Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

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1 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf UHZ, Klinik und Poliklinik für Gefäßmedizin -Gefäßchirurgie - Endovaskuläre Therapie - Angiologie- Direktor: Professor Dr. med. E. S. Debus Die multifunktionelle Gefäßprothese Ergebnisse nach Implantation im Schweinemodell Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg vorgelegt von: Axel Pflugradt aus Wolgast Hamburg, 2013

2 Angenommen von der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg. Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: PD A. Larena-Avellaneda Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in: Prof. Dr. med. C. Detter Prüfungsausschuss, dritte/r Gutachter/in: Prof. Dr. med. E. S. Debus

3 Gewidmet meinen Eltern

4 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung und Fragestellung Autologer Gefäßersatz Xenogener Gefäßersatz Allogener Gefäßersatz Alloplastischer Gefäßersatz Geschichte und Materialkunde Alloplastischer Gefäßersatz das Ideal Alloplastischer Gefäßersatz die Wirklichkeit Dichtigkeit Thrombogenität Infektion Flexibilität und Degradation Intimahyperplasie Einheilung / Inkorporation Unser Ansatz: Eine multifunktionelle Gefäßprothese Ziel der Arbeit Material und Methoden Aufbau der multifunktionellen Gefäßprothese Wahl des Immunsuppressivums Tiermodell Vorversuch Hauptversuch Histologische Aufarbeitung der Gefäßabschnitte Zuschneidung und Einbettung in Paraffin HE-Färbung E-v-G-Färbung Auswertung Beurteilung der Offenheitsrate... 30

5 Semiquantitative Einschätzung der Einheilung Semiquantitative Einschätzung der Entzündungsreaktion Morphometrische Messung der Intimahyperplasie Statistische Auswertung Ergebnisse Tiermodell Vorversuch Hauptversuch Makroskopische Beurteilung der Offenheitsrate Histopathologische Auswertung Inkorporation Entzündungsreaktion Morphometrie der Intimahyperplasie Statistische Auswertung Diskussion Verwendete Materialien Medikamentenfreisetzung- drug eluting Tiermodell und OP-Handhabbarkeit Intimahyperplasie Schlussfolgerung Ausblick/ Weiterentwicklung Zusammenfassung Abkürzungsverzeichnis Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Literaturverzeichnis Anhang Danksagungen Lebenslauf

6 12. Eidesstattliche Versicherung

7 1. Einleitung und Fragestellung Der demographische Wandel verursacht eine starke Zunahme der Inzidenz von Aneurysmen, akuten oder chronischen peripheren Durchblutungsstörungen und besonders atherosklerotischen Veränderungen von Aorta, Hals-, Viszeral- und Extremitätengefäßen. Die Behandlung dieser hauptsächlich alters- und auch konsumbedingten Degenerationsprozesse ist eines der Hauptgebiete der Gefäßchirurgie. Die Prävalenzz der peripheren arteriellen Verschlusserkrankung (pavk) in Deutschland wird mit bis zu 1,8 Millionen Menschen angegeben, davon entwickeln pro Jahr eine kritische Extremitätenischämie 1. Zur Behandlung stehen aktuell zahlreiche Möglichkeiten zur Verfügung. An erster Stelle sollte bei der Diagnostik und Therapie der pavk, welche die häufigste Behandlungsindikation in der Gefäßchirurgie darstellt, immer das Risikoprofil des Patienten beachtet werden. Der Vermeidung bzw. Behandlung der entsprechenden Risikofaktoren (hauptsächlich: arterieller Hypertonus, Nikotinabusus, Diabetes mellitus und Hyperlipoproteinämie) sollte oberste Priorität eingeräumt werden. Es stehen dann zunächst im unkritischen Stadium der Erkrankung die konservativen Optionen, wie zum Beispiel die Verabreichung von Medikamenten und das strukturierte Gehtraining zur Verfügung. Ist eine konservative Behandlung unzureichend oder handelt es sich um ein kritisches Stadium, so rücken interventionelle Maßnahmen wie zum Beispiel Angioplastie oder das stenting betroffener Gefäßabschnitte in den Vordergrund. Sollte auch damit der gewünschte Behandlungserfolg nicht erzielbar sein, oder war die vorliegende Erkrankung nicht anders behandelbar, kommen dann die operativen Maßnahmen zur Geltung. Lange Zeit war die Amputation die einzige Behandlungsoption. Mit der Entwicklung der modernen Gefäßchirurgie sind heutzutage glücklicherweise funktions- und Gliedmaßen erhaltende Rekonstruktionen möglich und werden bevorzugt angewendet. Dazu stehen dem Gefäßchirurgen generell autologe, alloplastische, allogene oder auch xenogene Materialien zur Verfügung Autologer Gefäßersatz Seit Kunlin 1949 den ersten Venenbypass bei einer pavk einsetzte, stellen autologe Transplantate das Mittel der Wahl dar. Hierbei können sowohl körpereigene Venen als auch Arterien Verwendung finden. Sie sind biologisch sehr gut verträglich, keinerlei Ab- 1

