besteht aus zwei verbundenen Hälften (TM1-5: blau und TM6-10: rot), welche an der Vorderseite ein laterales Tor bilden und an der Rückseite über SecE (Sec61γ) zusammen gebunden sind. Der Loop zwischen TM5 und TM6 dient als Hinge, wodurch SecY am Eingang ein laterales Gate öffnen kann. SecE verbindet die zwei Hälften von SecY an der Rückseite, indem es ein TM-Segment diagonal über die SecY-Fläche exponiert. SecG (Sec61β) kontaktiert SecY nur an der Peripherie; es ist auch nicht für die Translokation essentiell.

63 Die Helices von SecY bilden eine Sanduhr-förmige Pore, die aus einem zytoplasmatischen und einem externen Schacht besteht. Die engste Spalte dieser Pore ist genau im Zentrum der Membran lokalisiert und wird durch einen Poren-Ring aus sechs großen hydrophoben AS (4x Ile, Val, Leu) gebildet, welche ihre Seitenketten radiär nach innen richten. Der zytoplasmatische Schacht ist leer, während der externe Schacht durch eine kurze Helix blockiert wird (Plug-Helix), welche mit den Poren-Resten interagiert. Dies entspricht dem geschlossenen Zustand von SecY. Die Öffnung des Kanals beinhaltet die Verschiebung der Helix, was durch die Interkalation einer hydrophoben Sequenz (Signalsequenz oder TM-Sequenz) in das laterale Gate des Kanals induziert wird. Das laterale Gate öffnet dadurch ein Fenster zur hydrophoben Membranschicht, wodurch hydrophobe Segmente von Membranproteinen in die Membran eingefädelt werden können und kleine hydrophile Moleküle daran gehindert werden die Membran zu passieren. Hydrophile Proteine dagegen werden vollständig über das Translokon auf die andere Seite der Membran transportiert. Für die Interaktion mit zytosolischen Faktoren, wie die große ribosomale Untereinheit, exponiert SecY zytoplasmatische Loops zwischen TMH6 und 7 sowie TMH8 und 9, welche 2 nm über der Membran herausragen. Diese Stellen werden als CFAD (cytosolic factor-associating domains) bezeichnet. SecG hat zwei TMs, wobei beide Termini auf der externen Seite der Membran lokalisiert sind. Der SecG Loop befindet sich genau zwischen SecA und SecY. SecG ist nicht essentiell für die Translokation, während SecY und SecE funktional essentiell und ebenso für die Lebensfähigkeit der Zelle notwendig sind.

64 Interaktionen zwischen SecA und SecY (bei posttranslationaler Translokation) Die Interaktion zwischen SecA und SecY ist während den intermediären Zuständen der ATP- Hydrolysereaktion am stärksten. Das flache SecA Molekül ist parallel zur Membranoberfläche orientiert, wobei NBD1, NBD2, PPXD und HSD die Ecken eines Quadrats bilden. Die Hauptinteraktionen erfolgen zwischen PPXD aus SecA und den Loops 8-9 und 6-7 aus SecY. Zusätzlich existieren Kontakte zwischen HSD aus SecA und SecY, die fast 50% der durch die Wechselwirkung verdeckten Oberfläche ausmachen. Die Interaktion zwischen dem C-terminalen Schwanz von SecY und HSD ist vermutlich funktional wichtig. Die lange Helix aus HSD befindet sich in direkter Nähe zum 2b-3 Loop aus SecY und dem SecG Loop, wobei beide Interaktionen nicht stark sind (geringe Interaktionsfläche). Ein zwei-helix-finger aus SecA, welcher der kleineren Helix aus HSD entspricht, ist in den zytoplasmatischen Schacht des Kanals inseriert. Der Loop, welcher die zwei Helices verbindet, befindet sich direkt über dem Eingang der SecY Pore und zwischen dem 6-7 Loop und dem C- terminalen Schwanz von SecY.

65 Interaktion zwischen Ribosom und SecY (bei cotranslationaler Translokation) Bei der cotranslationalen Translokation bindet das Ribosom an SecYEG und fördert die Translokation durch GTP-Hydrolyse getriebener Translation der naszierenden Kette. Gesamtstruktur des E.coli RNC-SecYEG Komplexes Die kristallisierte Struktur besteht aus einer chimeren naszierenden Kette aus dem TMH Signalanker von FtsQ und der SecM stalling sequence, die in einem Zellfreien Translationssystem mit dem Detergenz-solubiisierten SecYEG Komplex assoziiert. Es sind außerdem die drei kanonischen t-rna Bindestellen A, P und E sichtbar. Außerdem konnte der Weg von 100 Nukleotiden der mrna innerhalb der 30S Untereinheit sowie eines großen Teils der naszierenden Kette am Polypeptid Ausgangstunnel festgehalten werden. Die Abbildung zeigt folgende Komponenten o o o o o kleine ribosomale 30S Untereinheit (gelb) & große 50S Untereinheit (Hellblau) A (magenta), P (grün) und E (orange) trna-bindestellen mrna (cyan) und naszierende Kette im ribosomalen Exit-Tunnel (gold) PCC an der Polypeptd Exit-Stelle (translocating PCC; dunkelblau) PCC am 5 mrna Kanalausgang (non-translocating PCC; rot) Es ist eine große frontale Öffnung zwischen Ribosom und PCC an der Polypeptid Ausgangsstelle sichtbar (2nm hoch, 4 nm breit), durch das das translokierende Polypeptid zugänglich ist (orangener Pfeil). Außerdem sitzt auf 70% der kristallisierten Proteine ein nicht-translokierender PCC am Ausgang des mrna-tunnels. Senkrecht auf die Membranplatte gesehen, sind die Formen der zwei PCCs unterschiedlich: Der PCC am mrna Kanal ist ein elliptischer Zylinder (11nmx7nm), während der PCC am Polypeptid-Ausgang ein zirkulärer Zylinder (9,5nm Durchmesser) darstellt. Beide haben eine Höhe von 4,5 nm. Jeder PCC enthält zwei Kopien von SecYEG, die im Falle der nichttranslokierenden Einheit Front-to-Front orientiert sind. Der nicht-translokierende Zustand könnte daher als Start-Struktur fungieren, welche die Struktur des translokierenden PCC bestimmt. Mithilfe der in silico Methode NMFF (normal mode-based flexible fitting) wurde die erwartete Öffnungsbewegung verifiziert. Im Gegensatz dazu erfolgte diese Bewegung nicht, wenn von einer back-to-back Orientierung ausgegangen wird. Ribosom-PCC Interaktion Der ribosomale Polyppetid Ausgang wird im Bereich der PCC-Lokalisation von ribosomalen Proteinen und RNA umgeben. Die Ribosomalen Proteine L17, L32 und L22 sind an der PCC-Front,

66 oberhalb von PCC lokalisiert, interagieren aber nicht mit dem Translokon. Im Gegensatz dazu interagieren die Proteine L24, L29 und L23 mit PCC über die Rückseite (Back). Es existieren drei Kontakte zwischen PCC und Ribosom. Die Kontakte an den Seiten, C1 und C2, stellen Interaktionen zwischen spezifischen rrna Hairpins (h59 und h24) und der CFAD aus SecY dar, die für den Ribosom-PCC Kontakt essentiell sind. Der dritte Kontakt (C3) wird hauptsächlich über die Interaktionen von L29 und L23 mit der zytoplasmatischen Region aus SecG sowie der N-terminalen Region aus SecE vermittelt. Weder SecG noch der N-terminale Bereich aus SecE sind zwar für die Lebensfähigkeit essentiell, SecG stabilisiert jedoch den Ribosom-PCC Komplex und beschleunigt die Translokation naszierender Polypeptidketten. Es liegen zwei Haupt-mRNA Hairpins am Kanalausgang, direkt über der CFAD beider Heterotrimere des nicht-translokierenden PCCs. Die mrna kompetiert mit der rrna um die PCC-Bindung, welche auf identische Weise wie die rrna-pcc Interaktion der translokierenden PCC-Einheit erfolgt. Der Weg der naszierenden Polypeptidkette Die naszierende Kette (in Abbildung gelb in Ribosom bzw. grün in SecY) interagiert während der Translokation mit dem Finger-ähnlichen Ausdehnungen der ribosomalen Proteine L4 und L22 im Polypeptid Ausgangstunnel. Gegen Ende des Tunnels interagiert das Polypeptid wohlmöglich mit L23. Während der Translokation findet keine Öffnung des zentralen Kanals statt, sodass der Dimer des Heterotrimers einen einzelnen größeren Kanal bilden könnte. Jeder Heterotrimer bleibt eine einzelne Pore, wobei ein Kanal translokierende, der andere nicht-translokierende Funktionen inne hat. Während die Plug-Helix bei der translokierenden PCC-Einheit während der Translokation entfernt wurde, ist diese bei der nicht-translokierenden PCC-Einheit ständig vorhanden. Der dimere PCC-Komplex zeigt eine gewisse Assymmetrie: An der Front dominieren rod-like-features, während auf der Rückseite lamella-like-features dominieren. Dadurch könnte die Lipidzugänglichkeit an der Front höher sein als auf der Rückseite. Die Haken-förmige C-Terminale SecY Hälfte in Sec 1 YEG zwingt das Polypeptid in Richtung Front zur Lipidphase, während der Haken aus Sec 2 YEG den Weg in Richtung Rückseite (Back) fördert, welche durch die angrenzende Wand, bestehend aus den SecG- und SecE-TM-Helices, von der Lipidphase abgeschirmt ist.

67 Eine den PCC-Komplex lateral verlassende Signalsequenz oder TMH würde dann mit den TMH2 und 7 aus SecY an der Front zwischen beiden Heterotrimeren interagieren. Von dort aus kann das Polypeptid an YidC/TRAM (translocating chain-associated membrane) weitergegeben oder direkt in die Lipidphase entlassen werden. Konformationsänderungen in SecY infolge der Aktivierung durch SecA Bindung Alle Helices in der C-terminalen Hälfte von SecY bewegen sich infolge der SecA Bindung nach außen, wobei TM8 und TM9 die größten Konformationsänderungen zeigen. Ohne diese Konformationsänderung würde die α-helikale Region des 8-9 Loops mit dem Zwei-Helix-Finger

68 zusammenstoßen. Der Zwei-Helix-Finger in SecA sorgt demnach für die Weitung des SecY-Kanals. Diese ist für die Translokation essentiell, da die meisten Polypeptidketten, vor allem solche mit großen hydrophoben Seitenketten, den Porenring nicht passieren können. Die maximale Porengröße beträgt 1,5x2 nm, weshalb ein Polypeptid innerhalb der Pore eine α-helix, aber keine Tertiärstruktur bilden kann. Im geschlossenen Zustand ist die Pore an der engsten Stelle 0,9-1,5 nm breit (Die Eingangspore misst 2x4nm). Der TM9 Shift bewirkt, dass sich auch die auf der zytoplasmatischen Oberfläche der Membran befindliche amphipatische Helix aus SecE nach außen bewegt. Die Plug-Helix (TM2a) bewegt sich infolge der SecA Interaktion weg vom Zentrum des SecY-Kanals in Richtung der externen Membranseite. Sie kontaktiert nun nicht mehr die Poren-Reste und befindet sich nun dicht an den C-Terminus der TM7 gepackt. Dennoch hält die Plug-Helix noch immer den Kanal geschlossen. Er ist am Kanaleingang lokalisiert. Erst während der Translokation kontaktiert die Plug-Helix das TM-Segment aus SecE und ermöglicht damit die Öffnung des Kanals. Die Bindung von SecA erzeugt wichtige Veränderungen des lateralen Gates in SecY (Abbildung zeigt alle beteiligten Bereiche). Die Verschiebung von TM7 öffnet ein Fenster in Richtung des Lipid- Bilayer Zentrums. Die Lücke zwischen den Seitenketten aus TM7 und TM2b hat eine Breite von ca. 0,5nm. Das laterale Gate ist in Richtung der Lipid-Kopfgruppen durch die direkte Nähe von TM2b und TM8 sowie in Richtung der externen Seite durch einen Loop nach TM2a geschlossen. Durch die

69 Entfernung der Plug-Helix ist die Interaktion der TM-Segmente der beiden Protein-Hälften geschwächt. Dadurch öffnet und schließt sich das laterale Gate kontinuierlich, wodurch Polypeptid- Segmente, die im wässrigen Kanal lokalisiert sind zur umgebenden, hydrophoben Lipidphase exponiert werden. Bindung der Signalsequenz / des Polypeptids an SecY Durch Bindung des Substrat-gebundenen SecA in der geschlossenen Konformation an SecY geht SecA in die offene Konformation über und setzt dadurch das Substrat frei. Die hydrophobe Region der Signalsequenz bildet eine Helix mit zwei Windungen. Das Fenster im lateralen Gate, welches sich durch die Interaktion mit SecA in SecY gebildet hat, kann diese Helix nach einer weiteren, geringfügigen Vergrößerung aufnehmen. Dabei interkaliert die hydrophobe Region der Signalsequenz zwischen den TM-Segmenten 7 und 2b, direkt an der Grenzfläche zur Phospholipidmembran (Crosslinking zwischen Lipiden und Polypeptidkette möglich).

70 Die Signalsequenz inseriert als Loop in den zytoplasmatischen Schacht von SecY. Der positiv geladene N-Terminus wird auf der zytosolischen Seite des Fensters aufgrund von Interaktionen mit den negativ geladenen Phospholipid-Kopfgruppen zurückgehalten. Die Interkalation der Signalsequenz induziert die Kanalöffnung durch Verschiebung der Plug-Helix in Richtung Periplasma, wobei der Plug in die Nähe des TM-Segments der γ-untereinheit gedrückt wird. Die Insertion des Polypeptid- Segments nach der Signalsequenz in die Pore fixiert dann den offenen Zustand des Kanals. Nun kann SecA die Translokation mithilfe von ATPase-Zyklen katalysieren. Erst nachdem das Polypeptid den Kanal vollständig durchquert hat, kann der Plug wieder in den externen Schacht inserieren. Aufgrund des lateralen Gates kann ein Polypeptid-Segment im Zentrum der Pore mit den Kohlenwasserstoffketten der umgebenden Lipide wechselwirken. Wenn ein Segment ausreichend hydrophob ist, kann es in die Lipid-Phase übergehen und ein TM-Segment eines Membranproteins werden. Im Falle der ribosomal-vermittelten Translokation ist alleine die Insertion der Signalsequenz ausreichend den Kanal zu weiten und die Plug-Helix zu entfernen. Getrieben wird die Translokation durch die GTP-Hydrolyse und fortschreitende Translation. Dimere oder Oligomere SecY-Komplexe Der SecYEG Komplex ist nach aktueller Meinung ein funktionaler Monomer, aber ein struktureller Dimer. SecY-Kanäle liegen nach der E.coli Kristallstruktur als Dimere vor, wobei jeder Kanal eine spezifische Funktion erfüllt. Die eine Hälfte translokiert das Substrat, während die andere Hälfte den SecA-Motor am richtigen Platz fixiert. Dabei interagiert der 6-7 Loop einer nicht-translokierenden SecY Version mit der NBD1 aus SecA. Diese SecY Version bindet an die translokierende SecY-Version in einer backto-back Orientierung (in anderen Strukturen: front-to-front; siehe Ribosom-SecY Interaktion). Innerhalb der Membran ist die Interaktion zwischen diesen zwei SecY-Komplexen durch die negativgeladenen Lipide stabilisiert, die auch für die Translokation essentiell sind.

71 Andere Experimente (Fluoreszenz-Quenching) zeigten, dass mehrere SecY-Komplexe an der Vorderseite (Front) miteinander interagieren. Dabei fusionieren die lateralen Gates, um eine größere Pore zu bilden (4-6nm statt 1,5-2nm). Oligomere Komplexe werden auch bei der cotranslationalen Translokation beobachtet. Wenn ein Komplex aus Ribosom, naszierender Kette und SRP an den SRP-Rezeptor bindet, resultiert eine Konformationsänderung innerhalb einer SRP-Domäne, wodurch eine ribosomale Stelle exponiert wird, an die SecY binden kann. Das gebundene SecY Molekül befindet sich in der Nähe des Punktes, an dem das Polypeptid das Ribosom verlässt und stellt damit die translokierende Version dar. In einer späteren Phase der Translokation, dissoziiert SRP vom Ribosom ab, wodurch eine oder mehrere SecY Komplexe assoziieren können. Diese SecY-Versionen könnten die Ribosom-Kanal Übergangsebene stabilisieren und andere Komponenten rekrutieren. Beispiele wären die Signal-Peptidase und die Oligosaccharyl-Transferase, welche für die Polypeptid-Modifkation benötigt werden sowie der Translokon-assoziierte Komplex (TRAP), dessen Funktion unklar ist. Die Dissoziation des SecY Oligomers könnte dann die Freisetzung des Ribosoms von der Membran beschleunigen, um Kanal-Partner und die Translokationsmodi zu wechseln. Der SecDFYajC Komplex Der heterotrimere Komplex SecDFYajC beschleunigt die Translokation sekretorischer Proteine und die Insertion von Membranproteinen durch den SecYEG-Komplex. SecDFYajC gehört neben SecA und YidC zu den akzessorischen Komponenten der SecYEG Translokase. Es wird angenommen, dass SecDF das Zurückrutschen der Preproteine verhindert und somit den SecA-Zyklus und die Freisetzung translokierender Proteine aus dem Translokon reguliert. YajC ist nicht essentiell für den Proteinexport oder die Membranprotein-Insertion. Modelle und Mechanismen der Translokation Der Translokationskanal alleine ist eine passive Pore. Die treibende Kraft für die Translokation kommt von anderen Bindepartnern. In Abhängigkeit vom Bindepartner variiert auch der Translokationsmechanismus. Es sind drei verschiedene Mechanismen bekannt. Cotranslationale Translokation: Ribosom Hauptinteraktionspartner bei diesem Mechanismus ist das Ribosom. Diesen Translokationsmodus findet man in allen Zellen. Er wird zur Translokation sekretorischer Proteine sowie für die Membran-Integration der meisten Membranproteine verwendet. Die Cotranslationale Translokation beginnt mit einer Targeting-Phase. Das Signal oder die TM- Sequenz einer wachstenden Polypeptidkette wird durch SRP erkannt und gebunden. Der Komplex aus Ribosom, naszierender Kette und SRP bindet dann an die Membran, zunächst über eine Interaktion zwischen SRP und dem SRP-Rezeptor und später durch eine Interaktion zwischen dem Ribosom und dem Translokationskanal SecY im SecYEG- bzw. Sec61αβγ-Komplex. Die elongierende Polypeptidkette bewegt sich direkt von dem Tunnel innerhalb des Ribosoms in den assoziierten Membrankanal. Die Bewegung des Polypeptids in den Translokationskanal benötigt keine Nukleotidhydrolyse. Lediglich für die Kettenverlängerung durch das Ribosom ist GTP-Hydrolyse erforderlich. Im Fall von Membranproteinen existieren Polypeptidsegmente, welche nicht den Kanal

72 betreten sondern im Raum zwischen Ribosom und Kanal verbleiben und damit zytosolische Domänen ausbilden. Posttranslationale Translokation Dieser Translokationsmechanismus wird für einen großen Proteinanteil von einfachen Organismen wie Bakterien und Hefen verwendet. Targets sind viele lösliche Proteine wie sekretorische Proteine, die eine nur durchschnittlich hydrophobe Signalsequenz aufweisen, weshalb sie nicht vom SRP erkannt werden. Diese Proteine müssen in einem ungefalteten oder nur schwach gefalteten Zustand gehalten werden, nachdem sie vom Ribosom freigesetzt wurden. Posttranslationale Translokation erfolgt durch verschiedene Mechanismen in Eukaryoten und Bakterien. Posttranslationale Translokation in Eukaryoten Während der posttranslationalen Translokation in Hefe, wahrscheinlich in allen Eukaryoten, bildet der Translokationskanal einen heterotetrameren Komplex, bestehend aus Sec61α (SecY-Homolog), Sec62 und Sec63 (für Translokation essentiell) sowie dem Chaperon BiP. Am Sec62/Sec63 Komplex sind in Hefe ebenso die für die Translokation nicht essentiellen Proteine Sec71 und Sec72 beteiligt. Säugerzellen jedoch haben ausschließlich Sec62 und Sec63. Es handelt sich bei Sec62/Sec63 um andere Proteine (ungleich Sec61β, Sec61γ), die mit Sec61α einen Komplex eingehen können. Somit ist nur die Kernkomponente Sec61α des Translokons bei post- und cotranslationaler Translokation in Eukaryoten identisch. Die Translokation beginnt mit der Bindung des zu translokierenden Substrats an den Translokationskanal, während alle an das Substrat gebundenen Chaperone freigesetzt werden. Die Translokation des Polypeptids erfolgt nun nach einem ratcheting Mechanismus. Die Polypeptidkette kann im Kanal in jede Richtung durch Brownsche Molekularbewegung diffundieren, wobei ihre Bindung an BiP innerhalb des ER-Lumens die Rückwärtsbewegung ins Zytosol verhindert, wodurch eine Netto-Vorwärtsbewegung resultiert. ATP-gebundenes BiP mit einer offenen Peptid-Bindetasche interagiert mit der J-Domäne von Sec63, was zu einer schnellen ATP-Hydrolyse und zu einer Schließung der Peptid-Bindetasche um das zu translokierende Substrat führt. J-Domänen aktiviertes BiP hat eine niedrige Binde-Spezifität, wodurch es mit jedem Polypeptid-Segment interagiert, dass durch den Kanal ins ER-Lumen translokiert wird. Wenn die Polypeptidkette ausreichend weit in die Vorwärtsrichtung diffundiert ist, kann das nächste BiP Molekül binden. Dieser Prozess wird wiederholt, bis das vollständige Polypeptid den kanal durchquert hat. Ein Nukleotidaustausch von ADP zu ATP öffnet nun die Peptid- Bindetasche und setzt BiP damit aus der Polypeptid-Bindung frei.

73 Posttranslationale Translokation in Bakterien Zusammenfassung In der bakteriellen, posttranslationalen Translokation ist der Kanal-Bindepartner SecA. Der Translokationsprozess beginnt im Zytosol mit der Interaktion zwischen SecA und der Signal- Sequenz-enthaltenen Polypeptidkette. Dieser Prozess wird oft durch das Chaperon SecB vermittelt, das Polypeptide mit hydrophoben Bereichen zu SecA dirigiert. Durch den ATP-Hydrolysezyklus in SecA wird die Polypeptidkette nun vollständig durch die SecY Pore gedrückt ( Pushing Mechanismus). Dabei unterliegt die PPXD aus SecA einer großen Konformationsänderung: im ADP- Zustand wird das zu translokierende Substrat in einer Klemme festgehalten, während im ATP- Zustand die Klemme geweitet ist. Die Polypeptid-Bewegung durch den SecY-Kanal wird durch den Zwei-Helix-Finger aus SecA ermöglicht, welcher das Polypeptid ebenso zyklisch bindet und freisetzt und es damit in den zytoplasmatischen Tunnel von SecY drückt, wodurch sich dieser verbreitert. Dabei interagiert SecA mit einer nicht-translokierenden SecY-Version und bewegt das Polypeptid durch ein benachbartes SecY. SecA-vermittelte Bewegung der Polypeptidkette durch das Translokon Es wird angenommen, dass sich die Spitze des Zwei-Helix-Fingers aus SecA innerhalb des zytoplasmatischen SecY Schachts während des ATP-Hydrolyse-Zyklus hoch und runter bewegt, wodurch die Polypeptidkette durch die Pore gedrückt wird. Der Finger würde so das Polypeptid an seiner Spitze binden und es infolge von Konformationsänderungen nach unten drücken, wenn SecA ATP bindet. Infolge der ATP-Hydrolyse würde er das Polypeptid wieder freisetzen und in seine Ausgangskonformation zurückkehren, wonach SecA den ATP-gebundenen Zustand wiederherstellt. Dieser Mechanismus ist identisch zu den hexameren RecA-ähnlichen ATPasen wie ClpX, ClpA, HslU und p97. Hier übernimmt Tyr (Trp im Fall von p97) eine essentielle Rolle innerhalb eines sich an der Spitze befindlichen Loops, welcher in der zentralen Pore die Polypeptidkette kontaktiert. Auch SecA hat einen für die Translokation essentiellen Tyr-Rest an der Zwei-Helix Fingerspitze. Durch das auf

74 und ab des Fingers wird auch die SecY Pore zyklisch geweitet, wodurch die Translokation erst ermöglicht und ein zurückrutschen der Polypeptidkette verhindert wird. Koordiniert mit den Bewegungen des Zwei-Helix Fingers würde die Klemme aus SecA das translokierende Polypeptid im ADP-Zustand festhalten und im ATP-Zustand freisetzen. Die Klemme verengt und weitet sich dabei zyklisch während des ATP-Hydrolysezyklus, ohne eine Rotation der PPXD. Eine translokierende Polypeptidkette innerhalb der Klemme könnte transient ein kurzes β-faltblatt mit den zwei β-faltblättern zwischen NBD1 und PPXD bilden. Diese Sequenz-abhängige Interaktion konnte in Kristallstrukturen beobachtet werden. Die Bildung eines β-faltblatts im translokierenden Polypeptid könnte die Bewegungen der PPXD einschränken und die Interaktion mit den Loops in SecY verstärken. Die Hydrolyse von einem Molekül ATP ist mit der Translokation eines Polypeptid-Abschnitts einer Länge von AS verknüpft. Am Ende der Translokation, wenn sich das Polypeptid über die β-faltblätter zwischen NBD1 und PPXD hinaus bewegt hat, kann die PPXD wieder frei rotieren. PPXD rotiert damit von der NBD2 weg (weit geöffnete Konformation), wodurch SecA in die offene Konformation übergeht und vom SecY- Komplex abdissoziiert. Im Gegensatz zur cotranslationalen Translokation können während der Posttranslationalen Translokation teilweise gefaltete, Disulfid-Brücken verknüpfte Regionen von Preproteinen das Translokon passieren. Daher ist es möglich, dass SecA über den Helix-Finger einen höheren Öffnungsgrad erzeugt als die Interaktion zwischen Ribosom und SecY. Mechanismus der Kanal-Öffnung SecY befindet sich vor der Interkalation eines Polypeptids in einem geschlossenen Zustand. Die Kanalpore ist durch eine Abschnürung im Zentrum (laterales Gate ohne Fenster) sowie die Plug-Helix am Ausgang blockiert.

75 Das Polypeptid inseriert als Loop in den Translokationskanal, wobei die Signalsequenz zwischen den Wänden des Kanals interakaliert. Die Öffnung des Kanals für die Loop-Insertion erfolgt in zwei Schritten. Zunächst bindet ein Kanal-Partner (Ribosom, Sec62/63 oder SecA), was die Interaktionen, welche den Plug im Zentrum von SecY halten, destabilisiert (Pre-aktivierter Zustand von SecY). Das Ribosom und SecA interagieren mit den zytosolischen Loops der C-terminalen Hälfte von Sec61/SecY, welche Konformationsänderungen auf das gesamte Molekül übertragen. Dies resultiert in einer transienten Entferung der Plug-Helix und einer kontinuierlichen Öffnung und Schließung des lateralen Gates (Methode: Messung der Ionenleitfähigkeit bei Bindung an das Ribosom). Der zweite Schritt ist die Interkalation des hydrophoben Segments der Signalsequenz in das laterale Gate (aktivierter Zustand von SecY; siehe Interaktion zwischen SecY und Signalsequenz). Cleavage der Signalsequenz An einem bestimmten Punkt der Translokation wird die Signalsequenz durch die Signal-Peptidase geschnitten und weiter durch die Signal-Peptid-Peptidase (Presinilin-ähnliches Enzym, das das hydrophobe Segment innerhalb der Membran spaltet) degradiert. Integration von Membranproteinen Unterschiedliche Membranprotein-Typen Membranproteine variieren in ihrer Komplexität erheblich. Es gibt zwei Grundtypen integraler Membranproteine: Solche mit α-helikalen TM-Segmenten, welche am häufigsten vorkommen und solche mit multiplen β-faltblättern (β-barrels), welche hauptsächlich in der äußeren membran Gramnegativer Bakterien und der äußeren mitochondrialen membran vorkommen. In E.coli durchspannen Membranproteine die Membran 1 bis 18 mal. Man unterscheidet daher generell monotopische (1 TM-Segment) von polytopischen (mehrere TM-Segmente) Membranproteinen. Monotopische Membranproteine können nochmals in Typ1 (C-Terminus ist zytosolisch) und Typ2 (N-Terminus ist zytosolisch) unterteilt werden. Die Orientierung dieser Proteine wird durch positiv geladene Loops bestimmt, die im Zytosol lokalisiert sind. Jedes TM- Segment besteht aus 20-27AS, die meist orthogonal zur Membran angeordnet sind, aber auch leicht gewinkelt sein können.

76 Ungefähr 20-30% aller Proteine, die durch das bakterielle Proteom codiert werden sind innere Membranproteine (IMPs), 2% sind äußere Membranproteine. Integrale Membranproteine können mehrere Membran- und Extramembran-Untereinheiten, prosthetische Gruppen und Metallcluster aufweisen. Sollte ein Polypeptid eines Membrankomplexes nicht korrekt assemblieren, werden alle anderen Polypeptide des Komplexes oft mit degradiert. Das Targeting von Membranproteinen in die richtige Membran ist abhängig vom Organismus unterschiedlich kompliziert. Während Gram posotive Bakterien und Archeen nur ein Membransystem (Plasmamembran) aufweisen, so besitzen Gram-negative Bakterien zwei Membranen (innere zytoplasmatische Membran und äußere Membran) und Eukaryoten zusätzlich zur Plasmamembran zahlreiche, weitere interne Membransysteme. Proteine können durch SecB/A zum Translokon dirigiert werden, wobei die meisten Membranproteine durch SRP cotranslational zum Zielort geführt werden. Membraninsertions-Systeme in Bakterien In E.coli existieren drei Translokasen, welche Membranproteine in die Membran inserieren können. Die meisten Zytoplasma-Membranproteine werden durch die Sec-Translokase insertiert. Die Twin-Arginin-Translokationsmaschinerie (Tat) ist hauptsächlich für die Translokation gefalteter Proteine zuständig, die exportiert werden sollen und typischerweise Metallhaltige Cofaktoren enthalten. Außerdem spielt sie in der Biogenese einiger bakterieller Membranproteine eine Rolle. Die YidC-Insertase insertiert Sec-unabhängige Proteine in die zytoplasmatische Membran, kann aber auch in Zusammenarbeit mit dem Sec-Pathway agieren. Insertion von monotopische Typ 1 Membran-(Glyko)proteinen: N-Terminus luminal, C-Terminus zytosolisch (N-out, C-in) Insertion von monotopische Typ 2 Membran-(Glyko)proteinen: N-Terminus zytosolisch, C-Terminus luminal (C-out, N-in)

77 Insertion polytopischer Membranproteine Membranprotein-Insertion durch SecYEG-SecA Durch das kontinuierliche Öffnen und Schließen des lateralen Gates werden die translokierenden Polypeptide an die Lipidschicht exponiert. Sind die Polypeptidsegmente ausreichend lang und hydrophob um die Membran einmal zu durchspannen, können sie das Translokon über das laterale Gate verlassen. Dies geschieht, da hydrophobe Bereiche besser in der Membran, als im wässrigen Kanalinneren löslich sind. Die Membraninsertion wird damit ausschließlich durch Lipid-Protein Interaktion vermittelt, wobei ein hydrophober Protein-Bereich als Stopp-Transfer-Domäne fungiert, der die Membraninsertion induziert. TM-Segmente nehmen entweder einzeln oder in Paaren den lateralen SecY-Ausgang. Hydrophile Segmente zwischen den TM-Segmenten würden alternativ vom Ribosom durch den wässrigen Kanal auf die externe Seite der Membran transportiert werden oder zwischen Ribosom und Kanal im Zytosol auftauchen. Letzteres benötigt eine Lücke zwischen Kanal und Ribosom, die auch in EM-Aufnahmen sichtbar ist. SecA wird für die Translokation großer hydrophiler Domänen von Membranproteinen und in einigen Fällen für die Translokation kurzer Loops benötigt. Für monotopische Membranproteine wird SecA für die Translokation kurzer periplasmatischer Loops (ca. 13 AS) benötigt. SecA wird dagegen nicht benötigt, wenn das Protein eine downstream TM-Region aufweist. Die Orientierung der Membranproteine innerhalb der Membran ist von der Polypeptid-Sequenz abhängig. Ein hydrophobes TM-Segment kann reversibel in 2 verschiedenen Konformationen ans

78 laterale Gate binden. Wenn eine hydrophobe Sequenz lang ist und der N-Terminus nicht im Zytosol gehalten wird (z.b. durch positive Ladung oder Faltung des Polypeptidbereichs), kann das Polypeptid über die Membran flippen und sich lateral in die Lipidphase einlagern (Abbildung, oben). Wenn der N-Terminus im Zytosol gehalten wird und die Polypeptidkette weiter ribosomal verlängert wird, kann der C-Terminus über die Membran translokieren und das Polypeptid als Loop in die Membran eingelagert werden. (Abbildung unten). YidC/TRAM-vermittelte Insertion und Assemblierung multimerer Membranproteinkomplexe Die Oxa Membranprotein-Familie Die Oxa-Proteinfamilie besteht aus bisher drei bekannten homologen Proteinen, welche die Membraninsertion von Membranproteinen vermitteln. In Hefe werden Zellkern-codierte Proteine, die in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert sind, zunächst in die Matrix transportiert. Mitochondrial codierte Proteine werden direkt dort synthetisiert. Da Mitochondrien keine Sec-Translokase aufweisen, wird die nachfolgende Membraninsertion durch Oxa1p vermittelt. Eine äquivalente Funktion übernimmt Alb3 in den pflanzlichen Chloroplasten. YidC ist ein bakterielles Homolog zu Oxa1p in Hefe. Ein entsprechendes Homolg in Archeen ist bisher nicht bekannt. Alle drei Proteine haben eine konservierte C-terminale Region, die aus fünf TM-Segmenten besteht. YidC hat insgesamt jedoch sechs N-terminale TM-Segmente und eine große, nicht konservierte periplasmatische Domäne. Oxa1 und Alb3 haben dafür eine lange C-terminale Domäne, welche in der Matrix bzw. im Stroma lokalisiert ist. In Oxa1 folgt die C-terminale Domäne direkt dem TM5 und fungiert als Ribosom-Bindedomäne. YidC: Struktur und Funktion Es wird vermutet, dass YidC als Membranprotein-Insertase fungiert, die unabhängig oder in Zusammenarbeit mit dem Translokon agieren kann. Die Substrate des YidC-only Pathways sind limitiert, jedoch alle Bestandteil großer oligomerer Assemblierungen, sodass vermutet wird, dass YidC in die Assemblierung multimerer Membranprotein-Komplexe involviert ist. YidC besteht aus sechs TM-Regionen und einer großen periplasmatischen Domäne zwischen TM1 und TM2. Für die Funktion essentiell sind ausschließlich die TM-Segmente 2,3 und 6. Eine Region von YidC interagiert mit dem SecDFYajC-Komplex, der YidC mit der Sec-Translokase verknüpft. Dabei ist eine Seite eines β-sandwichs der nicht konservierten periplasmatischen Domäne aus YidC für die

79 Interaktion mit SecF verantwortlich. Es ist bisher nicht bekannt, ob YidC als Oligomer oder Monomer vorliegt. Oxa1 scheint als Tetramer vorzuliegen. Die Rolle von YidC in der Sec-abhängigen Membranprotein-Insertion YidC befindet sich in der Nachbarschaft des zu inserierenden TM-Segments, während die hydrophilen Regionen des inserierenden Membranproteins in der Nähe von SecY und SecA lokalisiert sind. YidC agiert bei der Sec-abhängigen Membraninsertion vermutlich als Chaperon, welcher den Transfer hydrophober Bereiche durch das laterale Gate in SecY vermittelt und das TM- Segment nach dem Transfer stabilisiert. YidC interagiert mit apolaren Domänen von Membranproteinen auf zwei unterschiedliche Weisen. Im Fall der Leader-Peptidase, welche die Membran zweimal durchspannt, interagiert YidC nacheinander mit den apolaren Domänen, bevor sie die Lipidphase betreten (Sequentielles Modell). Im Gegensatz dazu (im Falle der Mannitol-Permease) bildet YidC in einem anderen Modell eine Assemblierungs-Stelle für hydrophobe Domänen während des Insertionsprozesses. Hier erfolgt die Insertion der hydrophoben Segmente in die Lipid-Phase ausschließlich nach der Packung der TM- Segmente und der Bildung eines Helix-Bündels. Dieser wird von YidC entlassen, sodass alle TM- Segmente die Lipid-Phase gleichzeitig betreten. In beiden Proteinen betreten und verlassen die apolaren Domänen den Sec-Kanal einzeln. YidC- Defizienz hat insgesamt nur geringe Auswirkungen auf die SecY-abhängige Insertion von Membranproteinen. YidC wird in vielen Fällen nicht für die Insertion benötigt, spielt aber eine kinetische Rolle während der lateralen Freisetzung der TM-Segmente aus dem Translokon und hat eine Chaperon-Funktion inne. YidC könnte eine amphiphilische Oberfläche bilden, welche geladene

80 Reste bzw. TM-Segmente von der hydrophoben Acylketten-Umgebung bzw. hydrophilen Lipidkopfgruppen abschirmt. Außerdem existiert mindestens ein Fall, wo YidC essentiell für die SecY-abhängige Insertion ist (CyoA- Untereinheit des Cytochrom bo3 Oxidase Komplexes). YidC-Defizienz bewirkt auch einen Defekt in der Häm-Inkoorporation, sodass YidC für die Insertion der Untereinheiten, für die Cofaktor- Inkoorporation sowie die Komplexassemblierung zuständig sein könnte, da es sich um eng miteinander koordinierte Prozesse handelt. YidC als unabhängige Insertase Das M13 procoat Protein und das Pf3 coat Protein werden durch den YidC-only Pathway in die Membran integriert. Im aktuellen Modell der Membraninsertion des Pf3 coat Proteins durch YidC kontaktiert YidC die Reverse Signal-Anker-Domäne aus Pf3 und beschleunigt damit die Translokation des kurzen N-terminalen Schwanzes. Nach dem Translokationsschritt wird die apolare Domäne von Pf3 lateral von YidC in die Lipidschicht freigesetzt. Ein Signal-Anker (Typ 1 Signal Anker) ist eine topogene Sequenz, welche die Translokationsinitiation am C-terminalen Ende eines Membranproteins induziert. Er bleibt als Membran-durchspannende (Membran-Anker) Region im Protein enthalten und sorgt für eine N in C out -Orientierung des Membranproteins. Im Gegensatz dazu bewirkt der Reverse Signal-Anker eine N out C in -Orientierung, da die Translokationsinitiation am N-terminalen Ende induziert wird. Das Insertionsmodell für das M13 procoat Protein nimmt an, dass YidC die Bewegung der zwei dicht benachbarten hydrophoben Domänen in die Membran katalysiert, sodass sie orthogonal zur Membran stehen. Dabei bilden die hydrophoben Domänen einen helikalen Hairpin, das ein spaltbares Signalpeptid und eine Membran-Anker-Region beinhaltet. Nach der Translokation der kurzen Periplasmatischen Domäne, wird das Signalpeptid und die Membrananker-Domäne lateral in die Membran freigesetzt. Das Signalpeptid wird vom procoat Protein proteolytisch entfernt, wonach es durch die Signal Peptidase zu einem reifen coat protein maturiert wird. Die Energetik der Membraninsertion kleiner coat Proteine beinhaltet damit zusammenfassend Beiträge hydrophober Interaktionen zwischen TM-Segmenten und Membran-Phospholipiden, die helikale Hairpin-Bildung der Signalsequenz und die PMF-getriebene Translokation negativ geladener Reste (innen ist Nettoladung positiv). Die YidC-Membran-Insertase spielt eine wichtige Rolle in der Assemblierung Energietransduzierender Membranproteine. So ist z.b. die Insertion der F O Untereinheit c (F O c) der ATP- Synthase vom YidC-only Pathway abhängig, wodurch YidC einen Einfluss auf die Aktivität der ATP- Synthase hat. Ebenso hat YidC Einfluss auf die Aktivität der Cytochrom bo 3 Oxidase durch Insertion der Untereinheit II (CyoA).

81 Im Falle von CyoA insertiert die N-terminale Region mithilfe des YidC-only Pathways und die C-terminale Region mithilfe des SecYEF- SecA-Pathways in die Zytoplasmamembran. CyoA wird als Vorläuferform synthetisiert (precyoa). Das precyoa-targeting zur Membran erfordert den SRP-Pathway. Es folgt die YidCabhängige Insertion des N-Terminus. Danach wird das Protein durch die Signal Peptidase II (entfernt proteolytisch Lipoprotein- Signalsequenzen) gespalten und durch das Anfügen einer Lipidgruppe zum reifen CyoA Lipoprotein modifiziert. Der C-terminale Rest wird durch SecA in die Membran inseriert. YidC-vermittelte Erkennung und Insertion Das Targeting naszierender Polypeptidketten zu YidC im YidC-only Pathway könnte durch einen SRP/YidC Pathway stattfinden. Eine weitere Möglichkeit ist die direkte Bindung zytosolischer Substrate ohne Targeting-Faktoren. Die Erkennung involviert die zytoplasmatisch zugängliche hydrophile Region von YidC. Beim Einbau von F O c spielen dabei direkte elektrostatische Interaktionen zwischen positiv geladenem F O c Loop und negativ geladenen YidC-Loop eine Rolle. Die Freisetzung der Membranproteine könnte auch direkt mit der Oligomerisierung zum funktionalen Membrankomplex verbunden sein. So bleibt YidC solange an F O c gebunden, bis der ATP-Synthase Komplex vollständig assembliert ist. Faltung von Membranproteinen Polytopische Membranproteine müssen nach der Insertion in die Membran ihre funktionale dreidimensionale Struktur erhalten. Dies wird durch die Interaktion zwischen den α-helikalen TM- Segmenten erreicht, die sich in einem Bündel zusammenlagern. Zusätzlich müssen die zytosolischen und extrazytoplasmatischen Loops korrekt falten. YidC hat eine entscheidende Rolle bei der Faltung des Zuckertransporters LacY, der die Membran 12mal durchspannt. YidC-Defizienz stört nicht die Sec-abhängige Membraninsertion des Transporters, resultiert aber dafür in einer defekten Konformation. Daher wird angenommen, dass YidC als Assemblierungsstelle für TM-Regionen fungieren kann. Der Defekt in der LacY-Konformation könnte durch die unvollständige Insertion eines TM-Segments kommen, was zu einer inkorrekten Membrantopologie führt. Assemblierung von Membranprotein-Komplexen Nach der Membraninsertion müssen die Untereinheiten in ihrer korrekten oligomeren Struktur assemblieren. YidC spielt bei der Assemblierung des ATP-Synthase Komplexes eine essentielle Rolle. Die Insertion der F O c Untereinheit erfolgt über den YidC-only Pathway. F O a und F O b insertieren über den Sec-Pathway und benötigen YidC für eine effiziente Membraninsertion. Für eine korrekte Assemblierung der F1Fo ATPase muss sich zunächst der Oligomer aus der Untereinheit c bilden,

82 bevor die restlichen Fo Komponenten (a und b) assemblieren können. Zuletzt wird der gesamte Komplex durch Anlagerung des Fo Subkomplexes an den F1 Subkomplex (α, β, γ, δ und ε) gebildet. Die Tetramere Cytochrom bo3 Oxidase aus E.coli assembliert in einer bestimmten Reihenfolge (erst Dimer aus III-IV, dann I, dann II). Die Insertion des Häm b Cofaktors beschleunigt die Assemblierung der Untereinheit I mit den anderen Untereinheiten. YidC ist verantwortlich für die Insertion der Untereinheit II (CyoA). Topologie der Membranproteine Es gibt verschiedene Signale, welche die Topologie der Membranproteine determinieren. Diese wurden bereits in den vorangehenden Abschnitten an Beispielen erläutert. Darunter zählen u.a. N- terminale, spaltbare Signalsequenzen, positive Ladungen und interne nicht-spaltbare Signal- Ankersequenzen. Siehe nächste Tabelle.

83 Assemblierung von β-barrel Proteinen in die bakterielle äußere Membran Der erste Schritt in diesem Prozess ist der Transport des β-barrel Proteins über die zytoplasmatische Membran in den Periplasmatischen Raum durch die Sec-Maschinerie. β-barrel Proteine werden mit einem spaltbaren Signalpeptid synthetisiert, das für den Export essentiell ist und hiernach durch die Signal-Peptidase proteolytisch entfernt wird. Die homologen Proteine Omp85 (Bakterien), Tob55 (Mitochondrien) und Toc75 (Chloroplasten) sind für die Assemblierung von β-barrel Proteinen innerhalb der äußeren mitochondrialen Membran sowie für die Translokation durch die plastidäre äußere Membran aus dem Zytoplasma entscheidend. Die Proteine der Omp85 Superfamilie besitzen eine POTRA-Domäne (polypeptidetransported-associated), die periplasmatisch lokalisiert ist und die Bindung der Peptidsequenzen aus β-barrel Proteinen ermöglicht. YfgL ist ein Lipoprotein der äußeren Membran, das einen Komplex mit dem Omp85 Homolog YaeT und den Lipoproteinen der äußeren Membran YfiO, NlpB und SmpA bildet. Dieser Komplex unterstützt die Faltung uns Assemblierung der β-barrel Proteine. Qualitätskontrollsysteme für Membranprotein-Faltungen Auch für Membranproteine existieren Qualitätskontrollen, die sicher stellen, dass diese korrekt assembliert und gefaltet sind. Im Falle von Fehlfaltung oder Fehlassemblierung können Chaperone und Proteasen induziert werden. YidC-Defizienz, was Fehlfaltungen von Membranproteinen auslöst, induziert den σ-stress-response Pathway. FtsH ist in die Degradation von Foa und SecY involviert, wenn sie ohne ihre Partnerproteine vorliegen. Zusätzlich haben die Membran-Proteasen YaeL, HtpX und GlpG Qualitätskontroll- Funktionen. Sie können innerhalb der TM-Segmente spalten.

84 Targeting und Translokation von Proteinen Zellkern, Mitochondrien, Chloroplasten, Peroxisomen, Endomembransystem Das Endomembransystem (exklusive ER) Die Untersuchung der RER Funktionen begann an sekretorischen Zellen, wie Drüsenzellen des Pankreas und Schleim-sezernierenden Zellen des Verdauungstrakts. Diese Epithelzellen weisen eine Polarität auf. Die Organellen des sekretorischen Pathways sind in der richtigen Reihenfolge angeordnet: Der Kern und die RER sind an der basalen Oberfläche der Zelle (in Kontakt mit dem Blut) lokalisiert. Der Golgi Komplex ist im Zentrum der Zelle lokalisiert. Die apikale Oberfläche der Zelle befindet sich an einem Duktus, der die sekretorischen Proteine aus dem Organ heraus

85 transportiert. Das Zytoplasma am apikalen Ende der Zelle ist mit sekretorischen Granula gefüllt, deren Inhalt nach Eingang des spezifischen Stimulus sezerniert wird. Chronologisch nach dem ER gelangen Proteine auf verschiedenen Pathways durchs Endomembransystem. Als Endomembransystem wird die Gesamtheit von ER, Golgi Apparat, Endosomen, Lysosomen und Vakuolen bezeichnet. Mitochondrien, Chloroplasten und Peroxisomen gehören nicht zu diesem System. Das Endomembransystem und die Pathways innerhalb der Zelle Die einzelnen Kompartimente der Zelle haben unterschiedliche Proteinkomponenten und sind daher auf unterschiedliche Aktivitäten spezialisiert. Dennoch handelt es sich um dynamische Kompartimente, die in einem kontinuierlichen Fluss stehen. Es handelt sich um ein integriertes Netzwerk, in dem Materialien zurück und vor transportiert werden. Am häufigsten transportiert werden Materialien zwischen Organellen in Membran-gebundenen Transportvesikeln, die von einem Donor-Membran-Kompartiment abgeschnürt werden. Transportvesikel bewegen sich im Zytoplasma gerichtet. Sie sind oft an Motorproteine gekoppelt, die entlang bestimmter Zytoskelett-Elemente wandern. Wenn die Vesikel ihren Zielort erreichen, verschmelzen sie mit dem Akzeptor-Membran-Kompartiment. Zahlreiche Zytoplasma-Pathways wurden identifiziert: im biosynthetischen Pathway werden Proteine im ER synthetisiert, im Golgi modifiziert und anschließend zum Zielkompartiment (Plasmamembran, Lysosom, Vakuole) transportiert. Als sekretorischer Pathway wird dieser bezeichnet, wenn die Proteine nach ihrer Modifikation sezerniert werden. Sekretorische Aktivitäten von Zellen können in zwei Typen unterteilt werden: konstitutive und regulierte Sekretion. Konstitutive Sekretion: Material wird in sekretorischen Vesikel vom Ort ihrer Synthese in die extrazelluläre Matrix transportiert. Sie dient dem Aufbau der extrazellulären Matrix und zum Wachstum der Plasmamembran. Spezialisierte Zellen wie die Pankreas Drüßenzellen enthalten sehr viel RER und Golgi. In Hepatozyten werden 70% aller Proteine sezerniert (z.b. Albumin, Transferrin). Nicht-spezialisierte Zellen sezernieren etwa 5% aller Proteine (Kollagene, Proteoglykane, Fibronektin). Regulative Sekretion: Material wird in Membran-gebundenen sekretorische Granula gespeichert und erst als Antwort eines Stimulus sezerniert. Dieser Sekretionstyp findet z.b.

86 in Endokrinen Zellen (Hormone), in Pankreaszellen (Verdauungsenzyme), in Nervenzellen (Neurotransmitter), in Plasmazellen (Antikörper) und in Leberzellen (Blutserumproteine) statt. Im biosynthetischen oder sekretorischen Pathway können Proteine, Lipide und komplexe Polysaccharide transportiert werden. Man unterscheidet zwischen Transport von löslichen Proteinen, die sezerniert werden, von integralen Membran-Proteinen und von löslichen Proteinen, die ein bestimmtes Kompartiment als Zielort haben. Der endozytotische Pathway sorgt für den Transport von der Zelloberfläche zu bestimmten Zellkompartimenten, wie Endosomen und Lysosomen innerhalb des Zytoplasmas. Es handelt sich um die Umkehrung des sekretorischen Pathways. Um den Transport eines bestimmten Proteins zum gewünschten Zielort zu ermöglichen ist ein dem Zielort spezifisches Targeting notwendig. Diese "sorting signals" befinden sich innerhalb der AS- Sequenz oder in Form von angehängten Oligosacchariden. Die sorting-signals werden durch spezifische Rezeptoren innerhalb der sich abschnürenden ("budding") Vesikel erkannt. Der Golgi Apparat Vom ER zum Golgi Apparat Dadurch, dass die Zisternen des RER miteinander verknüpft sind, können die luminalen Proteine zu Bereichen diffundieren, von denen aus sie das ER in den ersten Vesikeln des biosynthetischen Pathways verlassen können. Diese Bereiche sind frei von Ribosomen. Nachdem die Vesikel von der ER Membran abgeschnürt wurden, fusionieren einzelne Transportvesikel miteinander und formen größere Vesikel und verbundene Tubuli in der Region zwischen ER und Golgi Apparat (Beobachtung mittels GFP-Kopplung). Diese Region wird ERGIC (endoplasmic reticulum Golgi Intermediate compartment) und die vesikulär-tubulären Cluster werden VTCs genannt. Die VTCs wandern (evtl. entlang von Mikrotubuli) zum Golgi Apparat.