8 stoßungsreaktionen sind zu erwarten und es werden insbesondere bei Venenbypässen mit der V. saphena magna die längeren Offenheitsraten beobachtet 2,3. Einige Autoren befürworten den Einsatz alternativer Venen anderer Ursprungsorte (z.b. Armvenen) oder gar zusammengesetzter Venensegmente als Bypassmaterial der 2. Wahl 4. Nachteilig können eventuell der größere Aufwand und das operative Trauma bei der Entnahme sowie das bestehende Missverhältnis der Diameter zu dem zu ersetzenden Gefäß (so genanntes mismatch ) sein. Besonders bei dem Ersatz oder der Rekonstruktion der großen Gefäße (z.b. Aorta) ist der Einsatz limitiert. Außerdem stehen autologe Transplantate naturgemäß nur begrenzt zur Verfügung. Eine Herstellung maßgeschneiderter Gefäße aus den eigenen Zellen des Patienten und damit die unbegrenzte Verfügbarkeit autologen Gefäßersatzes dürfte trotz erster Ergebnisse 5 in absehbarer Zukunft Fiktion bleiben Xenogener Gefäßersatz Der Einsatz von xenogenen Transplantaten, d.h. biologischen Materialien einer anderen Art (z.b. Schwein oder Rind) in der Gefäßchirurgie wurde zunächst bei hoffnungsvollen Ansätzen im Tierversuch vorangetrieben 6. Die unbegrenzte Verfügbarkeit war hier das Hauptargument. Es handelte sich hierbei z.b. um aufbereitete Halsschlagadern von Rindern. In der klinischen Praxis zeigten sich jedoch bei passablen Offenheitsraten eine inakzeptabel hohe Rate von Aneurysmabildungen 7. Außerdem ist die Frage der immunologischen Interaktion noch nicht eindeutig geklärt. Eine andere Prothesenart ist die OmniflowII -Prothese (Biograft, Biovascular, St. Paul,. MN, USA), welche durch Biosynthese (Kollagenummantelung) einer in Schafen eingesetzten Kunststoffprothese (Polyester- Mesh) hergestellt wird. Dadurch soll der Prothese zusätzliche Stabilität zur Verhinderung der befürchteten Aneurysmabildung gegeben werden. Auch hier zeigten sich in ersten Studien gute Offenheitsraten 8 und gute Einheilungen 9, weitere Ergebnisse stehen aber noch aus Allogener Gefäßersatz Auf der Suche nach immer neuen Möglichkeiten sind auch allogene Transplantate ins Blickfeld der Forscher gerückt. Hierbei handelt es sich um postmortale Spendergefäße 2

9 der gleichen Art, so genannte Homografts. Ein Beispiel ist die humane Umbilikalvene, die industriell hergestellt (Dardik Biograft, Meadox Medicals, Inc., Oakland, N.J), in klinischen Versuchen eingesetzt wurde und hier in ersten Studien teils gute 10,11, teils indifferente 12 Ergebnisse zeigte. Der anfänglichen Euphorie folgten dann Berichte über eine Neigung zur vermehrten Neointima-Bildung in Tierexperimenten 13 sowie in weiteren klinischen Studien, ebenso die Tendenz zur Frühthrombose und Aneurysmabildung im Verlauf 14,15. Insgesamt konnte sich auch nach Modifikation (externe Verstärkung durch Polyester- Mesh) der originalen Dardik-Prothese und weiteren guten Ergebnissen 16,17 die routinemäßige Verwendung, auch wegen der schwierigen Herstellung und Aufbereitung, bei gleichzeitig hohen Kosten und der Nicht-Überlegenheit gegenüber anderen Materialien nicht durchsetzen. Sie wird heute nur noch als Transplantat der 2. oder 3. Wahl empfohlen 18. Üblicherweise werden heute Homografts nur in Infektsituationen - mit teils guten Ergebnissen in der Aortenchirurgie 19,20 - verwendet, wenn sich der Einsatz von Kunststoffmaterialien verbietet. Hierbei handelt es sich dann um aufbereitete, kryokonservierte Leichenarterien und venen von Transplantatbanken. Wegen der hohen Kosten und der begrenzten Verfügbarkeit findet jedoch auch hier kein routinemäßiger Einsatz statt. Zusätzlich sind noch Fragen der Immunreaktion bei nicht ABO-kompatiblen Transplantaten ungeklärt Alloplastischer Gefäßersatz Geschichte und Materialkunde Die ersten Versuche, blutende Gefäße zu behandeln, sind historisch bereits in der Antike belegt(hanf-ligaturen blutender Gefäße durch Sushruta 21 ) und markieren somit gewissermaßen die Anfänge der Gefäßchirurgie. Während man durch Amputationen, Ligaturen oder Styptika in der Lage war, das Leben der Verletzten zu retten, war es oftmals nicht möglich, den Blutfluss aufrechtzuerhalten und damit funktionserhaltend zu behandeln. Als nachweislich Erster experimentierte im Jahre 1543 Vesal mit alloplastischen Materialien, er verwendete bei Experimenten zur Weiterleitung der Pulswelle Strohhalme 22. Dies lässt erkennen wie weit er seiner Zeit voraus war, denn erst 1894 wurde ähnliches versucht: Abbe interponierte ein sanduhrförmiges Glasröhrchen in eine Katzenaorta (s. Abb. 1.1 auf nächster Seite) 23. 3

10 Abbildung 1.1: Zeichnung des von Abbe verwendete Glasröhrchens. Quelle: 23 Während Goyanes schon 1906 erfolgreich Venen zur Rekonstruktion einsetzte, blieben Experimente mit alloplastischen Materialien zunächst ohne Erfolg: Nitze verwendete 1897 Elfenbeinröhrchen und 1900 versuchte sich Payr mit Magnesium an einer resorbierbaren, nahtlosen Anastomose zur Überbrückung eines resezierten Gefäßabschnitts (s. Abb. 1.2) 24. Abbildung 1.2: Payrs Magnesiumzylinder von 1900: Der Magnesiumzylinder wird über das Gefäß geschoben (a), invaginiert und ligiert (b). Das zu verbindende Gefäß wird über der so geschaffenen Stulpe positioniert und mit einer zweiten Ligatur fixiert (c). Durch eine Rille im Zylinder sind die Ligaturen gegen Verrutschen gesichert. Quelle: 24 Auch verschiedenste Materialien wie Karamell (Carell,1903), Gummi (Ward,1908), paraffiniertes Silber (Tuffier,1917), Vitallium (Blakemore,1942), Methylmethacrylat (Hufnagel,1947) 25 und Polyethylen (Donovan,1949) 26 wurden erfolglos getestet 27. Während homologe Materialien bereits erfolgreich eingesetzt wurden, fehlte es auf dem Gebiet der alloplastischen Materialien an einer Initialzündung für den entscheidenden 4