87 Struktur des Golgi-Apparats Der Golgi-Komplex besteht aus abgeflachten, Disk-ähnlichen Membran-Zisternen mit ausgedehnten Seiten und assoziierten Vesikeln und Tubuli. Die einzelnen Zisternen mit Durchmessern von 0,5 bis 1 μm sind in einem geordneten Stapel sortiert. Ein Golgi-Stapel beinhaltet typischerweise weniger als 8 Zisternen. Die Gesamtheit aller Golgi-Stapel einer Zelle wird als Golgi-Apparat bezeichnet. Die Golgi- Stapel in Mammalia Zellen sind über Membran-Tubuli zu einem großen Golgi-Komplex miteinander verknüpft und in der Nähe des Zellkerns lokalisiert Der Golgi-Stapel ist in funktional verschiedene Bereiche gegliedert: die cis-zisternen stellen den Eingang für die Vesikel dar und sind auf der Seite des Zellkerns lokalisiert, während sich die trans- Zisternen auf der gegenüberliegenden Seite befinden, wo die Vesikel den Stapel verlassen. Zwischen diesen Ein- und Ausgängen liegen die medialen Zisternen. Vor der cis-zisterne liegt ein Netzwerk aus Tubuli (CGN: cis Golgi Network), welches eine Sortierungsfunktion inne hat: CGN differenziert zwischen Proteinen, die zur nächsten Golgi-Station dürfen und Proteinen, die zurück zum ER müssen. Hinter der trans-zisterne liegt ein Netzwerk aus Tubuli und Vesikel (TGN: trans Golgi Network). Auch hier handelt es sich um eine Sortier-Station. Je nachdem wo die Proteine hin sollen, werden sie in unterschiedliche Vesikel verpackt, die entweder zur Periplasma-Membran oder zu anderen intrazellulären Zielorten wandern. Der Golgi-Komplex ist stark mit dem Zytoskelett assoziiert, um die einzelnen Bereiche mechanisch zusammenzuhalten und die budding Vesikel an ihre Zielorte zu dirigieren. Während die Proteine, welche vom ER stammen, durch die einzelnen Golgi-Zisternen wandern, werden sie schrittweise modifiziert. Glykosylierung Die ankommenden Glykoproteine haben bereits ihre Glukose-Reste während der Qualitätskontrolle im ER verloren. Während der Prozessierung in der cis- und den medialen Zisternen des Golgi-Stapels werden die meisten der Mannose Reste des Kern-Oligosaccharids ebenso entfernt, wobei andere Zucker sequentiell durch unterschiedliche Glykosyltransferasen hinzugefügt werden. Im Golgi- Apparat werden Oligosaccharid-Ketten produziert, die sich im Gegensatz zum Kernoligosaccharid des ERs bezüglich ihrer Sequenz erheblich unterscheiden können. Es können auch andere Monosaccharide und O-Verknüpfungen eingebaut werden. Die einzelnen Reaktionen kommen in der Reihenfolge aufgrund unterschiedlichen Enzymbesatzes der Golgi-Zisternen zustande. (1) Im cis-golgi: a. Entfernung von 3 Mannose-Resten. (2) Im medialen Golgie: a. Anfügen von einem N-Acetylglucosamin-Rest. b. Entfernung von 2 Mannose-Resten. c. Anfügen von 2 N-Acetylglucosamin-Resten. d. Anfügen von einem Fucose-Rest. (3) Im trans Golgi: a. Anfügen von 3 Galaktose-Resten b. Anfügen von 3 N-Acetylneuraminsäure-Resten

88 Der Golgi-Apparat ist ebenso Ort der Synthese der meisten komplexen Polysaccharide (z.b. Glycosamino-Glykanketten des Proteoglycans = wichtiger Bestandteil der extrazellulären Matrix, sowie Pektine und Hemicellulose der pflanzlichen Zellwand). Die Bewegung von Material entlang der Zisternen Im Cisternal maturation model bildet sich die Zisterne am cis-ende aus der Fusion zwischen membranösen Carriern aus ERGIC und ER. Anschließend wandert diese physikalisch vom cis-ende zum trans-ende des Stapels, wobei sich ihre Zusammensetzung während des Prozesses ständig verändert. Dieses Modell wurde bis in die 80er Jahre allgemein anerkannt. Im Vesicular transport model bleiben die Zisternen des Stapels als Stapel -Kompartimente an ihren Plätzen, wobei die Cargo-Moleküle (sekretorische, lysosomale und Membran-Proteine) durch den Golgi-Stapel, vom CGN zum TGN transportiert werden. Der Transport findet über Vesikel statt, die sich von der einen Zisterne abschnüren und mit der nächsten fusionieren. Dieses Model wurde als korrekt anerkannt bis in die Mitte der 90er Jahre. Zwei Beobachtungen unterstützten dieses Modell: Jede der verschiedenen Zisternen hat eine spezifische Enzymzusammensetzung: Im cis Bereich befindet sich reduziertes Osmium-Tetroxid. Mannosidase II (entfernt Mannose Reste aus Glykoproteinen) befindet sich in medialen Zisternen. In trans Zisternen befindet sich präferentiell das Enzym Nukleosid-Diphosphatase (spaltet z.b. UDP, nachdem es seinen Zucker abgegeben haben). Eine Vielzahl von Vesikeln können im Elektronenmikroskop an den Rändern der Zisternen während des Abschnürens beobachtet werden. Die Abschnürung und die Fusion mit der nächsten Zisterne konnten mittels Zellfrei-Systemen nachgewiesen werden. Aktuell wird das cisternal maturation model wieder zur Erklärung in Betracht gezogen. Ursache sind folgende Entdeckungen: Einige Materialien, die im ER produziert werden und durch den Golgi-Komplex wandern, können in den Zisternen nachgewiesen werden, tauchen aber niemals in Golgi-assoziierten Vesikeln auf (Studien an Fibroblasten: komplexe Prokollagen- Moleküle wandern von cis nach trans, ohne in Vesikeln aufzutauchen). Es wurde nachgewiesen, dass Transportvesikel nicht nur anterograd (also vorwärts, von cis nach trans), sondern auch retrograd (rückwärts) wandern können. Trans-Membranen können also auch Donor sein. Heute anerkannt wird ein Fusionsmodell aus den zwei beschriebenen: Die Zisternen bewegen sich von cis nach trans, wobei Vesikel retrograd zwischen den Zisternen wandern (intra-golgi Transport). Dieses Modell wird durch folgendes Experiment gestützt: Ultradünnschnitte von kultivierten Zellen eines gefrorenen Blocks wurden mit Antikörper, die mit Goldpartikeln verknüpft wurden, behandelt. Der Antikörper bindet an ein Cargo-Protein (in diesem Fall VSVG). Als deutliche schwarze Punkte in der elektronenmikroskopischen Aufnahme sind die Cargo- Proteine lediglich innerhalb der Zisternen, aber nicht in den Vesikeln zu sehen. Ein im Golgi-Apparat residentes Enzym (Mannosidase II) wurde ebenso behandelt und wurde innerhalb der Zisternen und in den Vesikeln gefunden. Dies stützt die These, dass die Vesikel

89 für den retrograden Transport von Golgi-Enzymen zuständig sind. So kann Mannosidase II für die nächsten medialen Zisternen recycelt werden. Vesikel-Transport-Typen und ihre Funktionen Material wird zwischen den einzelnen Kompartimenten, die für die Modifikation im Laufe des biosynthetischen Pathways zuständig sind, mittels Membranvesikeln transportiert. Sie messen nm im Durchmesser und entstehen durch Abschnürung aus einer Donor-Membran. Am Zielort fusionieren sie mit der Akzeptor-Membran. Die Oberfläche der Vesikel ist mit löslichen Proteinen besetzt, die eine Protein-Hülle (protein-coat) bilden. Die Assemblierung findet an den Stellen der zytosolischen Seite der Membran statt, an der die Abschnürung beginnt. Jeder coated bud formiert sich zu einem coated vesicle. Protein-Hüllen haben zwei Funktionen: Sie fungiert als mechanische Einheit, welche die Membran krümmt und es somit dem Vesikel ermöglicht sich abzuschnüren. Sie ermöglichen selektive Mechanismen (1) sekretorische, lysosomale und Membran- Proteine müssen transportiert werden (2) es muss mit der richtigen Akzeptor-Membran fusioniert werden.

90 Die unterschiedlichen Vesikel-Typen unterscheiden sich in Protein-Hülle, in der Rolle im Zell- Trafficking sowie in der Erscheinung unter dem Elektronenmikroskop. Die drei beststudierten Vesikel-Typen sind die Folgenden: COPII coated Vesikel: transportieren Material anterograd vom ER zu ERGIC und Golgi Komplex (COP ist Akronym für coat proteins). COPI coated Vesikel: transportieren Material retrograd vom ERGIC und Golgi Komplex zum ER und vom trans Golgi zum cis Golgi. Clathrin coated Vesikel: transportiert Material vom TGN zu Endosomen, Lysosomen und Vakuolen, sowie Material von der Plasmamembran zu cytoplasmatischen Kompartimenten entlang des endozytotischen Pathways. Außerdem sind sie im Trafficking zwischen Lysosomen und Endosomen involviert. COPII coated Vesikel transportieren Proteine vom ER zum Golgi Einige integrale Membran-Proteine des ER werden selektiv in das Vesikel eingelagert, weil sie ER-Export-Signalsequenzen an ihren zytosolischen Schwänzen aufweisen. Diese Signal-Sequenzen interagieren mit den COPII Proteinen der Vesikel-Hülle. Proteine, die von COPII coated Vesikel selektiv aufgenommen werden sind: Membran-Proteine (Enzyme), welche in späteren Schritten des biosynthetischen Pathways Funktionen haben (z.b. Glykosyltransferasen). Membran-Proteine, die an dem Andocken und der Fusion des Vesikels an die Akzeptor- Membran beteiligt sind. Membran-Proteine (Rezeptoren), die in der Lage sind lösliche Cargo- Moleküle an Bindestellen, die ins Lumen ragen zu binden (z.b. sekretorische Proteine). Zwischen den COPII Hüllproteinen und der äußeren Membran befindet sich Sar1, ein kleines GTP-bindendes Protein. Es reguliert die Assemblierung und Disassemblierung der Proteinhülle. Wenn GTP an Sar1 bindet, resultiert eine Konforamtions-Änderung, wodurch die N-terminale α-helix an die zytosolische Seite der ER- Membran andockt. Membrangebundenes Sar1-GTP induziert die Rekrutierung anderer Proteine der COPII Hülle, um ein coated bud und schließlich ein coated vesicle zu bilden. Eines der COPII Hüllproteine (Sec24p) liegt in mindestens vier verschiedenen Isoformen vor. Jede Isoform kann Membran-Proteine mit einem anderen Sortierungs-Signal erkennen und binden. Dadurch wird die Spezifität gegenüber dem Material, das durch COPII Vesikel transportiert werden

91 kann ausgedehnt. COPII beinhaltet insgesamt 5 Proteine: Sar1 und die heterodimeren Proteinkomplexe Sec23/24 und Sec13/31. Bevor das Vesikel mit der Zielmembran fusionieren kann, muss die Proteinhülle Disassemblieren. Dies wird durch Hydrolyse von GTP eingeleitet, wodurch Sar1-GDP entsteht, das eine geringere Affinität zur Vesikel-Membran aufweist. Die Dissoziation von Sar1-GDP führt zur Freisetzung der COPII Untereinheiten ins Zytosol. Sollten ER-residente Proteine zufällig innerhalb des Vesikels landen und transportiert werden, werden sie später im Pathway aussortiert und zurück transportiert. COPI coated Vesikel transportieren Proteine zurück zum ER Die Protein-Hülle enthält ebenso ein GTP-bindendes Protein, ARF1, dessen gebundenes GTP hydrolysiert werden muss, bevor eine Disassemblierung der Hülle stattfinden kann (COPI können durch Gradient-Zentrifugation aus Zellen isoliert werden, die zuvor mit GTP-ähnlichen Substanzen behandelt wurden, welche aber nicht hydrolysiert werden können). Der Coatamer-Proteinkomplex aus sieben Proteinuntereinheiten umhüllt COPI und spielt eine wichtige Rolle bei der Vesikel- Abschnürung. COPI coated Vesikel sind beteiligt am Transport von Golgi-residenten Enzymen in trans cis Richtung und von ER-residenten Enzymen vom ERGIC und dem Golgi Komplex zurück zum ER. Halten und Zurückholen von ER residenten Proteinen Proteine werden durch zwei Mechanismen in der Ziel-Organelle gehalten, obwohl sich ständig neue Vesikel abschnüren: (1) die in der Organelle residenten Moleküle werden nicht in die sich abschnürenden Vesikel eingebaut (2) die verloren gegangenen Moleküle werden zurück zur Organelle transportiert. Proteine, welche im ER (Membran oder Lumen) lokalisiert sind, tragen kurze C-terminale Retrieval- Signalsequenzen. Falls sie einmal zufällig zum ERGIC oder Golgi transportiert werden, können sie somit von speziellen Rezeptoren erkannt und in COPI Vesikeln zurücktransportiert werden. ER luminale Proteine tragen typischerweise die Retrieval-Sequenz KDEL. Diese Sequenz wird durch den

92 KDEL-Rezeptor (integrales Membran-Protein) erkannt, der zwischen cis Golgi und ER schuttelt. ER Membran-Proteine haben die Retrieval-Sequenz KKXX, welche direkt an COPI bindet, und somit den Rücktransport ermöglicht (Die Oberfläche des cis Golgi ist also mit COPI übersät, während im ER COPII überwiegt). Proteinsortierung im TGN und Exozytose Um die unterschiedlichen Ziele der einzelnen Proteine auch tatsächlich zu erreichen, werden sie im TGN in verschiedene Membran-gebundene Carrier einsortiert. Sortierung und Transport von lysosomalen Enzymen lysosomale Enzyme werden am RER synthetisiert und im Golgi von spezifischen Enzymen erkannt, die jene an zwei Mannose-Einheiten des N-verknüpften Oligosaccharids phosphorylieren (Anhängen von phosphoryliertem N-Acetylglucosamin aus UDP-NAG, wodurch UMP frei wird und anschließendes Abspalten von NAG). Diese phosphorylierten Mannose-Reste fungieren als Erkennungssignale: Mannose-6-phosphat wird von integralen Membran-Proteinen des TGN, den Mannose-6-phosphat Rezeptoren (MPRs) erkannt. MPRs befinden sich auch innerhalb der Plasmamembran, um extrazelluläre lysosomale Proteine zurückzuholen und in ihren eigentlichen Pathway zu bringen. Lysosomale Enzyme werden in Clathrin-coated Vesikel transportiert. Diese Hülle weist ein äußeres Netzwerk aus dem Molekül Clathrin und eine innere Schale aus Protein-Adaptoren, welche die Membran-Oberfläche bedecken auf. Adaptor-Moleküle verknüpfen zwei verschiedene Materialtypen physikalisch miteinander. Die Adaptor-Protein-Familie GGA (Golgi-localising γ-adaptin ear domain homology ARF-binding protein) sorgt für die Eskorte lysosomaler Enzyme aus dem TGN. GGA hat 4 wichtige Domänen: (1) Die äußere Domäne bindet die Clathrin Moleküle. (2) Die innere bindet ein Sorting-Signal der zytosolischen Schwänze der MPRs. Die MPRs binden wiederum an lösliche lysosomale Enzyme innerhalb des Vesikel-Lumens. (3) Die zytosolischen Schwänze einiger Membran-Proteine, die im Clathrin coated Vesikel mit transportiert werden sollen, binden an eine andere Domäne von GGA. (4) Die Bildung von Clathrin-coated Vesikel beginnt mit der Rekrutierung von ARF1-GTP an die äußere Membran. ARF1-GTP bindet an eine mittlere Domäne von GGA. Wenn ARF1 nicht vorhanden ist, fehlt auch GGA. Es kommt somit nicht zur Bildung der Vesikel.

93 Wenn das Vesikel vollständig abgeschnürt ist, verliert es die Clathrin-Hülle und wandert als Uncoated Vesikel zum Zielort: einem frühen Endosom, einem späten Endosom oder einer Vakuole. Vor dem Erreichen jener Organellen werden die MPRs zurück zum TGN transportiert und somit recycelt. Sortierung und Transport von nichtlysosomalen Enzymen Membran-Proteine der Plasmamembran und sekretorisches Material werden ebenso vom TGN in Vesikel und sekretorische Granula einsortiert. Es wurde bisher keine Protein-Hülle für diese Vesikel nachgewiesen. Für die sekretorischen Granula wird angenommen, dass sich (nach dem maturation model) das trans-golgi zum TGN wandelt, das sich nun auflösen muss, um dem nächsten TGN Platz zu machen. Somit schnüren sich Vesikel vom TGN ab und wandern weg. Die Vesikel, welche sekretorische Proteine enthalten verdichten sich spezifisch zu Granula. Diese verschmelzen erst mit der Plasmamembran, wenn ein Hormon oder Nervenimpuls das Signal dazu gibt. Die Auslieferung von integralen Membran-Proteinen der Plasmamembran basiert hauptsächlich auf die Sorting-Signale in den zytoplasmatischen Domänen der Proteine selbst. Die integralen Membran-Proteine auf der apikalen Seite einer polarisierten Zelle haben andere Sorting-Signale als solche auf der basalen Seite. Am TGN bilden sich Lipid-Rafts aus Membran-Proteinen, die zum apikalen Ende transportiert werden sollen. Unpolare Zellen brauchen keine speziellen Sorting- Signale für Plasmamembranproteine. Solche Proteine werden vom TGN automatisch in Vesikeln des konstitutiven sekretorischen Pathways mitgetragen. Exozytose Die Fusion eines sekretorischen Vesikels (sekretorisches Granula) mit der Plasmamembran wird als Exozytose bezeichnet. Die regulierte Exozytose ist sehr viel seltener, als die konstitutive Verschmelzung von Vesikeln mit der Membran. Am besten wurde die regulierte Exocytose bei der Bildung von synaptischen Vesikeln untersucht. Ein Nervenimpuls führt zu einem Calcium-Einstrom, der die Exozytose von Neurotransmittern in den Synaptischen Spalt auslöst. Die Fusion wird reguliert durch Ca 2+ -Bindeproteine (Synaptotagmin; hat Rab-Bindedomäne), das sich in der Vesikel- Membran befindet. In anderen Zellen wird die Exozytose durch die Freisetzung von Calcium aus cytoplasmatischen Speichern reguliert.

94 Targeting der Vesikel zu einem bestimmten Kompartiment Über selektive Fusionsprozesse gelangen einzelnen Vesikeln an ihren Bestimmungsort. Diese werden durch verschiedene Proteine innerhalb der Vesikel- und der Target-Membran ermöglicht. Die Bewegung des Vesikels zum spezifischen Zielort wird durch Mikrotubuli ermöglicht. Tethering Die Vesikel werden am Zielort vom Zielkompartiment mittels ausgedehnten fibrilären Proteinen eingefangen (Tethering der Vesikel). Die Spezifität des Tetherings wird durch die Membranassoziieren G-Proteinen der Rab-Familie (mehr als 60 verschiedene Gene) gewährleistet. Verschiedene Rab-Moleküle sind mit verschiedenen Membran-Kompartimenten assoziiert. In ihrem GTP-Zustand können sie ein oder mehrere zytosolische Tethering-Proteine rekrutieren, die zwischen Rab auf der Target-Membran und Rab auf der Vesikel-Membran vermitteln. Docking Durch das Tethering kommen die Membranen in direkten Kontakt, wodurch bestimmte integrale Membran-Proteine beider Membranen miteinander interagieren können. Diese Proteine heißen SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide attachment protein receptor; konstitutionelle Familie aus 35 Membran-Proteinen, jeweils spezifisch für ein Subzelluläres Kompartiment) und unterscheiden sich erheblich in Größe und Struktur. Sie haben jedoch alle ein gemeinsames Motiv (SNARE Motiv) aus AS, das eine "coiled coil" Struktur mit einem anderen SNARE Motiv eingehen kann. Man unterscheidet zwischen v-snares (in Vesikeln) und t-snares (in Target-Membran). Wenn die Membranen dicht beieinander liegen interagieren jeweils zwei v-snares (Synaptobrevin hat ein SNARE-Motiv) mit zwei t-snares (Syntaxin hat eine Transmembran-Domäne und ein SNARE-Motiv, SNAP25 ist ein peripheres Membran-Protein ohne Transmembran-Domäne und hat zwei SNARE- Motive; Je nachdem welche SNAREs interagieren, wird ein anderes Motiv zur Wechselwirkung genutzt). Es bildet sich somit ein viersträngig-α-helikales coiled coil, das die Membranen noch dichter zueinander bringt. Die genannten SNARE Typen treten in synaptischen Vesikeln bzw. der postsynaptischen Membran auf, wo dieser Vorgang am besten untersucht ist. Das Botulismus-Toxin und das Tetanus-Toxin wirken als Proteasen, die spezifisch SNAREs abbauen und damit die Freisetzung von Neurotransmittern verhindern. Fusion Eine Interaktion zwischen v-snare und t-snare ermöglicht die Fusion der beiden Membranen (es können nicht dieselben SNARE Typen miteinander fusionieren). Für die Fusion werden zwei viersträngige coiled-coils benötigt, von denen eine nach rechts und eine nach links zeigt. Bei der Fusion selbst werden beide Membranen an den Stellen der integralen SNAREs (2 pro Membran) auseinandergerissen. Ein integrales SNARE der einen Membran interagiert mit dem integralen SNARE der anderen Membran, wodurch sich die Enden zusammensetzen. Im Übergangszustand bildet sich eine kleine Fusionspore, die sich schnell erweitert, wodurch die zuvor gegenüberliegenden integralen SNAREs zusammen finden. Die zwei viersträngigen SNARE-Komplexe werden durch die AAA- ATPase NSF über ATP-Hydrolyse aufgelöst. Neuere Forschung (2008) zeigt, dass die ATPase-Funktion von NSF doch nicht beim Auflösen der SNARE-Komplexe, sondern beim Fusionsprozess selbst eine Rolle spielt.

95 Das Molekül Komplexin verhindert die Fusion beider Membranen, sorgt aber dafür, dass das Vesikel im Docking-Zustand stabilisiert wird. Erst nach einem Calcium Einstrom wird die Fusion induziert. Lysosomen und Vakuolen Lysosomen (25nm bis 1μm im Durchmesser) sind Verdauungsorganellen in tierischen Zellen, die ca. 50 verschiedene hydrolytische Enzyme enthalten. Es handelt sich immer um saure Hydrolasen, die ihr ph-optimum im sauren Bereich haben (ph im Lysosom ist 4,6). Der saure ph-wert wird durch eine Membran-ständige Protonenpumpe (H + -ATPase) aufrecht erhalten. Lysosomale Membranen haben eine Vielzahl von glykosylierten integralen Membran-Proteinen, dessen KH-Ketten einen Schutzmantel für die Membran vor den Hydrolasen darstellen. Lysosomen haben drei Funktionen: (1) Das Zerkleinern von endozytiertem Material. Die zerkleinerten Fragmente diffundieren anschließend durch die lysosomale Membran ins Zytosol. (2) Inaktivieren und Verdauen von Bakterien. (3) Während der Autophagie wird eine Organelle von einer Doppelmembran umhüllt. Diese fusioniert nun mit einem Lysosomen, wodurch ein Autophagolysosom entsteht. Wenn eine Zelle wenige Baustoffe hat, ist eine erhöhte Autophagie-Rate notwendig, um das Leben der Zelle aufrechtzuerhalten. Ist der Verdau der Organelle abgeschlossen, liegt ein Rest- Körperchen (Residual Body) vor. Entweder er wird exozytiert oder ins Zytoplasma als Lipofuscin Granula eingelagert. Die Konzentration an Lipofuscin Granula innerhalb einer Zelle steigt mit dem Zellalter. Krankheiten im Zusammenhang mit Defekten der lysosomalen Funktion Alle Krankheiten, die zu einer Akkumulation von Unverdautem Material führen werden als lysosomale Speicherkrankheiten bezeichnet (über 40 bisher entdeckt). Sie können pränatal diagnostiziert werden. I-cell Disease: unverdautes Material akkumuliert innerhalb der Lysosomen, weil keine Hydrolasen vorhanden sind. Jene werden normal synthetisiert, aber ins Medium sezerniert, anstatt zu den Lysosomen transportiert zu werden. Es wurde herausgefunden, dass die Mannose-Phoshpat Reste fehlten, woraufhin festgestellt wurde, dass der I-cell-Defekt aufgrund einer N-Acetylglucosamin Phospho-Transferase Defizienz zustande kommt.

96 Pompe-Disease: Durch das Fehlen der α-glukosidase in den Lysosomen kommt es zur Akkumulation von Glykogen und zum Anschwellen der Lysosomen, was die Zelle irreversibel schädigt. Tay-Sachs Disease: Durch eine β-n-hexosaminidase A Defizienz, kann das Gangliosid GM2 nicht mehr degradiert werden. Dieses Gangliosid ist eine Hauptkomponente in Membranen von Gehirnzellen. Gauchers Disease: Akkumulation von Glukocerebroside in Lysosomen der Makrophagen, wodurch sich die Milz vergrößert und Anämie resultiert. Eine enzyme-replacement therapy wurde angesetzt: bekommen Patienten das fehlende Enzym gespritzt, wird es nur von der Leber aufgenommen, die nicht von der Krankheit betroffen ist. Erst nachdem das Enzym in ihrer Oligosaccharid-Sequenz modifiziert wurde, konnte es von den Makrophagen durch Mannose-Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen werden. Auch andere lysosomale Speicherkrankheiten konnten so geheilt werden (Ausnahme: solche, die sich auf das Nervensystem auswirken; Grund: Blut-Hirn-Schranke) Fabry-Disease: ein Defekt der α-galaktosidase A bewirkt eine Akkumulation von einigen Glykosphingolipiden und führt zu Herzkrankheiten. Durch Behandlung mit Galaktose verbessert sich der Zustand des Herzens. Der therapeutische Effekt erklärt sich wie folgt: Galaktose ist ein kompetetiver Inhibitor des Enzyms und kann das mutierte Enzym im gefalteten Zustand halten, indem es ans aktive Zentrum bindet. Dadurch wird es im ER nicht zerstört und gelangt ins Lysosom, wo es seine enzymatische Aktivität zurück erlangt. Diese Strategie kann auch bei Krankheiten, die sich auf das Nervensystem auswirken angewandt werden, da Liganden meist klein sind und die Blut- Hirn-Schranke passieren können. Zellvakuolen 90% des Volumens von vielen Pflanzenzellen wird von einer einzigen Membran-umhüllten, fluidgefüllten Vakuole ausgefüllt. Pflanzliche Vakuolen haben ein breites Spektrum an Funktionen: (1) Temporäre Speicherung von gelösten Stoffen und Makromolekülen. (2) Speicherung von toxischen Verbindungen (z.b. Cyanid-haltige Glykoside und Glukosinolate) als Abwehrmechanismus gegen Fressfeinde (werden bei Verwundung freigesetzt). (3) Pflanzliche Zellen haben keine Sekretionssysteme, weshalb sie toxische Verbindungen, die als Nebenprodukte im Metabolismus anfallen, in ihren Vakuolen vom Rest der Zelle isolieren. (4) Der Tonoplast beinhaltet viele aktive Ionen-Transporter, welche die Ionenkonzentration im Innenraum hoch hält. Dadurch strömt Wasser in die Vakuole (Osmose). Dadurch entsteht ein Turgor, welche die Zellwand während ihres Wachstums streckt. (5) Vakuolen weisen dieselben sauren Hydrolasen auf, wie sie in Lysosomen vorkommen. Der ph Wert im Innern wird durch eine V-Typ H + -ATPase aufrecht gehalten. Die Verdauungsenzyme werden genauso transportiert, wie die der Lysosomen. Der endozytotische Pathway Durch den endozytotischen Pathway wird Material aus dem extrazellulären Raum aufgenommen und Plasmamembran-Proteine für Membran-Kompartimente der Zelle recycelt. Man unterscheidet zwei verschiedene Mechanismen: Endozytose (Rezeptoren binden an extrazelluläre Liganden) und Phagozytose (Aufnahme von größeren Partikeln). Es gibt weiter zwei verschiedene Arten der Endozytose: bulk-phase Endozytose (Pinozytose) und die Rezeptor-vermittelte Endozytose. Als bulk-phase Endozytose wird die unspezifische Aufnahme von extrazellulärer Flüssigkeit (und

97 denjenigen Substanzen, die sich zufällig darin befinden) bezeichnet. Sie fungiert hauptsächlich als Recycler für Membran-Bestandteile der Plasmamembran für das Zellinnere. Rezeptor-vermittelte Endozytose (RME) und Clathrin-coated Vesikel Durch RME wird eine Aufnahme von Substanzen (Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Blut- Carrier Proteine) ermöglicht, die in relativ geringer Konzentration im extrazellulären Raum vorliegen. Substanzen, die durch RME aufgenommen werden sollen, binden an Rezeptoren, welche an spezialisierten Domänen der Plasmamembran (Coated Pits) konzentriert vorliegen (10-20mal häufiger als in anderen Bereichen). Coated Pits können aufgrund der Kerbung an der Zellmembran und den Clathrin-Molekülen an der zytosolischen Oberfläche der Membran identifiziert werden. An diesen Stellen schnürt sich die Membran ein und bildet Clathrin-Coated Vesikel. Von der zytosolischen Seite betrachtet, ähnelt der coated pit einem Netzwerk aus Hexagonen. Die geometrische Anordnung liegt an der Struktur der Clathrin Moleküle. Sie bestehen aus 3 schweren Ketten und 3 leichten Ketten, die zusammengelagert ein dreibeiniges Triskelion bilden. Wenn sich die Membran beginnt einzuschnüren, wird der coated pit gebogen, wodurch einige flache Hexagone zu Pentagonen konvertieren. Die Triskelion-Struktur weist ein anpassungsfähiges Modul auf, das verschiedene Typen von polygonalen Gittern erzeugen kann. Zwischen dem Clathrin-Gitter und der Membran befinden sich (wie bei den Clathrin-coated Vesikel, die sich vom TGN abschnüren) auch bei den coated Vesikel, die sich von der Plasmamembran abschnüren Adaptor-Proteine. In diesem Fall handelt es sich um den Adaptor-Protein-Komplex AP2 aus 4 Untereinheiten mit je unterschiedlichen Funktionen: Die μ Untereinheit wechselwirkt mit den cytoplasmatischen Schw änzen der spezifischen Rezeptoren für die einzelnen Cargo-Moleküle, was zu einer Konzentrierung dieser Rezeptoren führt. Die β-adaptin Untereinheit rekrutiert und bindet das Clathrin-Gitter, wobei der N-Terminus jeder schweren Kette einen Haken formt, der in Richtung Membran zeigt und von der β Untereinheit des AP2 erkannt wird. Außerdem gibt es noch eine α-adaptin und eine σ Untereinheit (Funktion: Bindung von akzessorischen Proteinen?). Im Vergleich zu den COP Vesikel haben Clathrin-coated Vesikel zusätzlich eine Vielzahl akzessorischer Proteine, die ein dynamisches Netzwerk aus interagierenden Molekülen darstellen. Die Funktionen dieser Proteine sind noch nicht verstanden. Am besten bekannt ist das Molekül Dynamin: es handelt sich um ein G-Protein, das für das Abschnüren von coated Vesikeln notwendig ist. Es assembliert zu einem helikalen Kranz, der sich um den Hals eines sich abschnürenden Vesikels legt. Durch Hydrolyse des gebundenen GTP wird eine Konformations-Änderung im polymerisierten Dynamin eingeleitet, welche das Abschnüren der Vesikel ermöglicht. Die Vesikel-Formation erfolgt in vier Schritten: (1) Bildung der Clathrin-Hülle bewirkt eine Krümmung der Membran. (2) Es bildet sich ein Stängel aus, an dem Dynamin assembliert. (3) GTP Hydrolyse führt zur Vesikel-Abschnürung. (4) Nach der Abschnürung verlieren die Vesikel ihre Clathrin-Hülle und werden zu Vesikeln mit glatter Oberfläche, welche den endozytotischen Pathway durchlaufen.