11 Durchbruch. Schon 1899 hatte Dörfler Verdickungen [...] und flache, weissgraue Auflagerungen auf der luminalen Seite seiner Seidennaht beschrieben, ohne jedoch weiter darauf einzugehen 28. Auch Carell und Guthrie beschreiben 1906 die Nahtreihe ihrer A- nastomosen von einer glänzendem, im Aussehen dem Endothel ähnlichen Schicht überzogen 29. Doch erst 1949 erkannte A. Vorhees nach eigener, ähnlicher Erfahrung die große Bedeutung dieser Beobachtungen. Vorhees musste bei Versuchen mit künstlichen Herzklappen am Hund eine falsch angelegte Seidennaht im Ventrikel belassen. Bei der Explantation einige Monate später hatte Vorhees Probleme eben jene Seidennaht wiederzufinden, sie erschien makroskopisch von Endokard umhüllt. Vorhees vermutete daraufhin dass eine Stoffröhre als Gefässprothese dienen könnte 30. Durch Versuche mit entsprechenden Prothesen zuerst aus Taschentuch-, später aus Fallschirmseide erprobte er seine Hypothese. Im Lauf der Experimente stellte Vorhees auch eine Liste erwünschter Eigenschaften für seine Prothese zusammen. Der Hinweis eines Kollegen, Dr. Blunt, ließ ihn zum Vinyon-N greifen 31. Das neue Material sollte sogleich einen Härtetest bestehen, denn bei einem notfallmäßig zu operierendem Aortenaneurysma am Menschen war kein Homograft als Prothesenmaterial verfügbar. Während sein Chef Blakemore die Aorta abgeklemmt hielt, eilte Vorhees ins Labor und nähte aus dem Material für den Tierversuch eine Prothese 32 (dargestellt in Abbildung 1.3). Abbildung 1.3: Skizze aus Vorhees Publikation zur Verwendung einer aortalen Gefäßprothese aus Vinyon-N. Über die proximale und distale Nahtreihe werden zusätzlich noch Verstärkungsmanschetten vernäht. Aus: 33. Im Zuge dieser bahnbrechenden Neuerung eröffneten sich der Gefäßchirurgie unzählige Möglichkeiten und durch weitere Forschung war im Polyester, genauer Polyethylen- 5

12 terephthalat (=PET) rasch ein vielversprechendes Material für Gefäßprothesen gefunden (s. Abb. 1.4). Schon seit 1958 werden Prothesen aus Dacron und anderen PET-Fäden regelmäßig für alloplastischen Gefäßersatz verwendet und gelten noch heute als Goldstandard. Abbildung 1.4: Gängige PET-Prothesen unterschiedlicher Form und Durchmesser mit der für sie typischen, formgebenden Plissierung ( crimping ) für erhöhte Knickstabilität. Die eingearbeiteten schwarzen Streifen (sog. guidelines ) dienen der Lagekontrolle und der Vermeidung axialer Verdrehung [Bildmaterial Fa. Jotec]. PET-Prothesen können je nach Herstellungsprozess gewebt, gestrickt oder gewirkt sein. Während bei Webware Schuss- und Kettfäden ohne Maschenbildung rechtwinklig verkreuzt werden, bestehen Gewirke und Strickwaren aus unterschiedlich ineinander verlaufenden Maschen (vgl. Abb. 1.5a-c; 1.6a-c, nächste Seite) 34,35. Durch Variation von Fadendurchmesser und -querschnittprofil, Anzahl der verwendeten Fäden, Strick, Web oder Wirkmustern sowie Besatz mit Einfach- oder Doppelvelours (siehe Abb. 1.7a,b, nächste Seite) ändern sich Dichtigkeit, Elastizität und Stabilität der fertigen Prothesen. Die Wahl dieser Parameter stellt eine Wissenschaft für sich dar und ist ein gut behütetes Produktionsgeheimnis jedes Prothesenherstellers. Eine Objektivierung der Protheseneigenschaften ist daher für Nicht-Textiltechniker schwierig und viele Chirurgen verlassen sich bei der Prothesenwahl auf ihr Gefühl. 6

13 Abbildung 1.5 a-c: Schematische Darstellung von Gewebe (a), Gestrick (b) und Gewirk (c),bildquelle 36 Abbildung 1.6 a,b und c: Elektronenmikroskopische Darstellung von Gewebe (a), Gestrick (b) und Gewirk (c): Bilder a und b zeigen eine Dacron -Prothese bei 50x Vergrösserung, Bild c zeigt aus Gründen der Übersichtlichkeit ein Einzelfaser Marlex -Mesh bei 60x Vergrösserung. Bilder von Durmuş TD, Ankara (a,b); Dr. Höfling HM, Düren (c) Abbildung 1.7 a,b: Veloursbesatz im Schema a) und bei 60-facher Vergrösserung b) soll durch seine Schlaufen die Dichtigkeit erhöhen und durch die vergrößerte Oberfläche ein leichteres Einwachsen ermöglichen. Bild (a) aus 36 ; (b) Eigenmaterial 7