98 Wird anstelle von GTP GTP-γ-S verwendet, das nicht hydrolysierbar ist, bildet sich ein langer Stängel aus. Das Vesikel kann nicht abgeschnürt werden. Die Route des endozytotischen Pathways Man unterscheidet zwei Rezeptor-Typen, die mit Endozytose in Zusammenhang stehen: Housekeeping-Rezeptoren sind verantwortlich für die Aufnahme von Material, die von der Zelle benötigt wird (z.b. Transferrin für Eisentransport und LDL Rezeptor für Cholesterol- Transport). Endozytose der Housekeeping-Rezeptoren führt zum Transport des gebundenen Materials in die Zelle, wobei der Rezeptor für die Plasmamembran recycelt wird. Signaling-Rezeptoren binden extrazelluläre Liganden, welche den Aktivitätsstatus der Zelle verändern (Insulin-Rezeptoren, Wachstumsfaktor-Rezeptoren, EGF-Rezeptor). Wenn Signaling-Rezeptoren endozytiert werden, führt dies zur Zerstörung des Rezeptors (Rezeptor Down-Regulation), um die Sensitivität der Zelle auf das entsprechende Signal zu reduzieren. Es gibt Fälle in denen solche Rezeptoren für die Endozytose und anschließende Degradation markiert werden (enzymatisches Anfügen von Ubiquitin am cytoplasmatischen Schwanz). Nachdem sich die Vesikel abgeschnürt haben, wird das Material in einem dynamischen Netzwerk aus Tubuli und Vesikel (kollektiv: Endosomen) transportiert. Das Lumen der Endosomen wird durch eine H + -ATPase sauer gehalten. Frühe Endosomen sind an der Zell-Peripherie lokalisiert, währen späte Endosomen näher am Zellkern liegen. Sie haben unterschiedliche Dichten, Proteinzusammensetzungen und ph-werte. Zusätzlich können späte Endosomen interne Membranen aufweisen, die durch eine Abschnürung von Vesikeln ins Lumen zustande kommen. Endosomen fungieren als Sortierstationen, die verschiedene Rezeptor-Typen und Liganden erkennen und sie entlang unterschiedlicher Pathways schicken. Housekeeping-Rezeptoren dissoziieren im sauren Medium von ihren gebundenen Liganden und konzentrieren sich in spezialisierten Recycling-Zentren des frühen Endosoms. Vesikel, die sich von diesen Zentren abschnüren, bringen diese Rezeptoren zurück zur Plasmamembran. Die freien Liganden und die Signaling-Rezeptor-Ligand Komplexe konzentrieren sich an Sortierungs- Zentren, von wo aus sie über Vesikel zu späten Endosomen transportiert werden. Späte Endosomen werden außerdem mit lysosomalen Enzymen vom TGN beliefert (MPR wird recycelt). Die Inhalte des späten Endosoms werden zum Lysosom transportiert, wo die finale Prozessierung der Inhalte stattfindet. LDL/HDL und Cholesterol Metabolismus Die Aufnahme von Cholesterol aus LDL Partikeln des Blutes ist ein Beispiel für Rezeptor-vermittelte Endozytose. Im Kern enthält LDL 1500 mit FS veresterte Cholesterin-Moleküle, umgeben von einem Monolayer Phospholipiden, der ein Molekül Apolipoprotein B-100 (für Bindung an LDL-Rezeptoren notwendig) enthält. LDL nimmt aus der Leber synthetisiertes Cholesterol auf und transportiert es über das Blut zu peripheren Zellen. LDL Rezeptoren werden von der Zelle zur Plasmamembran transportiert und an den Coated Pits konzentriert. Die LDL Partikel werden aufgenommen und in Lysosomen degradiert, wobei die Rezeptoren recycelt werden.

99 Arteriosklerose (1) Endothelzellen werden durch oxydativen Stress verletzt. (2) Leukozyten und Makrophagen werden an die verletzte Stelle rekrutiert. (3) Makrophagen nehmen das oxidierte LDL auf, das im Zytosol in Form von Cholesterinreichen Fett-Tropfen gespeichert wird. LDL-haltige Makrophagen werden als Foam-Zellen bezeichnet. (4) Makrophagen stimulieren das Wachstum glatter Muskelzellen, welche eine fibrilläre Kappe produzieren, die in das arterielle Lumen abgegeben wird. Dadurch hat sich das Lumen verkleinert. Außerdem kann ein Blutgerinnsel entstehen, das einen Herzinfarkt auslösen kann. Eine kleinere Menge an LDL im Blut senkt das Risiko einen Herzinfarkt zu erleiden (Statine wirken als Inhibitoren für die HMG-CoA-Reduktase, senken somit Cholesterin- Synthese). HDL haben eine ähnliche Zusammensetzung, weisen aber anstelle von B-100 das Apolipoprotein A-1 auf. HDL transportiert überschüssiges Cholesterol von den peripheren Zellen zurück zur Leber. Eine große Menge HDL im Blut senkt das Herzinfarkt-Risiko. Dennoch: Cholesterol Moleküle können durch das Cholesteryl-Ester-Transfer-Protein (CETP) von HDL zu LDL übertragen werden. Eine Mutation in dem CETP Gen, führt anscheinend zu langem Leben. Phagozytose Die massive Aufnahme von relativ großen Partikeln (>0,5 μm im Durchmesser) wird von wenigen spezialisierten Zellen durchgeführt. Viele einzellige Protisten fangen Nahrung in Form von Partikeln oder kleinere Organismen ein, indem sie diese mit ihrer Membran einfangen. Die Phagozytose lässt sich in vier Phasen gliedern: (1) Entrapment: Der Nahrungspartikel wird mit den Pseudopods der Zelle umzingelt. (2) Engulfment: Es folgt die Aufnahme des Partikels (ermöglicht durch kontraktile Aktivität des Aktin-Zytoskeletts unterhalb der Membran) und die Bildung einer Nahrungs-Vakuole (Phagosom), die sich von der Plasmamembran abschnürt. (3) Digestion: Das Phagosom fusioniert mit einem Lysosom zu einem Phagolysosom, es folgt die Verdauung. (4) Absorption: Verteilung der Bausteine. In den meisten tierischen Zellen (Makrophagen, Neutrophile) fungiert Phagozytose als Schutzmechanismus und weniger als Nahrungsaufnahme. Jene fressen Fremdkörper oder zerstörte bzw. sterbende Zellen. Solches Material wird über Rezeptoren erkannt und aufgenommen und anschließend durch lysosomale Enzyme oder Radikale (werden innerhalb des Phagosoms generiert) zerstört. Es gibt Mikroorganismen, die gegen diese Abwehr immun sind: Mykobakterium tuberculosis wird zwar durch Phagozytose aufgenommen, aber das sich bildende Phagosom kann nicht mehr mit einem Lysosom fusionieren. Coxiella burnetii kann nicht von lysosomalen Enzymen degradiert werden. Listeria monocytogenes produziert Proteine, welche die Integrität der Lysosomen-Membran zerstören, wodurch der MO ins Zytosol freigesetzt wird. Posttranslationaler Protein-Import Die Proteine für den Zellkern, die Mitochondrien und Plastiden, sowie Peroxisomen werden an freien Ribosomen synthetisiert und posttranslational aufgrund ihrer Signalsequenzen durch die Membranen der Kompartimente translokiert.

100 Peroxisomen Peroxisomen haben lediglich zwei Subkompartimente: die interne Matrix und die Membran. Peroxisomale Proteine haben ein peroxisomales Targeting-Signal (PTS für Matrix- Proteine oder mpts für Membran-Proteine). Es wurden verschiedene PTS Rezeptoren auf der Membran identifiziert, welche an die Proteine im Zytosol binden und sie in die peroxisomale Membran transferieren oder in die Matrix begleiten und anschließend recycelt werden. Die Proteine werden im nativen, gefalteten Zustand transportiert. Katalase-Untereinheiten werden an Polyribosomen im Zytosol synthetisiert und enrhalten eine C-terminale SKL-Sequenz. Die einzelnen Monomere assoziieren mit Häm, wonach der Tetramer assembliert. Das SKL-Signal bindet an den löslichen zytosolischen Rezeptor PTS1R. Der PTS1R- Katalasekomplex bindet nun an den Pex14p- Rezeptor der peroxisomalen Membran, wodurch der Transport eingeleitet wird. PTS1R wird mit transportiert und anschließend wieder ins Zytosol exportiert, um erneute Import-Schritte vermitteln zu können. Mitochondrien Mitochondrien haben vier Subkompartimente: OMM, IMM, Intermembran-Raum und die Matrix. Einige Proteine werden vom Mitochondrium selbst codiert (rrnas, trnas, Untereinheiten von integralen Membranproteinen), über 95% allerdings vom Kern-Genom. Letztere werden im Zytosol codiert und müssen über Targeting Sequenzen zum Mitochondrium dirigiert werden. Mitochondriale Matrix-Proteine beinhalten eine i.d.r AS lange Target- Sequenz am N-Terminus, die viele positivgeladene (Lys, Arg) sowie hydroxylierte Aminosäuren (Ser, Thr) aufweisen (aber keine sauren AS) und nach dem Transport abgespalten wird.

101 Membran-Proteine der IMM weisen zusätzlich interne Target-Sequenzen auf, die Bestandteile des Proteins sind und an die innere Membran binden. Proteine des Intermembran-Raumes haben zusätzliche Signalsequenzen am N-Terminus, die ebenso proteolytisch abgespalten werden. Proteine der OMM haben eine Stopp-Transfer-Sequenz, die nicht proteolytisch abgespalten wird. Damit die Proteine transportiert werden können, müssen sie zunächst durch verschiedene Chaperone (Hsp70 oder MSF, mitochondrial import stimulation factor) in den ungefalteten Zustand überführt und an die zytosolische Oberfläche der OMM geführt werden. Die OMM beinhaltet den Proteinimport-Komplex TOM (transport across outer membrane), der sich aus Transport-Rezeptoren und Translokatoren zusammensetzt. MSF bindet an Tom37/70-Rezeptor, wonach der gebundene Vorläufer an den Tom20/22- Rezeptor gereicht wird. Hsc70 bindet direkt an den Tom20/22-Rezeptor. Der Transportkanal entspricht der Tom40-Einheit bestehend aus drei Untereinheiten. Aufgrund der β-barrel Struktur, die sich nicht lateral öffnen lässt, müssen Membran-Proteine der OMM auch den Intermembran-Raum passieren. Matrix-Proteine und Proteine der IMM müssen OMM und IMM passieren, weshalb Kontaktstellen zwischen äußerem und innerem Transportkanal existieren. Proteine für die IMM oder die Matrix wandern durch den Intermembran-Raum und müssen einen zweiten Proteinimport-Komplex (TIM) durchqueren. Es gibt zwei verschiedene TIM-Komplexe in der IMM: Der TIM22-Komplex bindet integrale Membran-Proteine und fügt sie in die Lipid- Doppelschicht der IMM ein, indem sich der Komplex lateral öffnet. Der TIM23-Komplex (Tim23/17/50) transportiert Matrixproteine durch die IMM. Die Translokation findet an Stellen statt, wo sich IMM und OMM sehr nahe kommen, damit das Protein beide Komplexe simultan durchqueren kann. TIM21 ist eine Protein-Komponente des TIM23-Komplexes, dessen C-Terminus ins Periplasma ragt. TIM21 ist für die Kontakte zwischen TIM23 und TOM verantwortlich (TIM22 hat keine Verbindung). Der Transport über TIM wird angetrieben durch das elektrische Potential über der IMM (positiv geladener N-Terminus wird zuerst transloziert).

102 Wenn das Polypeptid die Matrix erreicht, interagiert es mit mitochondrialen Chaperonen (u.a. mthsp70), welche die weitere Aufnahme in die Matrix vermitteln. Die Chaperone agieren nach einer Vorstellung als Motoren, welche durch ATP-Hydrolyse das ungefaltete Polypeptid durch die Translokationspore ziehen. Nach einer zweiten Vorstellung unterstützen sie lediglich die Diffusion der Moleküle über die Membran, indem sie ein zurück-diffundieren durch Bindung an ein freies Stück der Kette verhindern (befangene Diffusion, kann nur in eine Richtung). Aktuelle Studien zeigen, dass es sich um eine Kombination beider Mechanismen handelt. Die Energie für den Transport wird also durch die ATPase mhsp70 sowie den elektrochemischen Gradienten aufgebracht. Die Präsequenz des Matrix-Polypeptids wird von dem löslichen Enzym MPP (mitochondriale Prozessierungs-Peptidase) abgeschnitten. Mithilfe der Chaperone Hsp60 gelangen die Proteine in ihre native Konformation. Transport mitochondrialer Intermembranproteine Nach dem konservativen Weg (z.b. Cytochrom c1) erfolgt zunächst die Translokation des ungefalteten Proteins in die Matrix, wo die Matrix-Targeting-Sequenz abgespalten wird. Danach ist die Intermembran-Targeting-Sequenz am N-Terminus freigelegt, welche die Translokation über die IMM in den Intermembranraum ermöglichen.

103 Nach einem nicht-konservativen Weg (z.b. Cytochrom b2) wird die Matrix-Targeting-Sequenz direkt während der Translokation über die IMM abgespalten, während die Intermembran-Targeting- Sequenz als Membran-Insertionssignal fungiert. TIM öffnet sich lateral und insertiert diese Targeting- Sequenz, woraufhin Peptidasen im Intermembran-Raum die Sequenz abspalten. Das Protein landet so direkt im Intermembranraum, während die Targeting-Seqeuenz in der IMM bleibt. Chloroplasten Chloroplasten haben sechs Subkompartimente: ICM, OCM und Intermembran-Raum, sowie Stroma, Thylakoid-Membran und Thylakoid-Lumen. Die Translokationsmaschinerien von Mitochondrien und Chloroplasten entwickelten sich unabhängig voneinander, zeigen aber viele Gemeinsamkeiten. (1) Die meisten Proteine werden aus dem Zytosol importiert. (2) Innere und äußere Membranen weisen Translokations-Komplexe (TIC und TOC) auf, die während des Imports zusammenarbeiten. (3) Chaperone helfen beim Entfalten des Proteins im Zytosol und beim Falten im Chloroplasten. (4) Als Target-Sequenz fungiert ein N-terminales Transit-Peptid, das im Chloroplasten entfernt wird. Das Transit-Peptid enthält die Adresse für eines der verschiedenen Subkompartimente der Organelle. Alle Proteine, die durch die Chloroplasten-Doppelmembran transportiert werden, beinhalten eine Stroma-Targeting-Domäne als Teil ihres Transit-Peptids. Eine Prozessierungs- Peptidase entfernt diese Domäne im Stroma. Solche Proteine, welche ins Thylakoid-Lumen oder in die Thylakoid-Membran gehören, tragen eine Thylakoid-Transfer-Domäne. Viele Thylakoid-Proteine werden auch von den Chloroplasten selbst, an Ribosomen, die an der Thylakoid-Membran assoziiert sind, synthetisiert und cotranslational ins Thylakoid-Lumen transportiert.

104 Translokations-Mechanismus Plastidäre Präproteine binden im ungefalteten Zustand, noch während der Translation, an einen Guidance-Komplex und werden über einen Rezeptor an den heterotrimeren TOC-Komplex der OCM rekrutiert. Toc159 fungiert als Präprotein-Rezeptor. Toc75 bildet den Translokationskanal. Toc34 reguliert vermutlich die Insertion des Präproteins in den Translokationskanal. TOC34 und TOC75 sind GTP-bindende Proteine. Die Rolle von einer vierten Komponente (Toc64) ist nicht bekannt. Der folgende Translokationsprozess kann, abhängig von der benötigten Energie, in drei Schritte aufgeteilt werden: (1) Energie-unabhängige Bindung: Das Präprotein interagiert reversibel mit dem heterotrimeren TOC-Komplex (2) Bildung des frühen Import-Intermediats benötigt ATP in niedrigen Konzentrationen innerhalb des Intermembranraums sowie GTP. Hier wird das Präprotein in die OCM inseriert und gelangt in Kontakt mit den Komponenten des TIC-Komplexes (TIC22 ist in die Erkennung des präproteins involviert, TIC22 bildet den Translokationskanal, TIC55 hat eine regulatorische Funktion, TIC110 und TIC40 rekrutieren molekualre Chaperone). (3) Vollständige Translokation benötigt hohe ATP-Konzentrationen im Stroma. Das Präprotein translokiert gleichzeitig über OCM und ICM an einer Kontakt-Stelle der Membranen. Das Transit-Peptid wird im Stroma durch eine prozessierende Peptidase (SPP) gespalten, wnach das reige Protein seine native Konformation einnimmt. Es wird angenommen, dass zwei verschiedene TIC-Komplexe existieren. Tic-Komplex B katalysiert die beschriebene Import-Reaktion

105 Der Zellkern Der Zellkern sorgt für die räumliche Trennung der mrna-synthese und Protein-Synthese innerhalb eukaryotischer Zellen wurde jedoch gezeigt, dass auch innerhalb des Zellkerns Proteine synthetisiert werden können, u.u. bis zu 10% des zellulären Proteingehalts. Die Kernhülle besteht aus zwei parallel verlaufenden Membranen und einem Intermembran-Raum von 10-50nm Breite. Die zwei Membranen sind in Bereichen, wo sich zirkuläre Poren befinden miteinander fusioniert. Eine Säuger-Zelle beinhaltet mehrere tausend solcher Kernporen. Die äußere Membran ist mit Ribosomen besetzt und geht kontinuierlich in die RER-Membran über. Der Intermembran-Raum des Zellkerns ist eins mit dem des RERs. Die innere Oberfläche der inneren Kernmembran ist von integralen Membran-Proteinen in einem dünnen filamentösen Netzwerk gebunden (Maschenwerk aus Laminen = Intermediärfilamente = Kernlamina). Die Kernlamina sorgt für die mechanische Festigkeit der Kernhülle und fungiert als Bindestelle für Chromatin-Fasern an der Kernperipherie. Die einzelnen Filamente mit 10nm Durchmesser bestehen aus Laminen, Polypeptide derselben Superfamilie wie die der 10nm- Intermediärfilamente im Zytosol. Während der Mitose disassembliert die Kernlamina (reguliert durch Phosphorylierung durch spezifische Protein-Kinasen). Struktur und Funktion der Kernporen Die Zahl der Kern-Poren wechselt von Zelltyp zu Zelltyp und mit dem Funktionszustand der Zelle zwischen einigen hundert und mehr als einer Millionen Poren pro Zellkern. Die Funktion ist u.a. der Export von Protein-besetzter mrna sowie der Import von im Zytosol synthetisierten, aber im Kern lokalisierten Proteinen. In prolifierierenden Zellen werden pro Minute hunderte Moleküle durch eine Kern-Pore transportiert. Die Kernporen der Kernhülle fungieren als Transporter für RNAs und Proteine in beide Richtungen: mrnas und trnas müssen ins Zytosol, während zahlreiche Proteine in den Zellkern transportiert werden müssen. Einige Komponenten wie snrnas des Spleißosoms werden in beide Richtungen transportiert (im Zellkern synthetisiert, im Zytosol zu RNP Partikel assembliert und zurück in den Zellkern transportiert, wo sie bei der mrna-prozessierung helfen). Eine Injektion von Goldpartikeln verschiedener Größen in die lebende Zelle erlaubt die Beobachtung ihres Transports unter dem Elektronenmikroskop: ein Partikel nach dem anderen wandert durch die Pore. Sogar ganze ribosomale Untereinheiten können die Poren passieren. Kernporen beinhalten einen Kernporen-Komplex (NPC), der die Pore wie einen Stopper ausfüllt, um das Zytoplasma und das Nukleoplasma zu schützen. Es handelt sich also nicht um unspezifische Kanäle, die alles durchlassen. Der NPC ist ein supramolekularer Komplex mit oktagonaler Symmetrie aus 30 verschiedenen Proteinen in Hefe (Nukleo-Porine), die in der Evolution hochkonserviert sind. Jedes Nukleo-Porin liegt in mindestens acht Kopien pro NPC vor. Es handelt sich mit 125 MDa in Vertebraten und 66 MDa in Hefe vermutlich um den größten zellulären Protein-Komplex überhaupt (die Anzahl der Untereinheiten ist im Vergleich zur Gesamtmasse sehr gering, verglichen mit den 75 Untereinheiten des Ribosoms, das 4 MDa wiegt). Der NPC aus Vertebraten misst ca. 145 nm im Durchmesser und 80 nm in der Länge über die Kernmembran (Der NPC aus Hefe ist mit 96x35nm etwas kleiner; dennoch ist dies im Vergleich zu anderen Proteinkomplexen wie die tetrameren Aquaporine mit 6,5nm

106 Durchmesser riesig). Seine engste Stelle liegt in der mittleren Ebene und ist ca. 40 nm breit. Die Kernporendichte variiert von 2 bis 60 NPC pro µm². Ins Zytoplasma ragen die zytoplasmatischen Filamente, die an einem Protein-Ring, der innerhalb der Membran liegt, befestig ist. Der Ring besteht aus einem zytoplasmatischen Ring (oben), einem nukleoplasmatischen Ring (unten), einem inneren Speichen-Ring (in der Mitte, in der Nähe der Pore) und einem äußeren Speichen-Ring (in der Mitte, weiter von Pore entfernt, in der Membran liegend). Nach unten zeigt der nuclear basket. Im Zentrum des NPC befindet sich der zentrale Transporter. Proximale Filamente ragen sowohl ins Zytosol als auch ins Nukleoplasma. Kernimport-Signal-Sequenzen Niedermolekulare, lösliche Substanzen (Salze, kleine Moleküle, Proteine bis zu kda = 10 nm Durchmesser) diffundieren schnell und spontan durch die Poren, weil sie durch die Öffnung der inneren Speichen passen. Größere Moleküle, wie Proteine und RNA benötigen hingegen spezielle Transportsysteme. Eine AS-Sequenz aus basischen AS (Lys, Arg) fungiert als Kernlokalisations-Signal (NLS) und ermöglicht das Passieren des NPC. Man unterscheidet zwei klassische NLS-Typen: Im monopartiten Typ sind die basischen Aminosäuren in einer direkten Folge angeordnet, während sie im bipartiten Typ durch andere Aminosäuren unterbrochen sind. Die Minimalsequenz des NLS ist K-(K/R)-X-(K/R) mit X=K,R,V,P,A. Die NLS besitzen keine bestimmte Position im Protein (oft aber in der Nähe des C-Terminus) und werden nach dem Transport nicht abgespalten. Die NLS sind i. d. R. positiv geladen und bestehen aus 4 bis 8 Aminosäuren. In der Nähe der NLS befinden sich häufig helixunterbrechende Aminosäuren wie P und G. Proteine können mehrere NLS besitzen. Bei bipartiten NLS sind beide Teile für den Kerntransport essentiell. Der zwischen diesen Teilen liegende Aminosäurenbereich kann jedoch eine große Variabilität hinsichtlich Länge und Sequenz aufweisen.