14 Auch Polytetrafluorethylen (PTFE, Teflon ) hat in seiner gereckten ( expanded ) Form als eptfe (Goretex ) seit über 30 Jahren einen großen Stellenwert in der Gefäßchirurgie. Es wird zumeist als Bypassmaterial im Bereich schmallumiger Gefäße verwendet. Abbildung 1.8: Glattwandige, primär dichte eptfe-prothese mit vorgeformter Anastomose und Spiralverstärkung in Übersichtsaufnahme. Bild (a) zeigt eine Distaflow -Prothese der Fa. Jotec. In der rasterelektronenmikroskopischen Darstellung (b) lässt sich die typische Knoten-Fibrillenstruktur gut erkennen. Bilder mit freundlicher Genehmigung (a) der Fa. Jotec und (b) der Fa. Vascutek. Im Gegensatz zu PET wird PTFE nicht zu einer Faser verarbeitet und versponnen, sondern direkt aus pulverisiertem Polymer in Stabform gepresst. Diese Form wird dann hochdruckextrudiert, auf den gewünschten Durchmesser gestreckt und zur Härtung gesintert. Die Fibrillenlänge und damit die Porosität lässt sich von 1μm bis über 60μm variieren( 1 ). Bei beiden Materialien stellt die Wahl des Porositätsgrades einen wichtigen Kompromiss zwischen ausreichender Blutdichtigkeit und zufriedenstellender Einheilung der Prothese dar Alloplastischer Gefäßersatz das Ideal Es war auch Vorhees Arbeitsgruppe, in der die meisten, heute noch gültigen Anforderungen an eine ideale Gefässprothese (siehe Tab.1.1, nächste Seite) postuliert wurden: Die Erfolgsaussichten der Anastomosenbildung hängen demzufolge von Bearbeitbarkeit ( 1 ) Information von Fa. Vascutek, Deutschland 8

15 und Wahl des geeigneten Nahtmaterials ab. Eine Prothese sollte gleichermaßen primär dicht und porös genug für die Einsprossung des umliegenden Gewebes (Fibroblasteninvasion) sein. Sie muss sich den Gewebeverhältnissen anpassen, ohne abzuknicken und darüber hinaus dauerhaft haltbar und biologisch möglichst inert sein. Dabei muss sie stets den chirurgischen Anforderungen genügen: Sie darf nicht ausfransen, nicht leicht verheddern und muss nähbar bleiben, ohne dabei Nadeln zu beschädigen oder bereits gelegte Nähte zu verziehen. Unbegrenzte Verfügbarkeit in standardisierter Qualität, Dimension und Konfiguration Optimale Lagerfähigkeit und Sterilisierbarkeit im Routinebetrieb Langfristige Zuverlässigkeit trotz hoher mechanischer Beanspruchung Biokompatibilität durch biochemische Inertheit und ablastogene Eigenschaften Einheilung ohne Fremdkörperreaktion Thromboseresistenz auch bei Minimal und Niederdruckbedingungen Sicheres und unkompliziertes operationstechnisches Handling durch geringe Stichresistenz, sowie Schmiegsamkeit, Nahthaltigkeit, Blutdichtigkeit, Torsions- und Knickstabilität, ferner Servicefreundlichkeit bei Rezidiveingriffen Ökonomie durch geringe Herstellungskosten, Resterilisierbarkeit und geringen Verschnitt Tabelle 1.1: Grundlegende Anforderungen an die ideale Gefäßprothese ; zitiert nach 31,38 9

16 1.6. Alloplastischer Gefäßersatz die Wirklichkeit Herkömmliche PET und auch eptfe-prothesen sind entweder thrombogen, undicht oder anfällig für Degradation und Intimahyperplasie. Das führt zu Frühverschlüssen, verminderten Langzeit-Offenheitsraten und Infektionsanfälligkeit. Trotz aller Anstrengungen gelang es bisher nicht, alle Ansprüche in einer einzelnen Prothese zu vereinen. Zudem verläuft die Versorgung von Gefäßen mit einem Durchmesser <6mm nicht zufriedenstellend 39. Da das zugrunde liegende Kunststoffmaterial seit Jahrzehnten unverändert war, wurde an den unterschiedlichsten Beschichtungen und Modifikationen für die Prothesen geforscht, um diese Probleme zu lösen. Es mangelt jedoch, wie bereits zu Vorhees` Zeiten, an einem Quantensprung, der den technischen und wissenschaftlichen Fortschritt der letzten Jahrzehnte für die Gefäßchirurgie nutzbar macht Dichtigkeit Prinzipiell gibt es, wie schon erwähnt, einen schwer lösbaren Konflikt zwischen Dichtigkeit und Einheilung einer Gefäßprothese, bedingt durch die dazu notwendige Porosität des Materials. Gewebte Prothesen sind zwar primär dicht, werden aber aufgrund der schwierigen Handhabung beim Zuschnitt ( ausfransen ) sowie der fehlenden Eignung für kleinere Gefäße in der Gefäßchirurgie nur beim Aortenersatz verwendet. Gestrickte und gewirkte Prothesen sind aufgrund ihrer Textur primär undicht und mussten früher vor Implantation mittels pre-clotting abgedichtet werden, damit ein gerichteter und verlustfreier Blutstrom durch die Prothese gewährleistet ist. Dazu wird die Prothese mit Blut getränkt, durch die Bildung von Fibrinnetzen in den Maschen werden diese abgedichtet. Nach kurzer Wartezeit wird die Prothese mit heparinisiertem Blut durchspült, um eine möglichst athrombogene Oberfläche zu erhalten 40. Um diesen zeitaufwändigen und nicht standardisierbaren Vorgang zu vermeiden, werden seit langem mit Albumin, Gelatine oder Kollagen maschinell beschichtete und primär dichte Prothesen eingesetzt. Die hierzu verwendeten Substanzen wie Kollagen oder Gelatine sind jedoch biochemisch nicht inert und werden im Zeitraum von 2-6 Wochen durch körpereigene Enzyme vollständig abgebaut. Mit zunehmender Verweildauer verliert die Prothese selbst somit kontinuierlich an Dichtigkeit. Wird das Maschenwerk der Prothese bei mangelhafter Einheilung nicht ausreichend durch körpereigenes Gewebe abgedichtet ist der Operationserfolg 10