107 Import- und Export-Mechanismen Die am Kerntransport beteiligten Transport-Faktoren lassen sich in drei Kategorien einteilen: Transport-Rezeptoren, Adaptor-Moleküle und Bestandteile des RanGTP/GDP-Zyklus. Mitglieder der Importin-β Superfamilie (Benennung nach erstem entdeckten Transport-Rezeptor: Importin-β; >20 Mitglieder in Eukaryoten, kda) fungieren als Transport-Rezeptoren, welche Makromoleküle in den Zellkern (Importine) und aus dem Zellkern (Exportine) transportieren. Mitglieder dieser Familie haben N-terminale RanGTP-Bindemotive und C-terminale wenigkonservierte Substrat-Bindestellen. Außerdem existieren superhelikale (2 antiparallele Helices über Drehung verbunden) HEAT-Wiederholungen, die es den Transportrezeptoren ermöglichen, abhängig von ihrem funktionellen Status verschiedene Konformationen einzunehmen. Je nach Bindungspartner variiert die Orientierung der Superhelices (Variabilität, Flexibilität), wodurch viele Substrate transportiert werden können. Der Import beginnt damit, dass das NLS-haltige Cargo- Protein an den cytoplasmatischen, löslichen, heterodimeren NLS-Rezeptor Importin α/β bindet. Dabei bindet Importin-α an das zu importierende Protein, während Importin-β mit Importin-α wechselwirkt und den Import durch die Kern-Poren vermittelt. Der NLS-Rezeptor transportiert das Cargo-Protein zur Kernpore, wo es an die zytoplasmatischen Filamente des NPC andockt. Anschließend bewegt sich der Rezeptor-Cargo- Komplex durch die Kernpore, indem es von der einen zur nächsten Bindestelle im NPC springt, wobei mehrere Konformations-Änderungen innerhalb der einzelnen Proteine den Transport gewährleisten. Der Mechanismus, mit dem der NPC selektiv Import/Export-Rezeptoren erkennt und den Transport anderer Proteine blockiert ist nicht genau verstanden. In diesen Prozess sind jedoch Nukleo-Porine involviert, die FG-Repeats aufweisen und eine Affinität für Transport-Rezeptoren aufweisen. Diese haben hydrophobe Bindestellen für die FG- Wiederholungen. Die FG-haltigen Nukleoporine bilden die Filamente des NPC, an die Transportkomplexe als erstes binden. Sie sind aber auch innerhalb der Transport-Pore lokalisiert, sodass der Transport-Rezeptor von Bindestelle zu Bindestellen springen kann. Die Abbildung zeigt Importin-β (rot) mit dem Cargo- Molekül SREBP-2 (blau). Die HEAT-Repeats von Importin-β sind durchnummeriert.

108 Wenn ein Importin-Cargo-Komplex das Nukleoplasma erreicht, trifft er auf Ran-GTP (Ras im Nucleus), das an den Komplex bindet und seine Dissoziation stimuliert. Das Cargo-Molekül wird ins Nukleoplasma freigesetzt und die β-importin Untereinheit wird im Komplex mit Ran-GTP zurück ins Zytosol transportiert. Im Zytoplasma angekommen wird GTP hydrolysiert, wodurch die β Importin Untereinheit frei wird und Ran-GDP zurück in den Zellkern transportiert werden kann. Importin-α wird durch das Exportin CAS ins Zytoplasma transportiert. Im Zytoplasma herrscht eine geringe, im Nukleoplasma eine hohe Ran-GTP Konzentration. Dieser Gradient wird durch die unterschiedliche Kompartimentierung akzessorischer Proteine aufrechterhalten. Der Gradient wird durch GTP-Hydrolyse aufrechterhalten und sorgt für eine Rezeptor-vermittelte Diffusion, die den Transport in den Zellkern antreibt. RCC1 ist im Zellkern lokalisiert und überführt Ran-GDP zu Ran-GTP, indem es als GEF wirkt. RanGAP1 (GTPase activating protein) ist im Zytosol lokalisiert und überführt Ran-GTP zu Ran- GDP, indem es die schwache GTPase-Aktivität von Ran stimuliert. Export aus dem Zellkern Ran-GTP unterstützt im Nukleoplasma die Assemblierung von Komplexen, die exportiert werden sollen. Solche Proteine weisen Leucin-reiche Kern-Export-Signale (NES) auf, die vom Transport- Rezeptor Exportin 1 erkannt werden. Es bildet sich ein Komplex aus Ran/GTP, dem Exportrezeptor und dem zu exportierenden Protein, der durch die Kern-Pore wandert. Über Export ist weniger bekannt als über den Import. Das wichtigste Export-Material sind RNA- Moleküle wie mrna, trna und rrna. mrna und rrna werden über Ribonuklein-Proteine exportiert, während trna an Exportin t gebunden exportiert wird. So trägt die mrna u.a. immer das Protein hnrnpa1, und zwar zum Zeitpunkt der Synthese bis zur Ankunft im Zytoplasma (hnrnpa1 wird spezifisch durch die Kern-Pore transportiert und ist an die mrna gekoppelt). Export von mrnps: Das Primär-Transkript enthält Exons und Introns. Die pre-mrna wird nun zur mrna gespleißt, die ein Proteinkomplex (EJC) beinhaltet, der Nukleotide stromaufwärts von jeder Exon-Exon Verbindung liegt. Eine Untereinheit des Komplexes ist das Protein Aly. Anschließend bindet ein weiteres Protein (TAP) an das mrnp Molekül, wodurch es dazu in der Lage ist, den Kern zu verlassen. Nachdem der Komplex die NPC passiert hat werden Aly und TAP abgeworfen und die mrna kann translatiert werden. Die EJCs werden während der ersten Runde Translation abgeworfen.

109 ABC-Transporter Bedeutung der ABC-Transporter Für das Zellwachstum ist die Aufnahme von Nährstoffen essentiell. E.coli importiert so pro Sekunde 10 6 Moleküle Glucose. Außerdem haben Zellen oft die Fähigkeit eine große Bandbreite alternativer Nährstoffe aufzunehmen. Aufgrund der Diversität der Moleküle, die von der Zelle benötigt wird, sind zahlreiche Transporter in jedem Genom codiert. In E.coli sind 10% des Genoms an Transportprozessen beteiligt, wobei insgesamt über 550 verschiedene Transportertypen identifiziert wurden. Die Wichtigkeit von Transportaktivitäten kann auch anhand der metabolischen Kosten für das aktive Pumpen von Molekülen über Zellmembranen eingeschätzt werden: 10-60% des ATP- Umsatzes von Bakterien und Menschen werden, abhängig von den Bedingungen, für Transportprozesse benötigt. Eine der größten Transporter-Klassen ist die ATP-binding cassette (ABC) Transporter Superfamilie. Transporter dieser Klasse nutzen die ATP-Hydrolyse für den aktiven Import oder Export verschiedener Substrate, von Ionen bis hin zu Makromolekülen. Die Superfamilie der ABC-Transporter ist die größte Proteinfamilie in E.coli mit insgesamt ca. 80 verschiedenen Systemen, die 5% des Genoms ausmachen. Im Menschen sind ca. 50 verschiedene ABC-Transporter vorhanden, welche in sieben Familien eingeteilt werden. Ihre Funktionen liegen in Cholesterol- und Lipid-Transport, Multidrug-Resistenz, Antigen- Präsentation, mitochondriale Fe-Homeostase und ATP-abhängige Regulation von Ionen-Kanälen (z.b. CFTR: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; sulphonyl urea Rezeptoren). Mutationen in diesen Proteinen sind mit zahlreichen Erkrankungen assoziiert (zystische Fibrose, Hypercholesterinämie, Diabetes). ABC-Transporter sind wesentlich an dem Erhalt von elektrischen und chemischen Konzentrationsgradienten über die Zellmembran beteiligt, indem sie die ATP- Hydrolyse nutzen, um Moleküle entgegen ihres Gradienten zu transportieren. Dies ist für die Zelllebensfähigkeit essentiell. Mitglieder der ABC-Transporter Familie sind in allen Reichen des Lebens vorhanden, wobei Exporter in Eukaryoten und Prokarypoten, Importer jedoch ausschließlich in Prokaryoten (Eubakterien und Archeen) zu finden sind. Ausnahme: Das pflanzliche MDR-Typ ABC-Protein CjMDR1 ist in Coptis japonica für den Import von Berberine aus der Wurzel ins Rhizom verantwortlich. Substrate von ABC-Importern sind Nährstoffe wie Aminosäuren, Zucker und essentielle Metalle. Sie variieren extrem in Größe und chemischer Natur (von Oligopeptiden und Oligosacchariden bis hin zu kleinen Ionen). Im Menschen sind ABC-Exporter entscheidend am Export von Lipiden, Fettsäuren und Cholesterol beteiligt. Der meist studierteste ABC-Transporter ist das humane P-Glykoprotein (PGP), das die Cholersterin-Verteilung zwischen den Hälften der Plasmamembran aufrecht erhält. PGP exportiert auch andere lipophile Substanzen, wie chemotherapeutische Agenzien, wodurch die Multidrug-Resistenz von Tumorzellen begründet liegt.

110 Der erste entdeckte ABC-Transporter ist die Bindeprotein-abhängige Histidin-Permease (1982) HisP 2 QMJ. Die erste hochauflösende Struktur eines ABC-Transporters war der Vitamin-B12-Importer aus E.coli (2002). Bis zum Jahr 2009 wurden sechs Strukturen von ABC-Importern und zwei von ABC- Exportern beschrieben. Strukturelle und Funktionale Charakterisierung Alle ABC-Transporter haben eine charakteristische Architektur, die aus mindestens vier Domänen besteht: zwei Transmembrandomänen (TMDs) und zwei zytosolische Nukleotid-Bindedomänen (NBDs oder ABCs). Auf der Sequenz-Ebene sind die ABC-Transporter durch mehrere charkateristische und hochkonservierte Sequenz-Motive innerhalb der ABCs gekennzeichnet. Dahingegen zeigen die TMDs in Sequenz und Architektur keine Gemeinsamkeiten, was die Diversität der translokierenden Substrate wiederspiegelt. NBDs sind hochkonservierte Motoren, welche unabhängig von den TMDs auch in anderen essentiellen zellulären Prozessen wie DNA-Reperatur, Protein-Translation oder Ribosom-Assemblierung involviert sind. Neben diesen vier Domänen, können zusätzliche Elemente an die TMDs oder ABCs fusionieren und regulatorische Funktionen inne haben. In prokaryotischen Importern ist die Substrat-Translokation zusätzlich von einer weiteren Proteinkomponente, einem hochaffinen Bindeprotein abhängig, das spezifisch innerhalb des Periplasmas mit dem Ligand assoziiert, um es zum entsprechenden ABC- Transporter zu dirigieren. Domänen-Organisation Die Quartiärstruktur der ABC-Transporter kann stark variieren. Während in verschiedenen bakteriellen Genen einzelne Domänen oder fusionierte Domänen-Paare (TMD-TMD, NBD-NBD oder TMD-NBD) codiert sind, liegen dreiviertel der humanen ABC-Gene als full-length Transporter vor. Die Abbildungen unten zeigen links den BtuCD Importer, welcher aus der Membran-integralen Untereinheit BtuC und der ABC-Untereinheit BtuD besteht und die Vitamin B12 Aufnahme

111 katalysiert, im Komplex mit dem assoziierten Bindeprotein BtuF und rechts den Multidrug Exporter Sav1866 aus S.aureus. Die vier Domänen des BtuCD Transporters bestehen aus vier individuellen Polypeptidketten, zwei Kopien aus BtuC (TMD) und zwei Kopien aus BtuD (ABC). Im Gegensatz dazu besteht jede Untereinheit des dimeren Sav1866 aus einer TMD und einer ABC, die miteinander fusioniert sind. Das Überspannen der zweifachen Rotationsachse durch die TMDs erzeugt den Translokations-Pathway über die Membran. Die ABCs sind so orientiert, dass die konservierten Sequenzmotive an der Dimer-Grenzfläche lokalisiert sind. ABC-Untereinheiten und Nukleotid-Bindestellen ABC-Untereinheiten bestehen hauptsächlich aus der NBD, die wiederum in zwei Domänen mit bestimmten konservierten Bereichen unterteilt werden kann: (1) katalytische RecA-ähnliche Kerndomäne (längerer Arm1) a. Walker A (GXXGXGK(S/T); auch P-Loop oder Gly-reiche Region b. Walker B (φφφφde; wobei φ = hydrophobe AS) c. D-Loop d. H-Motiv (auch switch-region) (2) strukturell mehr variierende α-helikale Domäne (kürzerer Arm2) a. ABC Signatur Motiv LSGGQR (C-Loop Sequenz) b. Q-Loop Die Sequrenzidentität zwischen den einzelnen ABC-Domänen beträgt 20-60%.

112 Die relative Orientierung der helikalen und katalytischen Domänen ist vom Nukleotid-Zustand abhängig. In einem intakten Transporter sind die ABC Untereinheiten dicht in einer Kopf-Schwanz- Orientierung gepackt, sodass der P-Loop der einen Untereinheit in Richtung des Signatur-Motivs der anderen Untereinheit zeigt. Als Konsequenz dieser Orientierung ist die Nukleotidbindestelle an der Grenzfläche zwischen den Untereinheiten lokalisiert. Die Nukleotidbindestelle 1 wird primär durch Walker A der NBD1 und dem Signaturmotiv der NBD2 gebildet. Die Nukleotidbindestelle 2 wird durch Walker A aus NBD2 und dem Signaturmotiv aus NBD1 gebildet.

113 Im ATP-gebundenen Zustand sind die zwei ABC-Domänen am dichtesten gepackt, während sie im ATP-freien Zustand weiter von einander separiert vorliegen. Die Phosphatkette des Nukleotids wird durch Walker A gebunden. Walker A befindet sich am N-Terminus einer Helix, die benachbart zu einem parallelen β-faltblatt liegt. Der eine Loop des benachbarten β-faltblatts enthält das Walker B Motiv, der andere ist der H-Loop. Beide Loops kontaktieren das y-phosphat von ATP innerhalb einer F1-ATPase-ähnlichen ATP-Bindestelle. Auf der anderen Seite der Walker A Helix befindet sich ein ausgedehnter Loop einer ABC-spezifischen antiparallelen β-region, die einen die Nukleotid-Base kontaktierenden aromatischen Rest enthält. Zusätzlich interagiert die Phosphatkette des Nukleotids mit dem ca. 15A weit entfernten C-Loop der so genannten α-helikalen Domäne der anderen NBD-Untereinheit. Die folgende Abbildung zeigt den ATP-gebundenen ABC-Dimer aus TAP. Walker A und C-Loop sind schwarz markiert.

114 TMD-Faltungen Die Membran-durchspannenden Untereinheiten von ABC-Transportern sind strukturell sehr heterogen, wobei bisher drei verschiedene Faltungsvarianten erkannt wurden. Diese wurden als Typ1-ABC-Importer-, Typ2-ABC-Importer- und ABC-Exporter-Faltung bezeichnet. Die Typ1 ABC Importer Faltung (kleine ABC-Importer) Kleine ABC-Importer zeigen TM-Strukturen mit einer Typ1-Importer-Faltung. Folgende ABC- Transporter gehören in diese Klasse. (1) Molybdat- und Wolfram-Transporter ModBC-A: ModB ist ein Homodimer aus den TM-Untereinheiten, ModC ist ein Homodimer aus den ATPase Untereinheiten, ModA ist das Bindeprotein. (2) Maltose-Transporter MalFGK 2 -E: MalF und MalG sind die zwei TM-Untereinheiten, MalK 2 ist der ATPase-Homodimer, MalE ist das Maltose-Bindeprotein. (3) Methionin Transporter MetNI: MetI ist die Homodimere TMD, während MetN die homodimere NBD ist. Transporter dieser Klasse transportierend damit relativ kleine Substrate. Diese Faltung wird mit dem minimalen Set aus 5 TM-Helices innerhalb jeder Untereinheit organisiert. MetI hat dabei die einfachste TMD-Struktur mit ausschließlich diesen fünf Kern-Helices, wobei MalF (8 Helices), MalG (6 Helices) und ModB (6 Helices) zusätzliche Helices aufweisen. Damit weisen die Transporter für Methionin, Molybdat und Maltose insgesamt 10, 12 bzw. 14 TM-Helices auf. Die 5-Helices-Kern Strukturen lassen sich alle sehr gut übereinander lagern. Die Abweichung (rmsd) zwischen äquivalenten Cα Positionen dieser vier Polypeptidketten beträgt nur 2,5Å.

115 TM2-5 zeigen eine up-down Topologie, welche den Translokations-Pathway auskleidet. TM1 umschließt die äußere zur Membran ausgerichtete Oberfläche und kontaktiert die anderen 4 TM-Helices. Die zusätzlichen Helices interagieren primär mit den anderen Untereinheiten. Die Typ2 ABC-Importer Faltung (große ABC Importer) Große ABC-Importer zeigen TM-Strukturen mit einer Typ2-Importer-Faltung. Folgende ABC- Transporter gehören in diese Klasse. (1) E.coli Vitamin B12 Transporter BtuCD-F: enthält zwei Kopien der ATPase Untereinheit BtuD sowie der TMD Untereinheit BtuC. BtuF ist das Bindeprotein. (2) Metal-Chelat Transporter aus Haemophilus influenza HI1470/71: Transporter dieser Klasse transportieren damit relativ große Substrate. BtuC enthält 10 TM-Helices pro Untereinheit und damit insgesamt 20 im vollständigen Transporter, von denen keine die 5TM- Kernstruktur der kleinen ABC-Importer darstellt. Die Helices sind in einer verworrenen Topologie dicht aneinander gepackt. Die Amino- und Carboxy-terminale Hälften der BtuC Untereinheit zeigen ähnliche Helix-Packungen. TM2-5 und TM7-10 haben jedoch unterschiedliche Polaritäten über die Membran. Dabei reicht TM2 durch das Zentrum der Untereinheit in die Nähe der gegenüberliegenden TM-Helices. TM5 und TM10 dominieren an der Grenzfläche zwischen den TMDs. Die ABC-Exporter Faltung (1) Sav1866 aus Staphylococcus aureus ist ein Homodimer aus zwei Halbtransportern, bestehend aus einer N-terminalen TMD und einer C-terminalen NBD. (2) Lipid-Flippase MsbA Sav1866 enthält 6 TM-Helices je Untereinheit und damit 12 für den vollständigen Transporter. In der outward facing Konformation von Sav1866 ist die TM-Region in zwei Flügeln organisiert, welche aus den Helices TM1 und TM2 der einen Untereinheit und den Helices TM3 bis TM6 der anderen aufgebaut sind. Zusätzlich enthalten Exporter lange intrazelluläre Loops (ICLs), welche ca. 2,5 nm aus der Membran ins Zytoplasma ragen.

116 Es gibt mit ziemlicher Sicherheit weitere, bisher nicht beschriebene Klassen von TMD-Faltungen. Phylogenetische Klassifikation der ABC-Proteine Eine phylogenetische Klassifikation, basierend auf den Sequenzen der ABC-Domänen, zeigt drei Hauptklassen von ABC-Transportern. Sequenz Klasse 1 hat dabei fusionierte ABCs und TMDs und enthält zum größten Teil Exporter (hohe Sequenzähnlichkeiten). ABC-Domäne und TMD können hier entweder als N- oder C-Terminus auftauchen. In Sequenz Klasse 3 sind TMDs und ABCs auf

117 unterschiedlichen Polypeptiden codiert. In diese Klasse gehören die meisten Importer, welche eine wesentlich höhere Sequenz-Divergenz zeigen als die Exporter. Die Sequenz-Klasse 2 enthält ABC- Proteine, die keine TMDs aufweisen. Es liegen hier auf einer Polypeptidkette unterschiedlich viele Wiederholungen der ABC-Domäne vor. Diese Proteine sind in nicht-transport-prozessen involviert. Es wurden bisher 12 Importer-Familien identifiziert (2009). Die strukturell zur Typ 1 Importer Faltung gehörenden Transporter (Maltose, Molybdat, und Methionin Transporter) entsprechen bestimmten Sequenz-abgeleiteten Transporter-Familien (Oligosaccharid und Polyol [OSP], Mineral und Organische [] und D-L Methionin und Derivate [DLM] Transporterfamilien). Diese Familien sind in einem Zweig des phylogenetischen Baums lokalisiert. Die strukturell zur Typ 2 Importer Faltung gehörenden Transporter gehören dahingegen zu den Sequenz-abgeleiteten Fe- Siderophore, Vitamin B12 und Hemin (ISVH) Familie, welche einen separaten Zweig im phylogenetischen Baum darstellt. Es existiert ein dritter Zweig im phylogenetischen Baum, welcher die Hydrophobe Aminosäure (HAA) Familie (wie das Leu, Ile, Val [LIV] System) und die Monosaccharid (MOS) Familie (wie Ribose [RBS]) enthält. HAA und MOS Familie sind über eine Verzweigung klar voneinander getrennt, da sie entweder eine Typ1 oder eine Typ2 Faltung enthalten. Ein Vergleich zwischen phylogenetischer und struktureller Klassifikation zeigt, dass noch weitere strukturell nicht charakterisierte TMD Faltungen existieren müssen. Bindeproteine

118 Bindeproteine werden ausschließlich für ABC-Importer benötigt. Medizinisch relevante ABC-Exporter funktionieren ohne die Hilfe von Bindeproteinen. Die Strukturen der Bindeproteine für ABC-Transporter variieren in ihrer Topologie zwischen den Domänen und können in drei verschiedene Kategorien eingeteilt werden. Transportsysteme mit einer Typ1 Importer Faltug haben eine Bindeprotein Typ1 Faltung (z.b. ModA, MalE, MetQ), wobei Transportsysteme mit einer Typ2 Importer Faltung eine Bindeprotein Typ3 Faltung aufweisen (z.b. BtuF). Transportsysteme mit Bindeprotein Faltung Typ2 (z.b. RbsB, LivJ, LivK) entsprechend den HAA und MOS Sequenzfamilien der ABC-Domänen, was vermuten lässt dass diese ebenso eine unterschiedliche strukturelle TMD-Architektur aufweisen. Konformationszustände der NBD und Kommunikation mit der TMD Die Grenzfläche zwischen den ABC-Domänen wechselt von einer geschlossenen ATP-gebundenen Konformation nach der ATP-Hydrolyse zu einer offenen Konformation, die charakteristisch für die nicht-atp Zustände (ADP-gebunden, Nukleotid-frei) ist. Diese Nukleotid-abhängigen Konformationsübergänge treiben die Konformationsändeurngen innerhalb der TMDs an, wodurch die Substrat-Translokation vermittelt wird. Die Separation der Untereinheiten reicht von 11Å im ATP-gebundenen Zustand von Sav1866 bis zu 14 Å, 16 Å und 28 Å in BtuD, Hil470 und MetN in der Nukleotid-freien Form. Sie kann durch zwei Bewegungen beschrieben werden: Zunächst erfolgt eine Hinge-Rotation, welche die ABC-Domänen direkt nebeneinander positionieren, sodass die Grenzfläche geschlossen wird (tweezer-type Rotation). Anschließend folgt eine Translationsbewegung der ABC-Domänen entlang der Grenzfläche (twist-type Rotation). Diese Konformationsveränderungen in der NBD lösen rigid body Rotationen in den einzelnen TMDs aus, deren Details sich in den einzelnen TMD-Faltungen unterscheiden (siehe folgende Abschnitte). Durch diese Konformationsänderungen wird der Translokations-Pathway sequentiell geöffnet und geschlossen. Alle TMD-Faltungen inteagieren über koppelnde Helices innerhalb der Loops zwischen den TM- Helices mit der ABC-Domäne. Hierdurch können Konformationsänderungen in der ABC-Domäne Konformationsänderungen in der TMD induzieren (inter-subunit communication). Die koppelnde Helix der TMD verläuft ungefähr parallel zur Membrandoppelschicht und bindet in einen Oberflächenspalt zwischen der RecA-ähnlichen und der helikalen Subdomäne der NBD.

119 Im Fall der ABC-Importer enthalten die koppelnden Helices das Konsensusmotiv EAA. Obwohl sie strukturell unterschiedlich sind, existieren strukturell äquivalente koppelnde Helices in den Loops zwischen TM3 und TM4 der Typ1 Importer und den Loops zwischen TM6 und TM7 der Typ2 Importer. Die äquivalente Region in den Exportern befindet sich in ICL2, die zwischen den Helices TM3 und TM4 liegt und die ABC Domäne der anderen Untereinheit kontaktiert. In allen Strukturen ist an der Wechselwirkung zwischen ABC Domäne und TMD primär der Q-Loop der α-helikalen Domäne beteiligt. Dieser ist konformationell variabel und enthält ein konserviertes Gln, das in die Nukleotidbindung involviert ist (bildet H-Brücke mit dem γ-phosphat des ATPs). Er fungiert als Sensor für den Nukleotid-Zustand, wobei Veränderungen im Q-Loop vermutlich an der Kopplung zwischen Nukleotid-Hydrolyse und Konformationsänderungen innerhalb der TMD beteiligt sind. Kleine ABC-Importer Die ModB-Struktur zeigt eindeutig eine invertierte V-förmige Kavität, die zum Zytoplasma exponiert wird, während sich die ATPase Untereinheiten ModC in einer offenen, Nukleotid-freien Konformationen befinden. Dabei liegt das WalkerA Motiv der einen Untereinheit gegenüber dem LSGGQ Motiv der anderen Untereinheit, ohne dass die Untereinheiten gepaart sind. Das Bindeprotein ModA befindet sich in einer geschlossenen Konformation, in der das Substrat zwischen den zwei Hälften in einer Spalte eingeklemmt ist. ModA ist an die extrazellulären Loops von ModB angedockt, wodurch das Substrat direkt über den geschlossenen Eingang des Translokations- Pathways positioniert ist. Die ATPase Untereinheiten MalK bilden dahingegen ein geschlossenes Dimer, in der zwei Moleküle ATP an der Grenzfläche zwischen den Untereinheiten gebunden sind. Sie interagieren mit den Resten der WalkerA/B Motive in der einen Untereinheit und dem LSGGQ Motiv aus der anderen Untereinheit. Das Maltosebindeprotein MalE ist ebenso auf der periplasmatischen Oberfläche angedockt, befindet sich jedoch in einer geöffneten Konformation, weshalb es zur Bildung einer großen, bedeckten Kavität an der Grenzfläche zwischen den TM-Untereinheiten MalF und MalG beiträgt. Die ATP-Hydrolyse geschieht in der geschlossenen NBD-Dimer-Konformation. Es wurde gezeigt, dass die Öffnung des Bindeproteins auf der einen Seite der Membran mit der Schließung der Nukleotid- Binde-Fläche auf der anderen Seite der Membran verknüpft ist. MalE (auch MBP: Maltose-

120 Bindeprotein) stimuliert damit die ATPase Aktivität des Transporters. Die outward-facing Konformation kann als Übergangszustand betrachtet werden (siehe Abbildung). Nur in diesem ist MalE an den Transporter gebunden, nach der ATP-Hydrolyse dissoziiert er sofort wieder ab, wodurch die inward facing Konformation erreicht wird. Inward- und outward-facing Konformationen Die inward-facing Konformation (resting state) entspricht dem offenen Zustand des ABC- Transporters. Die Grenzfläche des NBD-Dimers wird durch die TMDs offen gehalten. In der Anwesenheit von ATP induzieren Interaktionen mit dem geschlossenen, Substrat-beladenem Bindeprotein den Übergang von der inward-facing zur outward-facing Konformation (transition state). Hier ist der zytosolische NBD-Dimer zwecks ATP-Hydrolyse dicht gepackt und die TMDs zum Periplasma hin geöffnet, um das Substrat aufnehmen zu können. Durch die starke Bindung des Bindeproteins wird diese Konformation stabilisiert. Nach ATP-Hydrolyse, öffnet sich der NBD Dimer erneut und der Transporter gelangt zurück in den resting state, wodurch das Substrat im Zytoplasma freigesetzt wird.