17 gefährdet. Neben Unverträglichkeiten und Allergien sind diese tierischen Materialien auch mit dem Risiko der Infektiosität behaftet. Da sie meist boviner Herkunft sind, besteht auch zumindest theoretisch das Risiko einer Ansteckung mit boviner spongiformer Enzephalitis (BSE). Es ist zwar kein gesicherter Fall einer BSE-Infektion durch eine derartig beschichtete Prothese bekannt, die Industrie versucht jedoch schon länger, durch Versuche mit Polyurethan 46 oder anderen Elastomeren 47 ein günstiges und leicht verfügbares Ersatzmaterial zu finden. Zudem darf bekannter Weise kein tierisches Biomaterial nichtamerikanischer Herkunft auf den dortigen Markt importiert werden, dies stellt marktwirtschaftlich eine große Hürde dar. Die Beschichtung und die Prothese selbst kann (s. Abb. 1.9) beim Nähen Schaden nehmen, was sich besonderes bei Prothesen aus PTFE als Stichkanalblutung bemerkbar macht. Deren Stillung erfordert intraoperativ zusätzliche Zeit, postoperativ kann eine Revision erforderlich werden. Zur Minimierung dieser Risiken sind von fast allen Herstellern auch mit tierischen Substanzen beschichtete PTFE- Prothesen verfügbar, allerdings erkauft man sich hierdurch ebenfalls die oben beschriebenen Nachteile. Auch die Manipulation mit OP-Instrumentarium, hier seien besonders Klemmen genannt, kann eine Prothese nachhaltig beschädigen und so die Prädilektionsstelle einer Degradation darstellen 48. Abbildung 1.9a-c: Typische nahtbedingte Prothesenschäden in (a) PET und (b) PTFE. Man erkennt die von der Nadelspitze zerschnittenen Fasern, bzw. das eingerissene PTFE Gewebe. In (c) ist die Beschädigung von PET- Fasern durch wiederholtes Klemmen dargestellt. Bilder: Dr. Meincke J, Flensburg] Um gerade die Stichkanalblutungen zu minimieren, sind alternativ auch Prothesen mit einer Mehrfach-PTFE-Schichtung entwickelt worden (z.b. Flixene der Firma Atrium ) oder einer Sandwich- Schichtung mit 2-lagiger PTFE-Schicht und dazwischen liegendem Elastomer (Rapidax der Firma Vascutek ). Der Vorteil der Dichtigkeit der Prothesen geht hier aber auf Kosten der Flexibilität, was mit einer vermehrten Wandsteifigkeit ver- 11

18 bunden ist. Ebenso sind bei zunehmender Wanddicke Probleme bei der Einheilung vorhanden. So werden diese Prothesen vornehmlich zur Implantation als Diaslyseshunts genutzt Thrombogenität Die Implantation von Fremdmaterial in die Blutbahn führt primär immer zur Aktivierung des plasmatischen Gerinnungssystems und damit zu einer erhöhten Thrombogenität. Die Entstehung von Thromben beruht dabei auf der Bildung von Thrombin und Fibrin sowie der Aggregation von Thrombozyten an das körperfremde Material. Im Gegensatz zu autologen Venentransplantaten weist eine handelsübliche PET-Gefäßprothese ein erhöhtes Risiko für Thrombenbildung 49 und akute Verschlüsse auf 50,51. Dies wird auf die vermehrte Thrombozytenadhäsion an Kunststoffoberflächen zurückgeführt 52,53. Auch die für eine primäre Dichtigkeit verwendeten Beschichtungsmaterialien können thrombogene Eigenschaften besitzen. Während sich gezeigt hat, dass eine Beschichtung mit Albumin oder Kollagen die Thrombogenität nicht entscheidend beeinflusst 54, wird sie durch Heparinisierung deutlich reduziert 53 und liefert in Studien zumindest mittelfristig annehmbare Ergebnisse 13,55. Hier scheint jedoch auch die Art der Heparin-Bindung eine entscheidende Rolle zu spielen. Mit einer kovalenten Bindung, im Gegensatz zur reinen Beschichtung, an einer PTFE-Prothese (Gore Propaten ) scheint man nun, wenn man die ersten kurzfristigen Ergebnisse betrachtet, einen enormen Schritt zur Minimierung der Thrombogenität vorangekommen zu sein. Insbesondere im Bereich der infragenualen Bypassrekonstruktionen gibt es nach 1 und 2 Jahren deutliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Prothesen 56,57. Die Indikationsstellung ist jedoch hier bei bekannter HIT 2- Reaktion eingeschränkt, obwohl es diesbezüglich in der Literatur keine eindeutigen Hinweise auf Auslösung einer HIT durch die Prothese gibt. Auch karbonbeschichtete Prothesen wurden getestet. Lieferten sie in Tierversuchen noch hoffnungsvolle Resultate 58, waren diese dann jedoch klinisch eher widersprüchlicher Natur und zeigten letztlich keine Vorteile 59.Eine Prothese mit permanenter Unterdrückung der Thrombenbildung konnte also bis dato nicht verwirklicht werden. 12

19 Infektion Eines der Hauptprobleme im Zusammenhang mit Gefäßersatzoperationen stellt die bakterielle Infektion dar 60,61. Das Risiko einer tiefen Protheseninfektion nach Implantation eines Gefäßersatzes wird mit bis zu 5% 62 angegeben. Dieses gering erscheinende Risiko bewirkt jedoch eine um 12-22% erhöhte Letalität sowie eine um 17-79% erhöhte Amputationsrate und wird daher zu Recht gefürchtet. Die Inzidenz ist dabei abhängig vom Ort der Implantation, so sind insbesondere Dialyseshunts und Bypässe mit Beteiligung der Leistenregion gefährdet. Es gibt in der Literatur mehrere Klassifikationen. Die gebräuchlichste klinische Einteilung der Bypassinfektion wird auch heute noch nach Szilagyi vorgenommen. Hier wird nach der Tiefe der infizierten Gewebsschichten unterteilt: Grad I- oberflächlich, auf die Haut begrenzt; Grad II- oberflächlich, mit Beteiligung der Subkutis und Grad III- tiefe Infektion mit Beteiligung der Prothese. Eine andere Form der Einteilung findet sich nach Zühlke/ Harnoss, wo der reine Protheseninfekt allein oder mit Beteiligung der Anastomosenregion und eventuell dazu bestehenden Blutungskomplikationen in 3 Grade untergliedert wird. Zusätzlich wird in Frühinfekt (innerhalb der ersten 4 Wochen) und in Spätinfekt (später als 4 Wochen nach Implantation) unterteilt. Dieser Unterschied hat sich in der Klinik hinsichtlich der Prognose und der Behandlungskonsequenz bewährt. Im Falle einer Infektion gilt, neben der obligaten antibiotischen Therapie, die Entfernung der Prothese, und damit des Erregerreservoirs, als Goldstandard. Bei nur partieller Entfernung muss bis zu 41%( 1 ) mit einem Rezidiv der Infektion gerechnet werden. Selbst bei optimaler Therapie kann die oben beschriebene hohe Mortalität und Amputationsratekaum vermieden werden. Mittlerweile weiß man aber auch, dass es bei der Virulenz der Keime bedeutende Unterschiede gibt. Bei Infektionen mit Staph. epidermidis z.b., sind der in situ repair, sprich der Prothesenaustausch an gleicher Stelle, mit einer Antibiotika- oder Silber- imprägnierten Prothese zulässig, wobei eine eindeutige Evidenz diesbezüglich fehlt. Tierexperimentell zeigte jedenfalls der in situ-ersatz mit Rifampicin gebundener Prothese sehr gute Ergebnisse 69. Hingegen sollte bei Infektionen mit Staph. aureus, incl. MRSA oder gramnegativen Keimen wegen der schlechteren Prognose ein ex situ repair, also eine extraanatomische Bypassneuanlage mit kompletter Entfernung der alten Prothese, oder der Einsatz mit Homografts erfolgen 70,71. Eine andere, eben- ( 1 ) Untersuchungen von Zegelmann und Günther veröffentlicht auf 13

20 falls erfolgreich angewendete Methode bei nicht komplettem Protheseninfekt ist die Belassung des Implantates und das ausgiebige Debridement sowie die Deckung mit Muskellappen 72. Prophylaktisch ließen sich durch einen primär infektionsresistenten Gefäßersatz diese Risiken und die damit verbundenen Auswirkungen für den Patienten nahezu ausschließen. Experimentelle Studien mit Rifampicin- imprägnierten Prothesen verliefen vielversprechend. Große klinische Studien konnten dies jedoch nicht bestätigen 73. Weiterhin wird versucht, die bekannten anti-infektiösen Eigenschaften von Silber und seinen Salzen mittels Imprägnierung auf Gefäßprothesen zu übertragen. Diese silberbeschichteten Prothesen besitzen anti-infektiöses Potential und beeinträchtigen die Einheilung nicht wesentlich 74, sind jedoch einer direkten lokalen Antibiose unterlegen 75. Eine Kombination von Silber und Antibiotika, so wird geschlussfolgert, böte sich an 76. Auch eine Kombination mit anderen antiseptischen Stoffen, wie Triclosan wird diskutiert 77. Hierzu gibt es bereits eine neue Prothese auf dem Markt (Intergard Synergy von Maquet ). Allerdings wird sogar schon von einer Infektresistenz gegenüber Silber berichtet 78. Doch auch zu diesem Thema gibt es wegen der geringen Fallzahlen der Protheseninfekte immer noch keine wegweisenden klinischen Studien, so dass die Wahl der Prothesenart im einzelnen Fall dem Chirurgen vorbehalten ist. Eine generelle Empfehlung zur Verwendung einer bestimmten Prothese als Infektionsprophylaxe gibt es somit nicht Flexibilität und Degradation Eine Gefäßprothese wird im Körper nicht nur mechanischen Belastungen, wie der Pulswelle oder einem Beugungs-, Stauchungs- und Scherstress, sondern auch chemischen Prozessen ausgesetzt. Dennoch muss sie ihre Funktionsfähigkeit möglichst lange, eventuell sogar über Jahrzehnte hinweg, behalten. Es hat sich jedoch gezeigt, dass mit zunehmender Verweildauer im Organismus die Gefahr von Prothesenrupturen und der Ausbildung von Aneurysmen ansteigt 79, so finden sich daher viele Fallberichte von spontanem und unerwartetem Prothesenversagen 80,81. [Besonders bei PET-Prothesen und deren fortschreitender Degradation durch Hydrolyse an Esterbindungen durch körpereigene Enzyme 82 lassen sich Haltbarkeit und somit Zuverlässigkeit kaum vorhersagen 83. Untersuchungen an Dacron -Prothesen zeigten einen Verlust von 60% der Be- 14