121 Induktion der outward-facing Konformation Aufgrund der Tatsache, dass die intrazelluläre ATP-Konzentration 10mal höher ist als der Km der meisten ABC-Transporter sind die Nukleotidbindestellen in vivo im resting state gesättigt. Die Schließung des NBD-Dimers benötigt nicht nur die ATP-Bindung, sondern auch die Bindung des Bindeproteins (gezeigt für MalE). Der resting state existiert auch in Abwesenheit von ATP, wenn das Bindeprotein gebunden hat (gezeigt für ModA). Translokations-Pathway Im resting state (outward facing Konformation) von ModBC-A ist das Substrat an das geschlossene Bindeprotein gebunden. Im Falle von MalFGK 2 -E befindet sich das Substrat an der Basis der TM- Kavität, ungefähr auf dem halben Weg durch die Lipid-Schicht. Im Maltose-Transporter ist der Translokations-Pathway durch die TM-Helices aus MalF und MalG vollständig vom Membranbilayer und durch MalE zum Periplasma hin abgeschirmt. Maltose wird in die Kavität durch ring-stacking und H-Brücken Interaktionen mit MalF gebunden. Translokations-Inhibition durch Substrat im Zytosol In den Strukturen von ModBC und MetNI wurden zusätzliche Substrat-Bindestellen gefunden, die in einer zur NBD C-terminal liegenden Domäne (modulatorische Domäne) lokalisiert sind. Sie zeigen ähnliche Binde-Eigenschaften wie die ATP-Bindestelle, da das Substrat ebenso an der Grenzfläche beider Domänen bindet.. Diese Strukturen zeigen eine wesentlich größere Entfernung zwischen den NBD-Domänen. Es handelt sich vermutlich um einen trans-inhibitions-mechanismus: Substrate binden an die ABC-Transporter und stabilisieren damit die inward-facing Konformation, indem sie die Dimerisierung der NBD verhindern. Dadurch wird der Übergang zur outward-facing Konformation und damit die Substrat-Translokation inhibiert. Für beide Transporter wurde gezeigt, dass die Anwesenheit des Substrats die basale ATPase Aktivität inhibiert. Die modulatorische Domäne in der ABC-Domäne von ModC ist ähnlich zu der in ModE, welche die Transkription des Transporters reguliert. Damit ist eine kurzzeitige und langzeitige Regulation auf Basis desselben Feedback Mechanismus möglich. Für eine Halb-Inhibition von MetNI (30 µm) ist eine

122 größere Substratkonzentration notwendig als für die von ModBC (5 µm), was auf eine höhere Zytotoxizität des Metalls hinweist. Rigid-Body Rotation der TMDs Werden die strukturell konservierten Helices TM2-4 der bekannten Strukturen übereinander gelagert können alle Konformationen durch eine Hinge-Rotation (20-30 ) ineinander übergeführt werden. Die Rotationsachse liegt dabei senkrecht zur Symmetrieachse des Transporters und befindet sich in der Nähe eines konservierten Pro-Restes am Knick der Helix TM2 in der Nähe der periplasmatischen Oberfläche. Durch solch eine rigid-body Rotation können inward-facing und outward-facing Konformationen ineinander übergehen. Große ABC-Importer Die Strukturen von BtuCD wurden in Anwesenheit und Abwesenheit des Bindeproteins BtuF gelöst. Ein Vergleich zwischen den Strukturen zeigt, dass sich beide in derselben offenen NBD-Dimer- Konfiguration befinden. Außerdem überlagern sich TM1-2 und TM6-10. Die größten strukturellen Unterschiede liegen damit in den inneren Subdomänen (TM4/5). In Abwesenheit von BtuF sind die zwei inneren Subdomänen symmetrisch und befinden sich in der outward-facing Konformation. In Anwesenheit von BtuF zeigen die Helices TM3-5a beider BtuC Untereinheiten unterschiedliche Konformationen: Die eine Konformation ist ähnlich zu der in Abwesenheit von BtuF (in Abbildung orange), während die Helices der anderen BtuC-Untereinheit um 20 rotieren (in Abbildung blau). Da TM5 an der BtuC Dimer-Grenzfläche liegt, hat die Rotation der inneren Subdomäne einen Substanziellen Einfluss auf den Translokations-Pathway. Somit sorgt die Bindung von BtuF an BtuCD für die Schließung des Translokations-Pathways auf beiden Seiten der Membran. Der Übergang von der outward-facing zur inward-facing Konformation beinhaltet eine Rotation um 9 entlang einer Rotationsachse senkrecht zur Symmetrieachse, was die Repositionierung der Helices TM3-5 und damit den gesamten Konformationsübergang induziert. HI1470/1 ist ein homologes Protein zu BtuCD. Hier sind die NBDs stärker separiert als in BtuCD und die TM-Kavität ist zum periplasma hin geschlossen, aber zum Zytosol hin geöffnet. Die Umorientierung des Translokations-Pathways zwischen BtuCD und HI1470/1 kann durch rigid-body

123 Bewegungen beschrieben werden (Rotation der inneren Subdomänen und 9 Twist der einen TMD in Bezug auf die andere). Diese drei Strukturen zeugen von einer hohen Flexibilität der inneren Subdomäne und ihrer Fähigkeit alternating access zu vermitteln. Die eben beschriebene Bewegung der inneren Subdomäne (TM3-5) wird durch Anwesenheit des Bindeproteins induziert. Um die Kommunikation zwischen NBD und TMD zu erklären ist eine zweite rigid body Rotation (TM1-2, TM6-10) notwendig, die von dem Nukleotid-Zustand abhängig ist. Die Modulation der inneren Subdomäne könnte notwendig sein, um große Substrate wie Vitamin B12 zu transportieren.

124 ABC-Exporter Die Struktur des Multidrug-Transporters Sav1866 aus Staphylococcus aureus war die erste hochauflösende Struktur eines ABC-Exporters. Die NBDs aus Sav1866 bilden einen geschlossenen Dimer mit gebundenem Nukleotid. Die TMDs sind in zwei Flügel innerhalb der äußeren Membranhälfte gespalten, wodurch die outward-facing Konformation stabilisiert wird. Jeder Flügel besteht aus TM1-2 aus der einen Untereinheit und TM3-6 aus der anderen. Die TM-Segmente werden durch lange intrazelluläre Loops (ICLs) verbunden. Im Gegensatz zu den Importern, deren koppelnde Helices eine einzelne NBD kontaktieren, enthält jede Sav1866-TMD zwei intrazelluläre Helices. Dabei kontaktiert ICL1 die NBDs beider Untereinheiten und ICL2 ausschließlich die NBD der benachbarten Untereinheit.

125 Da Exporter im Gegensatz zu den Importern kein Substrat-Bindeprotein aufweisen, wird ein anderer Mechanismus der Substrat-Bindung benötigt. Ein Unterschied zwischen Importern und Exportern sind die langen cytosolischen Ausdehnungen einiger TM-Helices. Arbeiten an humanem TAP indizieren, dass Substrate an eine hochaffine Stelle dieser Region binden. Dies könnte eine generelle Substrat-Binde-Domäne von ABC-Exportern darstellen, die analog zu den Substrat-Bindeproteinen der ABC-Importer sind. Für Hydrophobe Arzneistoffe wird außerdem angenommen, dass sie über die Bindung an die Membrandoppelschicht zum ABC-Exporter gelangen. Transport-Modell Importer und Exporter teilen sich einen gemeinsamen kinetischen Mechanismus, welcher die Nukleotid- und Substrat-abhängigen Konformationsänderungen und die daraus resultierende Substrat-Translokation vermittelt. Für alle ABC-Transporter wird das alternating access Modell angenommen. Dabei kann eine Substratbindestelle entweder auf der extrazelluläre oder die intrazelluläre Seite der Membran, in Abhängigkeit vom Konformationszustand, exponiert werden. Die Bindung und Hydrolyse von ATP treiben die Konformationsänderungen an und resultieren in einer alternierenden Exponierung der Bindestelle auf den zwei Seiten der Membran. Die relative Bindeaffinität der zwei Konformationen des Substrats determiniert größtenteils die Nettorichtung des Transports. Die outward facing Konformation eines Importes hat damit eine höhere Substrat- Affinität als die inward facing Konformation.

126 Grundzustand: In den meisten Fällen wird das Substrat durch ein hochaffines Bindeprotein dem ABC- Importer präsentiert. Das Substrat wird dabei zwischen den zwei Hälften des Bindeproteins gebunden. In der Abwesenheit von Substrat bleibt der Transporter in einer inward-facing Konformation (siehe HI1470/71 Struktur). In dieser Struktur ist auch kein Nukleotid gebunden; dies wird in vivo nicht auftreten, da die zelluläre ATP-Konzentration wesentlich höher als der KD Wert der NBDs ist. Der Grundzustand wird demnach ATP-gebunden sein, wenn auch die NBDs leicht separiert sind. Inward-facing Übergangszustand: Das Substrat-Bindeprotein dockt dann mit seinem Substrat an die TMD an (siehe ModBC Struktur). Aber auch hier enthält die Struktur kein Nukleotid. Das Docking und Sensing des Substrat-beladenen Bindeproteins induziert die Schließung der NBDs, gefolgt von einer Konformationsänderung. Die ModBC Struktur korreliert damit mit einem kurzlebigem Intermediat (Bindeprotein gedockt, NBDs offen). Outward-facing Übergangszustand: Die Konformationsänderung, die durch die Schließung der NBDs induziert wird, resultiert in einem Zustand, der in der Struktur des Maltose-Transporters festgehalten ist. Dieser Zustand entspricht einem arrestierten Übergangszustand, der durch Mutation des katalytischen Glutamats (E159Q) in beiden NBDs erzeugt wurde (ATP-Hydrolyse-Defizienz). Das Substrat-Bindeprotein ist hier weiter geöffnet als im Substrat-gebundenem Zustand. Ein Loop aus der TM-Domäne MalG exponiert in die Maltose-Bindetasche des Bindeproteins, was die Freisetzung des Substrats in die Kavität der outward-facing TMDs bewirkt. Dort bindet das Substrat in eine Tasche in der Nähe des Membranzentrums. Das Substrat ist hier in einem gefangenen Zustand und hat weder Zugang zur periplasmatischen noch zur intrazellulären Region. Weitere Zustände: Es folgt ein Übergang des Transporters in die inward-facing Konformation, welche der ATP-Hydrolyse vorangeht oder von ihr begleitet wird (ATP-Hydrolyse nicht bekannt: konzertiert, sequentiell, an welchem Schritt des Zyklus?). In diesem Zustand ist die Substratbindung geschwächt, was eine Freisetzung ins Zytosol ermöglicht.

127 Problem: Der abgeleitete Mechanismus stammt aus Strukturen unterschiedlicher Konformationszustände unterschiedlicher ABC-Transporter. Um sicher zu gehen, vor allem weil die Transporter sehr geringe Sequenz-Ähnlichkeiten aufweisen, sollten die unterschielichen Zustände eines einzelnen ABC-Transporters bestimmt werden. Einflüsse auf Translokationsrichtung Im idealisierten kinetischen Transportmodell bindet ATP an die outward-konformation und ADP an die inward-konformation des Transportes, wobei die ATP-Hydrolyse die Konvertierung der outward zur inward Konformation antreibt. Die Nettorate der Substrat-Translokation ist die Differenz zwischen Import und Export Raten. Importer haben somit einen maximierten Influx, während der Efflux minimiert ist. Die maximale Import-Rate bei minimaler ATP-Hydrolyse-Rate wird durch drei kinetische Tricks erreicht. (1) Höhere Affinität für das Substrat in der outward-facing Konformation (gerichteter Import). (2) Stimulation der ATPase-Aktivität durch Substrat-Bindung in der outward-facing Konformation (minimale unnötige ATP-Hydrolyse). (3) Höhere Nukleotidaustausch-Rate (ADP zu ATP) im Ligand-ungebundenen Zustand des Transporters (Transporter geht in Ausgangzustand für neuen Transportvorgang über). Für Exporter müssen genau die umgekehrten Beziehungen gelten. Um die unnötigen ATP-Hydrolysen zu minimieren, muss die ATP-Hydrolyse-Rate minimal sein, bis der Zustand des Transporters erreicht ist, an dem die ATP-hydrolyse die Substrat-Translokation antreibt. ATP-Hydrolyse Im Allgemeinen unterscheiden sich die ATPase- und Transport-Raten in 1-3 Größenordnungen voneinander. In Abwesenheit von Substrat kann sogar vollständig entkoppelte ATPase-Aktivität beobachtet werden.

128 Die enzymatische Hydrolyse von ATP benötigt die Anwesenheit von zwei gut positionierten Sequenz-Gruppen, welche die Phosphate binden und den nukleophilen Angriff von Wasser auf γ-phosphat katalysieren. Dabei binden die Motive Walker A und Walker B die Nukleotidphosphate bzw. das Mg 2+. Die Mg 2+ -Interaktion involviert hauptsächlich den Asp-Rest im Walker B Motiv. Bestimmte in der Nachbarschaft des spaltbaren Phosphats befindliche Reste fungieren als Base, welche den Angriff durch Wasser unterstützen (z.b. zum Walker B Motiv benachbartes Glu, Gln aus Q-Loop und His aus H-Motiv), während andere die Phosphat-Sauerstoffe elektrostatisch stabilisieren. Im Nukleotid-Hydrolyse-kompetenten Zustand bindet ein ATP-Molekül an die Grenzfläche zwischen zwei ABC Domänen. Die terminalen Phosphate des Nukleotids binden dabei zwischen dem P-Loop der einen ABC-Domäne und dem LSGGQ-Signaturmotiv der anderen. Damit werden für ATP- Bindung und Hydrolyse beide ABC-Domänen benötigt, weshalb individuelle ABC-Ubtereinheiten ATP nicht effizient binden und hydrolysieren können. Für ABC-Transporter ist damit eine Dimerisierung der ABC-Domänen notwendig (Vergleiche: AAA + -ATPasen benötigen Oligomerisierung). Es ist nicht bekannt, ob die ATP-Hydrolyse konzertiert oder sequentiell erfolgt. Folgende Abbildung zeigt ein sequentielles Modell.

129 Regulatorische Mechanismen von ABC-Proteinen ABC-Familien und assoziierte Funktionen/Erkrankungen Humane ABC-Proteine können in sieben Untergruppen (A bis G), basierend auf ihre AS-Sequenzen der NBDs klassifiziert werden.

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133 ABC-Proteine in Multidrug-Resistence und Lipid-Homeostase Multidrug-Resistence: Die MDR-Proteinfamilie ABC Transporter werden vor allem wegen ihrer Fähigkeit Arzneistoffe aus Säugerzellen exportieren zu können genau untersucht, da dies die Behandlung bakterieller Infektionen und Krebs stark behindert. Die physiologischen Substrate der Drug-Extruder sind nicht klar Es werden Funktionen in der Lipid-Homeostase vermutet. P-gp (P-Glykoprotein) liegt in drei Isoformen vor: humanes MDR1 (ABCB1) und MDR3 (ABCB4) sowie murines MDR2 (ABCB4), wobei MDR2 und MDR3 stark verwandt sind und vermutlich identische Funktionen aufweisen. Die Funktion von MDR1 MDR1/ABCB4/P-gp ist ein klinisch besonders wichtiges Glykoprotein, da es sowohl in Multidrug- Resistenzen von Krebszellen involviert ist als auch die pharmakokinetischen Eigenschaften verschiedener Arzneistoffe beeinflusst. Es handelt sich um ein Plasmamembran-ständiges Glykoprotein, das strukturell unterschiedliche chemotherapeutische Verbindungen (hydrophobe und positiv geladene) aktiv aus der Zelle exportiert und infolge der Behandlung mit Arzneistoffen überexprimiert wird. Mdr1 wird in der apikalen Membran vieler Epithel- und Endothelzellen sowie auf der Oberfläche von Tumorzellen exprimiert. MDR1 ist 1280 AS groß (170 kda) und besteht aus zwei symmetrischen Hälften, verbunden über eine kurze Linker-Region. Jede Hälfte besteht aus sechs TM-Helices, gefolgt von einer NBD. MDR1 ist der Key-Player für die Multidrug Resistenz bei Krebs und hat eine breite Substratspezifität. Die Abbildung zeigt typische Substrate für humanes MDR1. Die Funktion von MDR2 MDR2/ABCB4 (1279 AS) und MDR1 (1280 AS) haben eine Sequenzähnlichkeit von 86% und eine Sequenzidentität von 76%. Es katalysiert die Ausscheidung von Phosphatidylcholin und Cholesterin in die Galle bei Anwesenheit von Gallensalzen. Die Funktion von MDR2 wird für eine regulierte und

134 angemessene Gallen-Bildung benötigt. MDR2-defiziente Mutanten zeigen fast vollständige Abwesenheit von PC in der Galle, wodurch u.a. spontane Gallenstein-Bildung resultiert. Die primäre Funktion von Gallen-Phospholipid-Sekretion ist der Schutz der Zellmembranen vor Gallensalzen. Außerdem reduziert PC die Detergenzaktivität in Gallensalz-gemischten Micellen. Es wird angenommen, dass MDR2 den Transfer von PC aus der inneren in die äußere Hälfte der Plasmamembran vermittelt. Aber auch MDR1, das nicht in die physiologische PC-Sekretion innerhalb der Galle involviert ist, zeigt eine Translokationsaktivität für kurzkettige PC-Analoga. MDR2 transportiert langkettige PCs, die durch ein PC-Transfer-Protein gebunden werden, das zwischen äußerer Plasmamembran-Hälfte und Akzeptor-Liposomen innerhalb des Lumens hin und her shuttlet. Für einen PC-Export aus Membranen ist damit ein Akzeptor-Protein notwendig. MDR2 sekretiert in Anwesenheit von Gallensalzen Phospholipide (bevorzugt PC) sowie Cholesterol unter ATP-Verbrauch aus der Plasmamembran. Der MDR2-abhängige Lipid-Export wird durch die monomere Form der Gallensalze unterstützt, wobei das Ausmaß, mit dem der Lipid-Export erleichtert wird direkt mit dem Hydrophobizitätsindex korreliert. Es ist möglich, dass Gallensalz- Monomere nicht nur mit den sekretierten Phospholipiden, sondern auch mit der Oberfläche der MDR2-Kavität assoziieren und damit die Freisetzung der Phospholipide vermitteln. Multidrug-Resistence Aufgrund der hohen Sequenzidentität zwischen MDR1 und MDR2 sind konservierte Domänen zur Substrat-Erkennung sehr wahrscheinlich. Beide ABC-Proteine zeigen gemeinsame Substratspezifitäten bezüglich unterschiedlicher Arzneistoffe. Cholesterol stimuliert die basale (ohne Arzneistoffe) MDR1-ATPase Aktivität und wird als endogenes Substrat von MDR1 erkannt und transportiert. Abwesenheit von Cholesterol resultiert in einer reduzierten Transportaktivität und damit in einer Akkumulation von Arzneistoffen innerhalb der Zelle. Der Einfluss, den Cholesterol auf den Transport von Arzneistoffen (bzw. genauer: den KM-Wert der Bindung) hat, ist stark von dem Molekulargewicht des Arzneistoffs abhängig. Die Bindeaffinität von Arzneistoffen mit niedrigem MG ( ) wird erhöht. Die Bindeaffinität von Arzneistoffen mit MGs zwischen 800 und 900 wird nicht beeinflusst. Die Bindeaffinität von Arzneistoffen mit MGs über 1000 wird vermindert. MDR1 hat mehrere Arzneistoff-Bindestellen, die im Zentrum der Lipiddoppelschicht lokalisiert sind. Es existieren mindestens drei miteinander positiv kooperativ wechselwirkende Arzneistoff- Bindestellen. (1) H-Bindestelle (selektiv für Hoechst und Colchicin). (2) R-Bindestelle (selektiv für Rhodamin 123 und Anthracycline). (3) Bindestelle für Progesterone. Die Bindung eines Arzneistoffes an einer spezifischen Bindestelle stimuliert den Transport durch eine andere Bindestelle. Außerdem stimulieren Rhodmin 123 und Progesteron zusammen den Transport von Hoechst auf additive Art und Weise. Zusätzlich zu diesen drei Transport-assoziierten Bindestellen wurde von einer anderen Gruppe eine Bindestelle beschrieben, die regulatorische Einflüsse auf den Transport hat.

135 Cholesterol könnte direkt an die Arzneistoff- Bindestelle binden oder sie allosterisch so beeinflussen, dass sie ihre Größe an den Arzneistoff anpasst. Da der Transport von Arzneistoffen mit MGs von nicht durch Cholesterol beeinflusst wird, passen solche höchstwahrscheinlich am besten in die Bindetasche. Kleine Arzneistoffe ( ) könnten zusammen mit Cholesterol (MG 386,7) in die Bindetasche binden, sodass Cholesterol den leeren Raum füllt und die Bindung zwischen kleinem Arzneistoff und MDR1 verstärkt. Für die Erkennung unterschiedlicher Arzneistoff-Größen sind der AS-Rest His61 und die benachbarten Reste der TM1 entscheidend. Austausch von His61 mit größeren AS erhöht die Resistenz gegen kleine Arzneistoffe, während es die Resistenz größerer Arzneistoffe verringert. TM1 scheint damit ein Teil der Arzneistoff-Bindestelle zu bilden und die Größe dieser Bindestelle ist entscheidend für die Erkennung der Arzneistoffe. Vergleich zwischen MDR1 und MDR2 mit anderen ABC-Proteinen ABCA1 überträgt Phospholipide und Cholesterol auf Lipid-freien ApoA-I, um pre-β-hdl zu erzeugen. Es wird angenommen, dass die Erkennung der Phospholipide durch ABCA1 über die Cholin- Kopfgruppen erfolgt (ATPase-Aktivität bei Anwesenheit von PC oder Sphingomyelin in vitro). ABCA1 transportiert PC und Cholesterol aus nicht-raft-domänen (in vivo erhöht sich Cholesterol-Export, wenn Sphingomylein-Gehalt reduziert wird). ABCG1 transportiert im Gegensatz dazu bevorzugt Sphingomyelin und Cholesterol auf HDL. Entweder werden Cholesterol und SM zusammen als Substrat erkannt oder der Cholesterol- Transport erfolgt aus Raft-Domänen.

136 MDR2 exportiert PC und Cholesterol in Anwesenheit von Gallensalzen. Cholesterol könnte auch direkt an die Arzneistoff-Bindestelle von MDR1 binden, um die Ekrennung kleinerer Arzneitsoffe zu erleichtern, wobei Cholesterol nicht von MDR1 transportiert wird. Die Form der Substratbindetasche innerhalb dieser ABC-Proteine könnte zwecks Erkennung von Cholesterol konserviert sein. Multidrug-Resistence: Die MRP-Proteinfamilie Die Familie der MRPs (Multidrug resistence releated proteins) umfasst mindestens 9 Proteine (MRP1-9), die alle zu der ABCC-Familie gehören und 1325 bis 1525 AS aufweisen. MRPs können anhand der Anwesenheit oder Abwesenheit einer N-terminalen Transmembranen Domäne klassifiziert werden. Während MRP1,2,3,6,7 eine solche zusätzliche Domäne aufweisen und damit in der Lage sind Konjugate zu transportieren, liegt sie in MRP4,5,8,9 nicht vor, weshalb diese Spezifitäten für cyclische Nukleotide aufweisen. Die einzelnen MRP-Moleküle haben Gewebs-spezifische Expressionsmuster, unterschiedliche Substratspezifitäten und verschiedene physiologische sowie pharmakologische Funktionen. Übersicht über die Funktionen von MRP1 und MRP2 MRP1 wird in fast allen Hauptgeweben und peripheren Blutzelltypen exprimiert, wobei sich der Expressionsgrad unterscheiden kann. Natürliche Arzneistoffe sind Substrate für MRP1, wobei MRP1 und P-gp teilweise überlappende Substrat-Spezifitäten aufweisen. Dennoch gibt es einen gravierenden Unterschied in der Substrat-Spezifität: P-gp kann Arzneistoffe in der ursprünglichen Form transportieren, während MRP1 Glutathion (GSH), oxidiertes Glutathion (GSSG) sowie eine Vielzahl von GSH-, Glucuronsäure- und Sulfat-Konjugate von Arzneistoffen transportiert. Physiologische Substrate von MRP1 sind z.b. Gallensäure-Sulfate, Prostaglandin A-GSH Konjugate und unkonjugiertes Bilirubin. Im Gegensatz dazu zeigt P-gp nur schwache Resistenz gegen diese organischen Anionen. MRP1-Substrate sind auch neutrale und basische zytotoxische nichtkonjugierte Verbindungen, wobei intrazelluläres GSH für den Transport dieser Substrate essentiell ist. MRP1 könnte die Beschädigung der Zelle durch Xenobiotika über einen Co-Export mit GSH reduzieren. GSH beschleunigt nicht nur den MRP1-vermittelten Transport von hydrophoben Xenobiotika, sondern auch den von hydrophilen Endobiotika. MRP1 hat eine geringe Affinität zu GSH, wobei diese Affinität durch die Anwesenheit bestimmter Arzneistoffe erhöht wird. MRP2 nimmt im Vergleich zu den anderen MRPs, die alle innerhalb der basolateralen Membran polarisierter Zellen lokalisiert sind eine Sonderstellung ein. MRP2 liegt in der apikalen Plasmamembran spezialisierter polarisierter Zellen (z.b. Hepatozyten und Darmzellen) vor. Als primäre physiologische Funktion wird der Export amphiphiler organischer Anionen und Xenobiotika in die Galle und den Lumen exkretorischer Organe angenommen. MRP1 und MRP2 haben 49% Sequenzidentität, weshalb auch ähnliche Substrat-Sepezifitäten vorliegen, wobei es auch Resistenzen zu Xenobiotika vermittelt, die MRP1 nicht transportieren kann. Folgende Tabelle gibt eine Übersicht über die neun MRPs und ihre Substrate.