21 lastbarkeit bereits nach 5 Jahren Implantationsdauer 84, wiederum abhängig von der Textur des Kunststoffes. Abbildung 1.10: Faser einer nach 13 Jahren explantierten PET-Prothese. Die Beschädigungen sind deutlich erkennbar. Bildquelle 83 Mit dem Versagen einer Prothese muss also eigentlich gerechnet werden, die dauerhafte Heilung einer Gefäßerkrankung mit nur einem einzigen operativen Eingriff kann de facto nicht garantiert werden. Der (irgendwann) zwingend erforderliche und mit hohen Kosten verbundene Folgeeingriff stellt mit 2-3facher Mortalitätsrate 85 ein nicht zu unterschätzendes Risiko für Leib und Leben des Patienten dar. Der Haltbarkeitsverbesserung durch Optimierung vorhandener sowie die Erforschung neuartiger Materialien kommt somit zentrale Bedeutung zu Intimahyperplasie Carrell und Guthrie sahen 1906 bei der histologischen Auswertung ihrer Versuche eine Gewebsveränderung, die sie...hauptsächlich in einer markanten Verdickung von Bindegewebe in Adventitia und Media... beschrieben 29. Dies war die erste Beschreibung dessen, was später als Intimahyperplasie (IH) (s. Abb auf nächster Seite) bekannt und gefürchtet werden sollte. Diese pathologische Besonderheit wurde in der Literatur ausführlich beschrieben und u.a. intimale faserige Proliferation (1971) 86 oder intimale Verdickung (1975) 87 genannt. Aber erst mit der Einführung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden dort neben Fibroblasten auch glatte Muskelzellen identifiziert, 15

22 weshalb man den etwas weitläufigeren Begriff Intimahyperplasie wählte 88, der seither geläufig ist. Die Intimahyperplasie (IH) (auch als myointimale Hyperplasie, neointimale oder subendotheliale Hyperplasie bezeichnet) wird oft als das wichtigste, jedoch immer noch ungelöste Problem 89 der Gefäßchirurgie bezeichnet:... intimal hyperplasia is a devastating clinical problem and may be the most significant unresolved problem in the field of vascular surgery. It is very complicated and has defied simple solutions. 90 P IH End E.i E.e Adv. N Prothese Intimahyperplasie Endothel = Intima membrana elastica interna membrana elastica externa Adventitia Nahtmaterial (5/0 Prolene ) Abbildung 1.11: Histologie der Intimahyperplasie: Querschnitt durch einen mit Patchplastik versorgten Gefäßabschnitt (HE- Färbung; Vergrößerung 4fach). Der Stern markiert das Gefässlumen. Die überschießende Gewebsproliferation im Bereich des Patches ist deutlich erkennbar. Bild: Eigenmaterial Die Intimahyperplasie (IH) ist hierbei von der erwünschten Bildung funktionsfähiger Neointima mit Neoendothel abzugrenzen. Sie wird im Allgemeinen als response to injury -Reaktion eines Gefäßes mit Proliferation glatter Muskelzellen (GM) der Media verstanden. Diese migrieren innerhalb von etwa 6 Tagen in eine Masse aus gemischten Thrombus, der sich unmittelbar nach Verletzung der Elastica interna gebildet hat und nach 3-4 Tagen bereits mit Endothel überdeckt ist. Es kommt weiterhin zu einer Einwan- 16

23 derung von Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten 91 und zu einer Umbildung der GM vom ruhenden in den synthetisierenden Typ und der Produktion von extrazellulärer Matrix (Elastin, Kollagen) und Bindegewebe 92. Der Thrombus degeneriert und die glatte Muskulatur bildet förmlich eine darüber liegende Kappe. Die Neointima ist dann mit 21 Tagen voll ausgebildet, durch weitere Synthese extrazellulärer Matrix kommt es dann zur Hyperplasie. Vorhandenes Endothel wirkt im gesunden Gefäß durch Hemmwirkung regulierend auf diesen Prozess ein 93. Zudem verhindert gesundes Endothel die Thrombenbildung. Nachweislich findet sich jedoch nur eine inkomplette Endothelauskleidung in Gefäßprothesen, wobei der eigentliche Mechanismus der Ansiedlung nicht genau bekannt ist und wohl multifaktoriell bedingt ist. Es wurden daher bereits Versuche unternommen, die Endothelansiedelung in Prothesen aktiv zu betreiben 94. Das sogenannte ECS (endothelial cell seeding) ist eine Form dessen, wobei durch aufwendige Verfahren gewonnenes autologes Endothel an der unterschiedlich beschichteten Prothese haftbar gemacht wird und dabei die Neo-Endothelbildung nach Implantation zusätzlich induziert wird. Auch dieses Verfahren konnte sich trotz ermutigender Ergebnisse wegen des hohen Aufwandes in der breiten Anwendung bisher nicht durchsetzen. Die Ausschüttung von PDGF ( platelet derived growth factor ) durch vermehrt an der Kunststoffoberfläche adhärente Thrombozyten hält die Proliferation der IH innerhalb der nächsten Wochen aufrecht 95,96, was schlussendlich zur Beeinträchtigung des Lumens führt. Besonders im Bereich kleinerer Arterien können daraus leicht Stenosen oder sogar Totalverschlüsse resultieren. Die Mehrzahl aller Verschlüsse nach peripherer Gefäßoperation darf der IH angelastet werden 97,98. In der Unterdrückung oder zumindest der Verringerung von IH liegt somit großes Potential. Der compliance mismatch, also die Diskrepanz in der Dehnbarkeit zwischen Prothese und Arterienwand an der Anastomosenstelle und Strömungsverhältnisse im betroffenen Bereich, sog. shear-stress gelten als sehr wesentlich. Das relativ rigide Material der Anfangsära wurde in der Neuzeit immer wieder modifiziert und es entstanden z.b. sogenannte thin-wall -Prothesen. In zahlreichen Studien wurden die Strömungsverhältnisse im Anastomosenbereich und ihre Auswirkung auf die Ausbildung der IH beschrieben (siehe hierzu Abb auf der nächsten Seite). Die darin enthaltenen Ansätze zur Strömungsoptimierung wurden von der Industrie bereits aufgegriffen und in strömungsoptimierten Gefäßprothesen, wie zum Beispiel der Distaflo - Prothese der Firma Bard verwirklicht 105. Jedoch ist ein der Arterienwand vergleichsweise elastischer Kunststoff nur im Polyurethan gefunden worden, der aufgrund seiner ver- 17

24 minderten Biostabilität und damit erhöhten Degradationsneigung nur noch vereinzelt bei Dialyseshunts Verwendung findet. Abbildung 1.12: Prädilektionsstellen (rot dargestellt) der Intimahyperplasie nach Bypassoperation. Typischerweise betroffen sind die Hauben und Fersenregion sowie der Boden der Empfängerarterie, da dort besonders häufig Verwirbelungen auftreten. Die Pfeile geben die Flussrichtung des Blutstroms an [nach: Rösler SK, Die Hämodynamik von femoro-cruralen Bypassanastomosen in vitro Untersuchung mittels Particle Image Velocimetry, Dissertation HU Berlin, 2006]. Seit dem erste Tiermodelle entwickelt wurden, wo der Einfluss von Koronar-Stents im Gefäßsystem untersucht werden konnte, zeigte sich eine korrelierende Beziehung der Intimahyperplasie mit dem Grad der Verletzung 106. Auch inflammatorische Zellen sollen bei der Bildung von Intimahyperplasie eine Schlüsselrolle spielen 107. Es konnte ebenso tierexperimentell gezeigt werden, dass auch unabhängig vom Verletzungsgrad der Arterienwand eine auftretende Entzündungsreaktion eine vermehrte Intimahyperplasie bedingt 108. Die hierbei ablaufenden Prozesse ähneln im Wesentlichen denen der als allograft vasculopathy beschriebenen Transplantatabstoßung und lassen sich demnach durch Immunsuppressiva günstig beeinflussen 109. Dieser Ansatz nun wurde intensiv beforscht. In der Kardiologie wurden erstmals mit Immunsuppressiva beschichtete, sogenannte drug-eluting Stents wie z.b. Cypher oder XIENCE V eingesetzt. Die anfängliche Euphorie hat sich nach Auftreten von vermehrten Stentthrombosen aufgrund fehlender Bildung von Neointima und ungenügender Behandlung mit Antiaggregations- 18

25 hemmern jedoch gelegt und die Indikation zur Verwendung wird nun zurückhaltender gestellt. Zusätzlich nachteilig wirkt sich die jetzt notwendige doppelte Thrombozytenaggregationshemmung für bis zu 1 Jahr aus Einheilung / Inkorporation Die Einheilung von Kunststoffprothesen ist ein langfristiger Prozess, der mit Gewebereaktionen ähnlich denen bei der Einheilung aseptischer Fremdkörper einhergeht 84 und daher von Wesolowksi zuerst als Fremdkörpereinkapselung mit Bildung einer inneren und äußeren Kapsel gedeutet wurde 115. Die ablaufenden Gewebsreaktionen lassen sich histologisch und mikroskopisch in vier Stadien (dargestellt in Abb. 1.13) aufgliedern 84 : Abbildung 1.13: Zeitlicher Ablauf der Gewebereaktionen bei der Einheilung einer alloplastischen Gefäßprothese. Entnommen aus 84 Unmittelbar nach Freigabe des Blutstroms kommt es innerhalb der ersten Minuten zur Abdichtung des Maschenwerks durch Ausbildung eines Fibringerüstes, der sogenannten thrombogenen Matrix. Dadurch übernimmt die Prothese ihre Funktion als neuer Blutleiter (Stadium I). Diesem Stadium der Abdichtung folgt innerhalb der nächsten drei Wochen das Stadium der Gewebsinvasion. Hierbei sprossen Neo-Gefäße und juvenile Bindege- 19

26 webszellen aus der Umgebung in die Prothesenmatrix ein. Die luminale Seite bleibt währenddessen von einer Fibrinschicht ausgekleidet (Stadium II). Ab der vierten Woche beginnt sich eine bindegewebige Ersatzwand auszubilden. Dies geht mit Kapselbildung um den Kunststoff herum einher und kann zwischen sechs und zwölf Monaten andauern. Dabei bilden sich Inseln von Neointima und Neoendothelmanschetten (Pannusbildung) an den Anastomosen aus. Diesem Stadium der Organisation (III) folgt ab etwa dem zwölften Monat das Stadium der Degeneration (IV). Es kommt zu subintimalen Veränderungen und Schrumpfungen des umliegenden Gewebes, die mit Verkalkungen einhergehen können. Die möglichst kurzfristige Ausbildung einer Neointima mit geschlossener Endotheldecke gilt als wünschenswert, deshalb wurden insbesondere dünnwandige eptfe-prothesen zur schnelleren Inkorporation entwickelt. Eine seltene, aber komplikationsreiche unerwünschte Nebenwirkung der Implantation von Kunststoffprothesen jeder Art ist die