137 Einfluss von MRPs auf die Arzneistoff-Pharmakokinetik MRPs können zahlreiche strukturell unterschiedliche Verbindungen, darunter therapeutische Arzneistoffe und ihre Metaboliten über Zellmembranen transportieren. Damit spielen sie eine wichtige Rolle bei der Absorption, Verteilung und Eliminierung vieler therapeutischer Agenzien im Körper. Viele oral eingenommene Arzneistoffe müssen verschiedene Barrieren überwinden, bevor sie ihr Ziel erreichen. Zunächst müssen sie das Darmepithelium passieren. ABC-Exporterder apikalen Membran wie P-gp und MRP2 treiben die Verbindungen von der Zelle zurück ins Darmlumen, wodurch die Absorption ins Blut verhindert wird. Arzneistoffe, die das Blut erreichen, passieren die Leber, wo sie metabolisiert werden und anschließend mit der Galle, oft über MRPs sezerniert werden. Veränderungen der MRPs können ebenso Auswirkungen auf die Verteilung der Arzneistoffe haben, wodurch ihre therapeutische Wirkung bzw. Toxizität verändert wird. MRPs stellen eine Schutz- Barriere des Gehirns innerhalb der Blut-Hirn Schranke dar. MRP4-Defizienz bewirkt so eine beschleunigte Akkumulation bestimmter Arzneitstoffe im Gehirn-Gewebe, wodurch Erkrrankungen des ZNS besser therapiert werden können. MRPs erhöhen die Fähigkeit von Tumorzellen

138 chemotherapeutische Agenzien zu exportieren, was die zelluläre Arzneistoff-Konzentration senkt und die Resistenz gegen Antik-Krebs Arzneimittel erhöht. ABC-Proteine in der Lipid-Homeostase Die Funktion von MDR1 und MRP1 als Exporter von Arzneistoffen ist nicht ausschließlich auf Selbstschutz gegen Xenobiotika zurückzuführen. Membranlipide bewegen sich zwischen verschiedenen Organellen innerhalb von Zellen und können ebenso von der Leber zu verschiedenen Geweben transportiert sowie ins Darmlumen sekretiert werden. In solchen Prozessen spielen zahlreiche ABC-Proteine eine Rolle. MDR2 und ABCB11 sind in die Gallen-Bildung als Transporter für PC und Gallen-Salze involviert. ABCA1 wird für die Bildung von HDL benötigt. ABCA2 könnte in die Myelin-Scheide generierende Lipid-Bewegung involviert sein. ABCA3 ist in die Biogenese lamellarer Körper (bzw. ähnliche Strukturen) involviert, in denen Phospholipide und Cholesterol gespeichert werden. ABCG5 und ABCG8 sekretieren pflanzliche Sterole in das canaliculare Lumen. Lipid-Flippasen, -Floppasen und -Extruder Übersicht (1) MDR3 = PC-Flippase (Transport von der zytoplasmatischen Hälfte auf die exoplasmatische Hälfte der Membran). (2) MDR1 = Lipid Flippase mit breiter Spezifität. (3) MRP1 = Lipid Floppase (Transport von der exoplasmatischen Hälfte auf die zytoplasmatische Hälfte der Membran.

139 (4) Pdr5p = Lipid Flippase mit breiter Spezifität (PDR-Familie von ABC-Transportern in S.ceriviseae enthält 10 full-length Transporter). Lipid-Transport über Membranen Die Mechanismen, mit denen Lipide über biologische Membranen transportiert werden (flip-flop- Reaktionen) sind wenig verstanden. Lipid-Flip-Flops in Modelllipiddoppelschichten sind extrem langsam mit Halbwertszeiten von Stunden bis Tagen. In biologischen Membranen sind diese Reaktionen sehr schnell (HWZ: Sekunden). In Eukaryoten wurden zahlreiche Proteine identifiziert, welche flip-flop Reaktionen verschiedener Lipidklassen katalyiseren, während in Prokaryoten bisher nur MsbA als Flippase identifiziert wurde. Es ist unsicher, ob die flipflop Reaktion ATP-abhängig oder ATP-unabhängig ist. ATP-unabhängige Flipflop-Reaktionen kurzkettiger Lipide werden z.b. durch α-helikale Transmembranpeptide katalysiert. Andererseits zeigen einige ABC-Transporter (z.b. MDR1 in vitro) eine ATP-abhängige Flippase Aktivität. Es wird angenommen, dass MsbA den Lipid-Transport (Ra-Lipid A und Phospholipide) über die innere Membran gram negativer Bakterien katalysiert, um so den Transport von Lipiden aus der Zelle über das Periplasma zur äußeren Membran zu unterstützen (Transport von zytosolischer Hälfte zur periplasmatischen Hälfte). MsbA ist ein essentielles IM Protein, dessen Mutation letal für die meisten gram negativen Bakterien ist. Eine MsbA-Defizienz resultiert in einer Akkumulierung von neu synthetisiertem LPS und Phospholipiden innerhalb der zytosolischen Hälfte der inneren Membran, wodurch Membran-Einschnürungen und Faltungen entstehen. Die Struktur zeigt MsbA, gebunden an Ra-LPS in einem post-hydrolysierten Zustand (ADP-Vanadat). Ra-LPS ist an einer periplasmatischen Stelle der TMD gebunden (post-flipped Konformation).

140 Strukturen von MsbA Für die Lipid-Flippase MsbA liegen vier Strukturen vor, zwei Apo-Formen und zwei Nukleotidgebundene Formen. Die Nukleotid-gebundenen Strukturen zeigen ähnlich wie Sav1866 eine outward-facing Konformation. Die beiden Apo-Formen sind beide inward-facing, zeigen aber unterschiedliche Ausmaße der Domänen-Separation. Zwei Helices (TM4-5) kreuzen die Dimer-Grenzfläche und assoziieren mit der gegenüberliegenden Untereinheit. So erfolgt die Interaktion zwischen der koppelnden Helix und TM4-5 (ICL2) der anderen Untereinheit in der Apo sowie der Nukleotid-gebundenen Form. In der offenen inward Konformation sind die NBDs weit voneinander entfernt. Der Übergang von der offenen Apo-Form in die geschlossene Apo-Form beinhaltet das Schwenken der TM4-5 Helices um 30 über eine Hinge-Region, die durch die extrazellulären Loops ECL2 und ECL3 gebildet werden. In dieser geschlossenen Apo-Form befindet sich das WalkerA Motiv der einen Untereinheit gegeünüber dem WalkerA Motiv der anderen Untereinheit (fehlausgerichtete Konformation; normal: Walker A gegenüber von LSGGQ). Um von der so gebildeten intermediären geschlossenen Apo Form zum kanonisch geschlossenen NBD-Dimer zu gelangen ist eine Translation der zwei NBDs entlang der Dimer-Grenzfläche notwendig. Diese ist mit einer Drehbewegung der TMDs gekoppelt, welche TM3-6 von TM1-2 derselben Untereinheit wegdrückt, um die outward-facing Konformation zu bilden. Während in der inward Konformation die Helices TM1-3 und TM6 der einen Untereinheit und TM4 sowie TM5 der anderen Untereinheit dich gepackt sind, so liegen in der outward-facing Konformation nun Helices TM1 und TM2 der einen und Helices TM3-6 der anderen Untereinheit zusammen.

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142 Mechanismus Flip-Flops in Eukaryoten Es existieren MsbA Homologe in fast allen Spezies, einschließlich P-Glykoprotein/MDR1 (ABCB1), das in humanen Krebszellen überexprimiert wird und für die beobachtete Multidrug-Resistenz verantwortlich ist. Die Bedeutung von MDR Proteinen und anderen ABC-Transportern im Lipid- Trafficking in Eukaryoten ist gut verstanden. MDR2 ist z.b. für die Sezernierung von Phospholipiden in die Galle verantwortlich. In eukaryotischen Zellen ist das Trans-Bilayer Lipid-Flipping möglicherweise Voraussetzung für das Vesikel-Budding und damit für alle exozytotischen und endozytotischen Prozesse, da starke lokale Membrandoppelschicht-Asymmetrien Deformationen induziert, die Ausgangspunkt des Vesikel- Buddings mithilfe von Clathrin, COPI und COPII sind. Es gibt verschiedene Kandidaten für Flippasen, welche zurzeit nur hypothetische Membranproteine darstellen. Der beste Kandidat sind die P 4 -ATPasen, eine Subfamilie der P-Typ ATPasen Superfamilie. Der ABC-Kanal CFTR ABC-Transporter können drei verschiedene Funktionen aufweisen. Sie können als Kanal, als Rezeptor oder als Transporter fungieren. Das Glykoprotein CFTR/ABCC7 (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; 1480 AS, 160 kda) ist das einzige ABC-Protein, für das eindeutig gezeigt wurde, dass es als Kanal fungiert. Es handelt sich um einen Spannungsunabhängigen Chlorid-Kanal, der in Plasmamembranen von Epithelzellen vieler Gewebe vorkommt und die Hauptrolle bei der Regulation des Chlorid-Stroms und Salz-Transports innerhalb von Atmungs-, Darm- und anderen Epithelgeweben von Säugern spielt. Der Kanal ermöglicht einen gleichmäßigen Fluss von Chlorid-Ionen in beide Richtungen mit durchschnittlichen Raten

143 (Leitfähigkeit unter 10 ps). Negativ geladene Ionen wie Chlorid akkumulieren dabei zunächst in der Nähe positiv geladener CFTR-Regionen an beiden Enden der Pore. Infolge der Poren-Öffnung durch ATP-Bindung erfolgt der Ionen-Fluss über die Membran. Zusätzlich zur Chlorid-Kanal Aktivität agiert CFTR als Regulator für den Chlorid-Kanal ORCC (outwardly rectifying Cl channel) sowie einem epithelialen Natrium-Kanal. Es handelt sich um ein ABC-Protein mit einer einzigen Polypeptidkette und der Domänenarchitektur TMD1-NBD1-R-TMD2-NBD2. Die regulatorische R-Domäne verknüpft damit die zwei Proteinhälften miteinander. Darüber hinaus können zwei CFTR Kanäle über ihr C-terminales PDZ-Domänen-Bindemotiv assoziieren, wobei CFTR ein funktionaler Monomer darstellt. Nur die Nukleotidbindestelle 2 ist zur Hydrolyse fähig ATPase getriebenes CFTR-Gating könnte dadurch ermöglicht werden, dass die ATP-Hydrolyse an der einen NBD die Öffnung und die ATP-Hydrolyse an der anderen NBD die Schließung des Kanals kontrolliert. Dieses Modell basiert auf einer Echtzeit-Beobachtung der Kopplung zwischen Hydrolyse und Gating. Dabei wurden individuelle hydrolytische Ereignisse in Echtzeit durch Aufzeichnung des Kanal-Gatings verfolgt (1994, 1995). Dieses Modell benötigt Energie-Transduktionswege, die auf unbekannte physikalische Prinzipien beruhen und ausschließlich durch die Effekte verschiedener Nukleotide auf die Aktivität des CFTR-Kanals zurückzuführen sind. Damals wurde angenommen, dass beide NBDs auch zur ATP-Hydrolyse fähig sind, ähnlich wie bei P-gp. Dieses Modell ist allerdings veraltet. Aktuelle Modelle beziehen den Befund mit ein, dass nur eine der beiden ATP-Bindestellen im Protein hydrolytisch ist. Es wurde gezeigt, dass die Nukleotidbindestelle 1 eine nichthydrolytische, stabile ATP-Bindestelle darstellt, während die Nukleotidbindestelle 2 zur Hydrolyse fähig ist. Dieses Phänomen ist nicht einzigartig bei CFTR, sondern tritt auch in anderen Mitgliedern der ABCC Unterfamilie auf (MRPs und SURs).

144 Der Grund hierfür ist ein Unterschied in der NBD1-NBD2 Interaktion im Vergleich zu anderen ABC- Proteinen. Die zwei erwarteten Nukleotid-Bindestellen zeigen eine Asymmetrie, was die geringe Identität von 27% zwischen NBD1 du NBD2 aus CFTR wiederspiegelt. Während sich in der Nukleotidbindestelle 2 alle Konsensus-Sequenzen, wie für die anderen ABC-Transporter beschrieben befinden, so ist die Nukleotidbindestelle 1 zurückgebildet. Sie enthält nicht-kanonische Reste im Walker B Motiv (Ser statt Glu) und im H-Loop (Ser statt His) der NBD1 und im Signatur-Motiv (LSHGH statt LSGGQ) der NBD2. Im Fall von CFTR nimmt NBD1 die erwartete Konformation ein, weist aber einen zusätzlichen Loop innerhalb der ABC-spezifischen β-region aus, der in keiner anderen NBD gefunden wurde (Position und Struktur unklar). ATP-Bindung als treibende Kraft für die Kanal-Öffnung Aktuell wird angenommen, dass CFTR ein Ligand-abhängiger Kanal ist, der sich nur von anderen Ligand-abhängigen Kanälen dadurch unterscheidet, dass die Hydrolyse des Liganden zu einer schnellen Freisetzung des Substrats führt, wodurch der Transportzyklus beendet wird (2007). In diesem Modell geschieht das CFTR-Gating über durch ATP-Bindung induzierte Übergänge zwischen einer offenen und einer geschlossenen Konformation. Neben ATP können ein breites Spektrum von Nukleotid-Triphosphate (GTP, ITP, UTP, CTP, AMP-CPP und 8-Azido-ATP) binden und die offene Konformation induzieren. Die Basis der allosterischen Theorie beinhaltet eine klare Trennung zwischen zwei verschiedenen Prozessen: Ligand-Bindung und strukturelle Übergänge zwischen verschiedenen funktionellen Zuständen. Die molekularen Details der allosterischen Übergänge sind nicht gut verstanden. Jedoch existiert kein Anhaltspunkt dafür, dass ATP-Hydrolyse als Energiequelle für das Gating verwendet wird. Die durch ATP-Hydrolyse frei werdende Energie wird von CFTR nicht verwendet. Es existiert hier keine energetische Kopplung zwischen ATP-Hydrolyse und Transport. Vielmehr bewirkt die ATP- Bindung eine Konformationsänderung im Protein, die mit der Öffnung des Kanals einhergeht in der Literatur ist dies als strukturelle Kopplung beschrieben. Auch bei anderen ABC-Proteinen treibt die Energie der ATP-Bindung direkt den gesamten hydrolytischen Zyklus an. Die ATP-Hydrolyse selbst ist für den Prozess nicht relevant. Die Spaltung der Bindung zwischen β- und γ-phosphat hat keine Auswirkung auf die Konformationsänderungen, da die frei werdende Energie nur für die Bildung einer neuen Bindung verwendet werden kann oder in Form von Hitze abgestrahlt wird. Diese Gedanken sind wichtig für die Interpretation des Einflusses der CFTR-Nukleotid-Interaktion auf das Kanal-Gating.

145 Es gibt auch Systeme, in denen ATP-Hydrolyse mechanische Arbeit verrichtet. Hier ist der Grund für diese Arbeit jedoch der konformationelle Unterschied zwischen ATP-gebundenem und ADP-gebundenem Zustand des Proteins und nicht die Energie der chemischen Phosphat-Bindung. Die Hydrolyse ist hier ein Power-Switch, keine Power- Source. Die strukturelle Kopplung zwischen ATP-Bindung und Kanal-Öffnung korreliert mit der Bildung einer H-Brücke zwischen interagierenden Resten während der Öffnung des Kanals (R555 äquivalent und T1246 äquivalent prokaryotischer NBDs) innerhalb der dimerisierenden NBDs (wenn beide ATPs gebunden haben). Dadurch wird eine zyklische und dynamische Umstrukturierung der NBD1-NBD2 Schnittstelle während des Gating-Zyklus ermöglicht. Eine Analyse von über NBD-Sequenzen ergab, dass eine Koevolution des H-Brückendonors und Akzeptors stattfand (wird der Akzeptor kleiner, so wird der Donor größer und umgekehrt), sodass angenommen werden muss, dass diese strukturelle Eigenschaft auch für andere ABC-Proteine eine Rolle spielt. Konformationszustände sind im thermischen Gleichgewicht Da die ATPase Domäne sehr wahrscheinlich eine Schnittstelle für Energie-Input darstellt (durch Bindung, nicht Hydrolyse!), entstand die Hypothese, dass die konformationellen Übergänge im CFTR- Gating im thermodynamischen Nichtgleichgewicht stehen. Es wurde jedoch über die Beobachtungen Temperatur-abhängiger Übergänge zwischen verschiedenen Gating-Zuständen gezeigt, dass diese tatsächlich im thermodynamischen Gleichgewicht stehen, wie auch für gewöhnliche Kanäle: Hier verändern Ligand-Bindung oder Änderungen im elektrischen Feld die strukturelle Konfiguration des geschlossenen Zustands, was mit dem Transport assoziierte, thermisch getriebene Konformationsänderungen ermöglicht. Es existiert kein Widerspruch zwischen der Irreversibilität der ATP-Hydrolyse und dem thermischen Gelichgewicht des CFTR-Gatings, solange die Wahrscheinlichkeit der ATP-Bindung in jedem Zustand gleich ist. In der allosterischen Theorie müssen immer zwei verschiedene Prozesse betrachtet werden: Die Ligand-Bindung ist der Signal-bildende Prozess, während der Übergang zwischen offener und geschlossener Konformation die funktionale Antwort auf dieses Signal darstellt. Der zweite Prozess kann genau gemessen werden und ist tatsächlich ein thermisch getriebener, reversibler Prozess (Übergänge in beiden Richtungen erfolgen mit selber Häufigkeit). ATP-Hydrolyse dient der Relaxation des Systems und bewirkt Kanal-Schließung Die Kanal-Öffnung unter nicht-hydrolytischen Bedingungen erfolgt langsamer, als unter hydrolytischen Bedingungen (kinetischer Unterschied einer Größenordnung in der Öffnungs- Frequenz = zusätzliche Energiebarriere von 2,3RT = 5,8 kj/mol). Die Kanal-Öffnung ist jedoch nicht von der ATP-Hydrolyse abhängig, da sie auch unter nichthydrolytischen Bedingungen erfolgt (auch in Abwesenheit der NBD2). ATP-Hydrolyse ermöglicht vielmehr sich wiederholende Zyklen des Kanal- Gating, indem sie den geschlossenen Zustand wiederherstellt (ATP wird zu ADP mit geringer Affinität zur NBD, sodass ADP abdissoziiert). Da ATP in hohen Konzentrationen innerhalb der Zelle vorliegt, erfolgt die Dissoziation und damit die Kanal-Schließung nicht ohne die ATP-Umwandlung in ein nieder-affineres Produkt. Die Kanal- Öffnung korreliert mit der Michaelis-Menten Kurve der ATP-Bindung, deren KM-Wert bei 50 µm liegt. Die zelluläre ATP-Konzentration liegt im millimolaren Bereich, wodurch ein ständig geöffneter Zustand resultiert. Unter hydrolytischen Bedingungen wird ADP produziert, das aufgrund der unterschiedlichen chemsichen Struktur schnell aus der Bindung dissoziiert, da die Bindung

146 hauptsächlich über den γ-phosphatrest erfolgt. Obwohl wie beschrieben die Nukleotid-Analoga AMP-PNP oder ATP-yS die Öffnung des Kanals infolge ihrer Bindung induzieren, erfolgt hier die Kanal- Schließung wesentlich lansgamer, da diese Analoga schwer hydrolysierbar sind. Modell für das Kanal-Gating Unter Berücksichtigung der Bedeutung von ATP-Bindung und ATP-Hydrolyse kann ein Modell für das Kanal-Gating aufgestellt werden. Die Abbildung zeigt Übergänge zwischen hypothetischen Zuständen auf einer hypothetischen Zeitkurve, die im thermischen Gleichgewicht stehen. Das Modell beschreibt den hydrolytischen Pathway im CFTR-Gating. Der aktivierte CFTR* Zustand (offener, Transport-vermittelnder Zustand) entspricht dem Doppel- ATP-gebundenen Zustand, wenn die R-Domäne phosphoryliert ist. Die Wahrscheinlichkeit der Kanal-Öffnung, also des CFTR* Zustands entspricht direkt der Wahrscheinlichkeit, dass beide Bindestellen mit ATP besetzt sind. Die einzelnen konformationellen Zustände können damit reduziert werden auf einen offenen und einen geschlossenen Zustand, die reversibel ineinander übergehen können. Der CFTR* Zustand ist dabei kurzlebig (im Bereich von 1s), während der geschlossene Zustand langlebig ist (1s und länger). Letzterer resultiert nicht nur durch ATP-Hydrolyse, sondern auch durch eine falsche Orientierung des Liganden in der Bindetasche oder einer vollständigen Dissoziation sowie einer Unterbrechung des Signaltransduktionsweges (beobachtet mit nichthydrolysierbaren Analoga = nicht-hydrolytischer Pathway). Es sind nur zwei hydrolytischerzwungene Kanal-Schließungen in der Abbildung gezeigt, wobei insgesamt sechs Mechanismen experimentell beobachtet wurden, welche die Öffnung des Kanals unterbrechen. Konformationsänderungen innerhalb der zwei NBDs infolge der ATP-Bindung und ATP-Hydrolyse tragen direkt zur Kanal-Öffnung bei, so wie diese Prozesse bei anderen ABC-Transportern zum aktiven Transport beitragen. Die ATP-vermittelte Dimerisierung der zwei NBDs ermöglicht einen Übergangszustand auf dem Weg zur Kanal-Öffnung. Die ATP-Bindung an der Nukleotidbindestelle 2 stärkt die Assoziation zwischen den Domänen, welche schon durch das stabil gebundene Nukleotid

147 an der Nukleotidbindestelle 1 begünstigt wird. Die Gating-Übergangszustände werden jedoch nicht direkt durch NBD-Dimer Bildung und Dissoziation kontrolliert, da sie auch in Abwesenheit der NBD2 (mit niedriger Frequenz) auftreten. Die CFTR-Pore Die Poren-bildenden Komponenten des CFTR-Kanals sind nicht bekannt. Es wird angenommen, dass TM6 der TMD1, deren cytoplasmatische Verlängerung TMD1 mit NBD1 verbindet, bei der Kanal- Bildung beteiligt ist. TM6 enthält mindestens drei basische Reste: Arg334 und Lys335 am extrazellulären Ende sowie Arg347 vier helikale Windungen näher am Zytoplasma. Arg347 bildet eine Salzbrücke mit einem Asp-Rest in TM8 und ist damit nicht in Richtung Pore ausgerichtet, wie zunächst vermutet wurde. Es wird angenommen, dass die positiven Ladungen in Arg334 und Lys335 den Eingang von Anionen in den äußeren Korridor unterstützen und Thr338, eine helikale Windung weiter, die Pore auskleidet. Die Selektivität von CFTR für die verschiedenen kleinen monovalenten Anionen ist wie in den meisten anderen Chlorid-Kanälen sehr schwach. Größere halogene Anionen, die ihre Hydrathülle leichter abwerfen können, werden sogar effizienter als Chlorid transportiert. Aufgrund der geringeren Avidität zu Wasser verweilen diese auch länger in der Pore und kompetieren damit effizient den Chlorid-Fluss. Diese Charakteristika deuten auf eine eher weniger besondere Kanalauskleidung hin, wo keine Bereiche direkte Kontakte mit den permeierenden Chlorid-Ionen eingehen.

148 Kalium-Kanäle weisen im Gegensatz dazu einen Selektivitätsfilter aus Rückgrat-Carbonyl- Sauerstoffatomen auf. Dieser lässt ausschließlich Kalium, nicht aber Natrium passieren. Die Notwendigkeit einer solchen exakten Differenzierung zwischen ähnlichen Ionen ist für Chlorid- Kanäle nicht vorhanden, da sie lediglich zwischen Chlorid (und Bicarbonat) und den wesentlich größeren Anionen wie Phosphat und Sulfat unterscheiden müssen. Die Abbildung zeigt ein spekulatives Strukturmodell, basierend auf der 2D Struktur und Sequenz von CFTR sowie den bekannten 3D Strukturen anderer ABC-Transporter. Regulation von CFTR über Phosphorylierung Einzigartig für ein ABC-Protein hat CFTR eine zusätzliche regulatorische Domäne (R-Domäne), die durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung reguliert wird. Die Kanal-Aktivität wird infolge der Phosphorylierung um mindestens das 100fache erhöht. Wenn kein Chlorid-Transport für die Salz-Sekretion oder Reabsorption benötigt wird, hält eine Phosphatase-Aktivität CFTR in einem unphosphorylierten und damit inaktiven Zustand. Wird die Chlorid-Permeabilität benötigt, erhöhen bestimmte Agonisten die camp Konzentration, was die PKA aktiviert. PKA vermittelt nun die Phosphorylierung der R Domäne, wodurch das ATP-abhängige Kanal-Gating ermöglicht wird. Ein Ionen-Kanal, der durch die Bindung eines Liganden reguliert wird, dessen Konzentration kaum Schwankungen unterliegt, muss zusätzlich auf einem anderen Level reguliert werden, um einen kontinuierlich aktivierten Zustand zu vermeiden. Während ABC-Transporter ihre Substrate abhängig von ihrer Verfügbarkeit transportieren, so können Ionen-Kanäle ausschließlich sinnvolle Funktionen erfüllen, wenn das Gating an- und ausgeschaltet werden kann. Dies wird durch Bindung an einen Liganden (ligand-gating) oder Änderungen im Membranpotential (voltage-gating) ermöglicht. Ligand-abhängige Kanäle erkennen Änderungen in der Ligand-Konzentration. Dies ist jedoch für CFTR nicht möglich, da die Konzentration von ATP im niedrigen millimolaren Bereich konstant gehalten wird, weshalb er ohne weitere Kontrolle konstant im offenen Zustand vorläge. Die Modifikation durch Phosphorylierung, wie sie auch für andere Ionenkanäle (Ligand- und Spannungs-abhängige) auftritt, ist im Fall von CFTR weniger absolut. Sie ist vielmehr Grundvorraussetzung für die Konformationsänderung infolge der Ligand-Bindung, welche den geöffneten Zustand ermöglicht: Die Transduktion des konformationellen Signals zur Kanalöffnung durch ATP-Bindung, kann erst erfolgen, wenn die R-Domäne im phosphorylierten Zustand vorliegt. Die R-Domäne besteht aus ca. 200 AS und verbindet die NBD1 mit der TMD2. Innerhalb der R-Domäne von CFTR befindet sich ein großes Cluster von Konsensussequenzen (phosphorylation control module; PCM) zur Phosphorylierung an Serinen durch die camp abhängige Protein Kinase A. Die unphosphorylierte R-Domäne hat einen inhibitorischen Effekt, der infolge der Phosphorylierung aufgehoben und in einen stimulierenden Effekt gewandelt wird. Welche Auswirkungen die verschiedenen Phosphorylierungsstellen auf die Aktivität haben ist unklar. Einige haben einen größeren Einfluss als andere. Insgesamt 15 Stellen müssen entfernt werden, damit der Kanal nicht mehr durch PKA reguliert werden kann. In vivo wurden bisher bis zu 6 Stellen im phosphorylierten Zustand gefunden. Mindestens 2 Phosphorylierungsstellen haben anstatt einen aktivierenden einen inhibitorischen Effekt auf die Kanal-Aktivität.

149 Neben PKA sind auch Ca 2+ -abhängige und unabhängige Isoformen der PKC in der Lage bestimmte Stellen innerhalb der R-Domäne zu phosphorylieren. CFTR-Phosphorylierung durch PKC selbst resultiert zwar nur in einer moderaten Kanal-Aktiviterung, potentiert sich allerdings und könnte eine Bedingung für die anschließende Kanal-Aktivierung durch PKA darstellen. Die R-Domäne ist zwischen verschiedenen Spezies konserviert, kommt jedoch in keinen anderen Proteinen vor, sodass die Struktur und genaue Lokalisation im CFTR-Kanal unbekannt sind. Der Mechanismus, mit dem das Gating durch Phosphorylierung ermöglicht wird, ist damit ebenso unbekannt. Die Kanal-Aktivität steigt mit zunehmender Anzahl phosphorylierter Serine graduell an (Veränderung der Aktivität mit PKA-Konzentration und Anzahl mutierter Serine). Daher wird eine Redundanz der Phosphorylierungsstellen postuliert und angenommen, dass die Struktur-arme R- Domäne durch die Akkumulation negativer Ladungen durch die Phosphatgruppen regulatorische Effekte vermittelt. Zusätzlich zu dem Effekt der negativen Ladungen unterliegt die R-Domäne erkennbaren Konformationsänderungen infolge der Phosphorylierung. Dies wird dadurch unterstützt, dass die Prolyl-Isomerase Cyclophilin A die CFTR-Aktivität stimuliert, aber keinen Einfluss auf eine CFTR- Mutante hat, der drei konservierte Proline innerhalb der R-Domäne fehlen. Es wurde gezeigt, dass die R-Domäne keinen Einfluss auf die ATP-Bindung oder Hydrolyse durch die NBDs hat. Es ist möglich, dass die unphosphorylierte R-Domäne den geschlossenen Zustand stabilisiert, indem sie mit den TMDs wechselwirkt. Diese Interaktion wird unterbrochen, vermutlich über eine Interaktion mit einem anderen Teil des Kanals. Außerdem scheinen heterotrimere G-Proteine CFTR direkt aktivieren zu können. Cystische Fibrose korreliert mit CFTR-Mutationen CF (auch Mukoviszidose) ist die häufigste Erbkrankheit unter der Kaukasischen Bevölkerung (Vorfahren aus Nordeuropa) und verläuft meist tödlich (Tot vor dem 25. Lebensjahr). In den USA leiden Menschen an CF, wobei eines von 3000 Babys mit CF geboren wird. Die Hauptursache der Erkrankung ist neben u.a. Umwelteinflüssen eine Mutation im CFTR Gen, das für den epithelialen Chlorid-Kanal codiert und defekte in der Kanal-Funktion bewirkt. Ohne Anionen- Fluss über die Membran wird die epitheliale Wasser-Bewegung verlangsamt. Dadurch kommt es zur Ansammlung eines dehydrierten Schleims, der Kanalwäge verstopft und sich in der Lunge ansammelt, wo er lethale bakterielle Infektionen ermöglicht. Bisher wurden über 1400 verschiedene Mutationen im CFTR Gen verschiedener Patienten detektiert. In 90% der Patienten liegt die ΔF508 Mutation vor. Die Deletion des Codons für F508 (innerhalb der α-helikalen Domäne, die auch das ABC-Signatur-Motiv enthält) in NBD1 verhindert, dass die NBD1 ihre native Konformation erreicht, weshalb sie polyubiquitiniert und durch das Proteasom am ER degradiert wird (Qualitätskontrolle am ER). Dennoch gibt es auch eine geringe Akkumulation fehlgefalteter Polypeptide. Auf Raumtemperatur, nicht auf Blut-Temperatur, findet sogar eine korrekte Reifung des CFTR-Kanals statt, der in die Plasmamembran eingebau wird und seine Funktion fast so gut wie der Wildtyp erfüllt. Andere Mutationen im CFTR-Gen führen zu verkürzten Proteinen oder zu Kanälen mit einern reduzierten Transport-Kapazität, da sie eine kürzere Zeit den offenen Zustand einnehmen oder im

150 geöffneten Zustand Chlorid-Ionen langsame transportieren. Cystische Fibrose ist eine polyphänische Erkrankung, die Auswirkungen auf alle exokrinischen Epithelgeweben hat. Die Letalität beruht meist auf chronische bakterielle Infektionen und Entzündungen innerhalb der Lunge. Verschiedene Variationen im Krankheitsbild korrelieren mit der Multifunktionalität von CFTR. Die ABC-Rezeptoren SUR1 und SUR2 Die Sulfonyl-Harnstoff Rezeptoren SUR1/ABCC8 und SUR2/ABCC9 haben keine bekannte Transport- Funktion. Stattdessen assoziieren diese ABC-Proteine mit K + -selektiven Poren, entweder K IR 6.1/KCNJ8 oder K IR 6.2/KCNJ11, um ATP-sensitive Kalium-Kanäle (K ATP -Kanäle) zu bilden, die in endokrinen Zellen, Neuronen und Muskelzellen vorkommen. ATP erfüllt dabei zwei Funktionen: ATP-Bindung an die Pore reduziert die Aktivität oder die Kanal-Öffnungswahrscheinlichkeit, während Mg-ATP-Bindung und/oder Hydrolyse an den NBDs diesen inhibitorischen Effekt entgegenwirkt und die Öffnung des Kanals induziert. Strukturelle Eigenschaften K ATP -Kanäle sind aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaut: eine K IR 6.x Untereinheit bildet die Pore des Ionen-Kanals und eine SUR-Untereinheit reguliert die Öffnung des Kanals anhand des metabolischen Zustands der Zelle. Es handelt sich um Hetero-Oktamere der Form (SUR-K IR 6.x) 4. Traffickung und Assemblierung Keine Untereinheit erreicht die Zelloberfläche in Abwesenheit des interagierenden Partnerproteins. Das Trafficking vom ER zur Zelloberfläche wird durch Arginin-reiche PKR Motive in beiden Untereinheiten in Kombination mit einem C-terminalen Signal auf der SUR-Untereinheit reguliert. Diese Motive stellen eine korrekte Assemblierung der Untereinheiten dar, die für die Oberflächenexpression erforderlich ist. Gene und Isoformen Es existieren zwei Gen-Paare: ABCC8 und KCNJ11 codieren für SUR1 und K IR 6.2, während ABCC9 und KCNJ8 für SUR2 und K IR 6.1 codieren. Die entsprechenden Gene eines Paars liegen innerhalb des jeweiligen Chromosoms dicht beieinander. Die zwei ABCC-Gene definieren hauptsächlich drei SUR- Isoformen. SUR1 ist der Rezeptor mit der höchsten Affinität für Sulfonyl-Harnstoffe und assembliert mit KIR6.2. (SUR1-K IR 6.2) 4 Kanäle sind im neuroendokrinen System weit verbreitet. Verschiedenes Spleißen des terminalen Exons im ABCC9 Gen resultiert in zwei SUR2 Isoformen: SUR2A assembliert mit KIR6.2 und ist in Herz- und Skelett-Muskelzellen zu finden, während SUR2B mit KIR6.1 assembliert und in glatten Muskelzellen exprimiert wird, wo es den vaskulären Tonus aufrecht hält. SUR1 spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Glucose-induzierten Insulin-Sekretion. Der Rezeptor wurde entdeckt als Target für Sulfonyl-Harnstoffe und wird als Target zur Behandlung der Insulin-abhängigen Diabetes mellitus verwendet. Es wird angenommen, dass SUR1 einen Schalter darstellt, welcher die Öffnung/Schließung der Kir6.2 Kanal-Untereinheiten reguliert, indem SUR1 den intrazellulären metabolischen Zustand in Form der ADP-Konzentration detektiert. Damit kontrolliert der metabolische Zustand der Zelle das Membranpotential.

151 Herstellung Die K IR 6.x Untereinheit KIR6.x Poren sind selektiv für K+ Ionen und haben eine größere einwärts-gerichtete als auswärtsgerichtete Kalium-Leitfähigkeit, weshalb sie Netto einen K+-Import ermöglichen. Wie andere Mitglieder der KIR Superfamilie, o assebliert KIR6.2 als Tetramer, indem vier M2 Helices den Permeations-Pathway auskleiden und ein Gate auf der cytoplasmatischen Seite der Pore bilden. Die nach außen gerichteten M1-Helices sind zugänglich für die Interaktion. Eine Submembran-Helix ( slide helix ) geht voran und bildet fast einen rechten Winkel mit der M1 Helix Assoziierte Erkrankungen Mutationen in einer der beiden NBD-Untereinheiten in SUR1 kann das Gleichgewicht zwischen ATP- Bindung und -Hydrolyse verändern. Damit wird die Aktivität des Kalium-Kanals vom metabolischen Zustand der Zelle entkoppelt, was verschiedene Folgen, u.a. Einflüsse af die Blutzuckerwerte und Energie-Balance hat. Mutationen in SUR1/KIR6.2 (in Neuronen und Insulin-sekretierenden pankreatischen β-zellen) sind direkt mit Hypoglykämie und Diabetes assoziiert. Antigenbeladung durch das ABC-Protein TAP1/2 T-Zellen erkennen antigene Peptide, die auf der Oberfläche von Host-Zellen durch den major histocompatibility complex (MHC) präsentiert werden, und leiten die Immunantwort ein. Es gibt zwei Arten von MHC Molekülen. MHCI Moleküle sind Typ 1 Membranglykoproteine, die in allen Zellen mit Kern vorkommen. Sie präsentieren hauptsächlich Peptide endogener Proteine an CD8 + zytotoxische T-Zellen. Diese T-Zellen scannen das Peptid-Repertoir auf der Zelloberfläche der Target-Zelle und töten diese Zelle, falls sie fremde Peptide aus mutierten endogenen Proteinen oder pathogenen Proteinen präsentiert. MHCII Moleküle gibt es nur auf der Zelloberfläche spezialisierter Imunzellen, welche Peptidfragmente exogener Proteine präsentieren. Diese werden von CD4 + T-Helferzellen erkannt, welche dann B-Zellen zur Antikörperproduktion stimulieren. MHCI Moleküle können auch in spezifischen Antigen-präsentierenden Zellen (z.b. dendritischen Zellen) Peptide exogener Proteine durch einen alternativen Präsentations-Pathway präsentieren. MHCI Pathway Durch Interferon-γ Stimulation (z.b. infolge einer Entzündung) wird das Immunoproteasom gebildet, welches in höherer Quantität antigene Peptide mit COOH-terminalen Aminosäuren synthetisiert, welche von MHCI präferiert werden. Dennoch werden die meisten Peptide durch Amino- Exopeptidasen innerhalb des Zytosols oder des ER-Lumens weiter gespalten, bevor sie von MHCI gebunden werden. Einige dieser Peptide werden durch TAP (Transporter associated with antigen processing) unter ATP-Verbrauch vom Zytosol ins ER-Lumen transportiert. Es wird allerdings nur ein kleiner Bruchteil der Peptide auch auf MHCI geladen. Die Degradation von einem von insgesamt 2000 Proteinen führt zu einem Peptid-beladenem MHCI Molekül auf der Zelloberfläche.

152 Die Faltung und Beladung von MHCI mit Peptiden benötigt verschiedene ER-residente Chaperone. Die schwere Kette von MHCI wird cotranslational in die ER Membran insertiert und glykosyliert. Calnexin und BiP interagieren transient mit der neu synthetisierten schweren Kette, wodurch die Faltung und Assemblierung mit der löslichen Untereinheit β2-mikroglobulin beschleunigt wird. Nach der korrekten Faltung und Assemblierung wird Calnexin durch Calretikulin ersetzt. Zusammen mit ERp57, Tapasin und TAP bildet dieser Komplex den Peptid-Lade-Komplex. Die Gene für die schwere Kette von MHCI sind in drei Loki des Chromosoms 6 lokalisiert und werden als humanes Leukozyten Antigen (HLA) -A, -B und -C bezeichnet. Bis zu sechs verschiedene MHCI schwere Ketten können pro Individuum aufgrund von Polymorphismus zwischen den beiden Allelen (zwei Chromosomensätze) auftreten. Peptide mit einer Länge von 8-10 AS binden in eine Tasche, die durch zwei flankierende α-helices gebildet wird, welche auf einem beta-faltblatt der α1- und α2-domänen der schweren Kette sitzen. Sie werden durch MHCI über ihre freien N- und C-terminalen Gruppen sowie zwei bis drei Anker-Reste gebunden. Die Peptidspezifität von MHCI wird durch die Anker-Reste bestimmt, welche oft COOH-terminale Reste des Peptids und ein bis zwei weitere Peptidreste beinhalten. Nach der Peptidbindung wird MHCI aus dem Peptid-Ladekomplex freigesetzt und über den Golgi Apparat zur Zelloberfläche transportiert. Hier scannen zytotoxische T-Zellen die MHCI-gebundenen Peptide über den T-Zellrezeptor und CD8 Corezeptor. Zellen, die Peptide aus exogenen Proteinen oder mutierten endogenen Proteinen exponieren, werden erkannt und eliminiert. Für die Präsentation extrazellulärer Antigene über MHCI werden zwei verschiedene Kreuz- Präsentations-Pathways diskutiert. (1) Extrazelluläre Antigene werden über Phagozytose oder Endozytose aufgenommen und durch Phagosomen oder Endosomen im Zytosol fregesetzt, von wo aus sie den klassischen MHCI Pathway erreichen.

153 (2) Exogene Antigene werden internalisiert und in einem spezialisierten endosomalen Kompartiment degradiert (MIIC). Hiernach binden die Peptide an MHCI, das entweder durch Internalisierung aus der Plasmamembran oder aus dem ER stammt und im Komplex mit der invariant chain (siehe MHCII) transportiert wird. Vergleich: MHCII Pathway MHC-II Komplexe werden von Immunzellen bzw. APCs exprimiert, um exogene Antigene, sowie Autoantigene zu binden und an der Zelloberfläche den CD4 + T-Helferzellen zu präsentieren. Jene beeinflussen nach Aktivierung die Differenzierung der B-Zellen zu AK-produzierenden B-Zellen. Die Assemblierung der MHC-II Heterodimere erfolgt im endoplasmatischen Reticulum (ER). Eine sich dabei ausbildende Peptid-Bindetasche wird von der so genannten CLIP Region des Peptids invariant chain (li) besetzt, wodurch eine vorzeitige Epitop-Bindung verhindert wird. Ein Di-Leucin- Targeting Motif von li dirigiert die MHC-II Komplexe entlang des endozytotischen Pathways (über Golgi-Komplex direkt oder über Golgi-Komplex und Zelloberfläche nach anschließender Internalisierung und Fusion des Endosoms mit dem entsprechenden Kompartiment indirekt) zum MIIC. Es handelt sich um ein spätes Endosom mit multilamellarer Morphologie, sowie saurem ph- Wert. Außerdem sind im MIIC das Chaperon HLA-DM und die Proteasen Cathepsin S und L lokalisiert, die für die effiziente Beladung von MHC-II mit Antigenen unerlässlich sind. Die Cathepsine degradieren li teilweise während MHC-II sich in der äußeren Membran des MIIC befindet, wobei das CLIP Fragment innerhalb der Peptid-Bindetasche verweilt. Das in Struktur und Sequenz MHC-II-ähnliche Chaperon HLA-DM ist in intraluminalen Vesikeln des MIIC lokalisiert und katalysiert anschließend den Austausch des CLIP Fragments mit antigenen Fragmenten einer Länge von AS, wobei das Chaperon MHC-II stabilisiert, wenn kein Peptid gebunden hat, somit eine Aggregation verhindert und solange den Austausch katalysiert, bis ein hoch affines Peptid gebunden hat. Anschließend wird MIIC mithilfe der kleinen GTPase Rab7 innerhalb der MIIC-Membran entlang von Mikrotubuli zur Plasmamembran transportiert, mit der es letztlich fusioniert. Eine Internalisierung von MHC-II zurück zum MIIC kann durch Ubiquitinierung der β-kette von MHC-II induziert werden. Endogene und Exogene Antigene und ihre Prozessierung Exogene Antigene werden endozytiert und gelangen durch Fusion des Endosoms mit dem MIIC direkt zum Ort der MHC-II Antigen-Beladung. Die Prozessierung erfolgt bereits teilweise im späten Endosom, aber auch noch im MIIC. Endogene Proteine, die bis zu 20% der MHC-II Liganden darstellen, können mehrere Wege einschlagen, um letztlich Zugang zu den MHC-II Molekülen zu erhalten. Erstmals wurde 2005 gezeigt, dass Autophagie die MHC-II Antigen-Prozessierungs-Maschinerie beeinflusst. Hierauf folgten zwei weitere Forschungsarbeiten: Es wurde erst kürzlich gezeigt, dass Autophagosomen kontinuierlich mit dem MIIC fusionieren und somit die MHC-II Moleküle mit Autoantigenen versorgen. Außerdem wurde gezeigt, dass Lamp-2a essentiell für die Präsentation bestimmter Autoantigene durch MHC-II ist. Demnach scheinen MA und CMA Pathways für endogene Proteine zum MIIC darzustellen. Autoantigene können demnach durch saure Hydrolasen in Lysosomen (wie auch die exogenen Antigene), aber auch durch das Proteaosom und zytosolische Proteasen vor ihrer Autophagie, sowie

154 durch endosomale Proteasen innerhalb des MIIC prozessiert werden. Welche Degradations-Enzyme essentiell für die Antigen-Präsentation sind, ist von Antigen zu Antigen unterschiedlich. Der Peptid-Lade-Komplex und TAP Der Peptid-Lade-Komplex besteht aus einer zentralen TAP-Einheit, an der vier Tapasin und vier MHCI Moleküle assoziieren. Außerdem assoziieren in verschiedenen Stöchiometrien die Chaperone Calretikulin, Calnexin und die Oxidoreduktase ERp57 an den Komplex. Die Funktion dieser Hilfsproteine bei der Beladung von MHCI ist noch Research-Thema. Calretikulin scheint für die Stabilisierung des Lade-Komplexes wichtig zu sein und optimiert in Zusammenarbeit mit den anderen akzessorischen Proteinen die Peptid-Beladung von MHCI. ERp57 im Ladekomplex ist kovalent über eine labile Disulfidbrücke an Tapasin gebunden. Zunächst assoziiert ERp57 an Calnexin und der schweren Kette während der MHCI-Reifung. In einer späteren Phase scheint ERp57 für die Bildung der korrekten Disulfidbrpcken innerhalb von MHCI verantwortlich zu sein. Das Typ 1 Membranglykoprotein Tapasin hat mehrere Funktionen: (1) Erhöhung der Anzahl und Vielfalt der MHCI gebundenen Peptide (Erhöhung der MHCI- Oberflächenexpression und Variation der präsentierten Peptide). (2) Stabilisierung der beladenen MHCI Moleküle auf der Zelloberfläche. (3) Zurückhalten von nicht-beladenem MHCI im ER. (4) Rekrutierung der anderen Untereinheiten des Peptid-Ladekomplexes. (5) Erhöhung der lokalen Konzentration von Peptiden für die MHCI-Beladung durch Verknüpfung von TAP und MHCI. (6) Stabilisierung von TAP (höhere HWZ) und damit Erhöhung der Transport-Rate (makroskopisch; KM Wert der Beladung bleibt unbeeinflusst). TAP selbst hat neben Bindung und Transport der antigenen Peptide die Funktion eines Chaperons für die Komponenten des Lade-Komplexes, da die Assemblierung zwischen MHCI, ERp57, Calretikulin und Tapasin wesentlich geringe Effizienz in Abwesenheit von TAP zeigt. Außerdem zeigt MHCI ohne TAP eine andere Konformation, als in Anwesenheit von TAP. TAP könnte auch das Signal zur Dissoziation Peptid-beladener MHCI Moleküle geben. Die Strukturelle Organisation des TAP-Komplexes Der Peptid-Transporter TAP ist ein Heterodimer aus TAP1 und TAP2, die beide essentiell für die Antigen-Prozessierung sind. TAP ist im ER und cis-golgi lokalisiert, wobei keine Signale für diese Lokalisation existieren. TAP1 und TAP2 bestehen jeweils aus einer N-terminalen TMD und einer C-terminalen NBD. Topologisch bestehen TAP1 aus 10 und TAP2 aus 9 Transmembran-Helices, was durch Hydrophobizizäzsanalysen und Vergleiche mit anderen Mitgliedern der ABC-B Subfamilie bestimmt wurde. Es zeigen jedoch jeweils nur die letzten sechs TM-Helices Homologien zu anderen ABC-Transportern. TAP zeigt auch ohne die 3 bzw. 4 N-terminalen Helices volle Aktivität in Pepitdbindung und Transport. Der N-Terminus von TAP ist in die Rekrutierung von Tapasin involviert. Die Peptid-Bindestelle befindet sich innerhalb des letzten zytosolischen Loops und einer 15 AS langen Ausdehnung der letzten TM-Helix von TAP1 und TAP2. In der Abbildung ist der L-Loop (koppelnde Helices aus TMD) dargestellt, welcher mit dem Q-Loop der NBD interagiert (Kommunikation zwischen Untereinheiten => Nukleotidzustand wird TMD mitgeteilt, um Transport zu vermitteln). Die Bindung von ATP erfolgt zwischen WalkerA und Walker B sowie dem C-Loop.

155 Peptid-Bindung und Transport Vorraussetzung für den Peptid-Transport ist die Bindung von Peptiden an TAP. Die Bindung von Peptiden an TAP ist unabhängig von ATP, während der Transport ATP-Hydrolyse benötigt. TAP bindet Peptide mit 8-16 AS am effizientesten, wobei der effizienteste Transport für Peptide mit 8-12 AS beobachtet wird, wobei auch Peptide mit einer Länge von bis zu 40 AS durch TAP transportiert werden können. Für die Bindung der Peptide an TAP sind die ersten drei Reste und der C-terminale Rest wichtig. Es existiert offensichtlicher Weise eine Koevolution zwischen der Schneide-Selektivität des Immunoproteasoms und der Bindespezifität von MHCI und TAP sowie des T-Zellrezeptors. Die Präferenz für die N-terminalen Reste jedoch unterscheidet sich zwischen TAP und MHCI, weshalb eine Abspaltung von N-terminalen Resten durch ER-residente Proteasen stattfindet. Die Sequenz zwischen beiden Enden des Peptids, welche dem T-Zellrezeptor präsentiert wird, ist sehr variabel, wodurch eine maximale Peptid-Diversität resultiert. Die Peptid-Bindung beinhaltet eine schnelle Diffusions-kontrollierte Peptid-Assoziation, gefolgt von einer langsamen Konformationsänderung innerhalb von TAP, welche die ATP-Hydrolyse induziert, die wiederum eine weitere mit dem Peptid-Transport assoziierte Konformationsänderung bewirkt. Der KM Wert für ATP beträgt 0,3 mm und der ATP-Umsatz pro TAP-Molekül 5 ATP pro Sekunde. Nach Schätzungen werden 2 Moleküle ATP pro Peptid hydrolysiert. Mit 10 5 TAP Molekülen pro Zelle ist der Peptid-Transport nicht Raten-limitierend für die MHCI Assemblierung. Funktionale Asymmetrie der TAP-Untereinheiten

156 Mithilfe des BeF x -Trapping wurde klar, dass beide Untereinheiten während des Peptid-Transports ATP hydrolysieren. Methode: BeF x -Trapping. Nach der Hydrolyse von ATP zu ADP wird das anorganische Phosphat durch BeF x ersetzt. Zusammen mit MgADP bildet sich in sehr stabiler Komplex innerhalb der Nukleotid-Bindetasche. Nicht-getrappte Nukleotide werden ausgewaschen, während getrappte Nukleotide kovalent an TAP gecrosslinkt werden. Die ATPase Aktivität beider Untereinheiten werden in Anwesenheit des Peptids gleichermaßen stimuliert, sodass beide Untereinheiten den gleichen Beitrag zum Peptid-Transport leisten. Dennoch sind die beiden NBDs nicht äquivalent und TAP-Mutanten mit identischen NBDs (je aus TAP1 oder TAP2) zeigen eine wesentlich geringere Transport-Effizienz. Sequenz-Vergleiche zwischen TAP1 und TAP2 mit anderen NBDs zeigen die größte Abweichung in der ATP-Bindestelle 1. In TAP1 ist die katalytische Base im Walker B Motiv (Glutamat) durch Aspartat und das zentrale Histidin des H-Loops, welches das γ-phosphat von ATP bindet, durch Glutamin ersetzt. Der C-Loop in TAP2 an der ATP-Bindestelle 1 entspricht anstelle der konservierten Sequenz LSGGQ der Sequenz LAAGQ, wobei die AS-Folge SG hauptsächlich für die Bindung des γ-phosphats und die Regulation der ATPase Aktivität verantwortlich ist. Die nicht-homologen COOH-terminalen Schwänze beider Untereinheiten haben ebenso Einfluss auf die Nukleotidbindung. Sie scheinen regulatorische Funktion während der koordinierten ATP- Hydrolyse zu haben. Transport-Mechanismus von TAP (Modell) Im ersten Schritt binden Peptid und ATP unabhängig voneinander an TAP. In lebenden Zellen ist TAP immer mit ATP beladen (ATP-Affinität ist 5 µm; zytosolische ATP-Konzentration 1-10mM). Die ATP- Bindung wird durch den Q-Loop detektiert und induziert eine rigid body Rotation des Arm2 der NBD, was die Dimerisierung der NBDs ermöglicht. Diese wird durch die Interaktion zwischen Q-Loop und helikalem L-Loop der TMD beschränkt. Im zweiten Schritt bindet das Peptid und induziert eine strukturelle Umorientierung der TMDs beider Untereinheiten (Schritt 3), was die Interaktion zwischen Q-Loop und L-Loop schwächt. Dadurch bildet sich ein NBD-Dimer, der die Peptid- Freisetzung im ER-Lumen induziert (Schritt 4). Die ATP-Hydrolyse und Phosphatfreisetzung findet erst an der NBD2 (Schritt 5), dann an der NBD1 (Schritt 6) statt, was letztlich die Interaktion zwischen den NBDs schwächt und die Dimer-Dissoziation induziert (Schritt 7). Nach der Dissoziation wird ADP freigesetzt und durch ATP ersetzt (Schritt 8). ATP in der NBD2 wird aus zwei Gründen zuerst hydrolysiert: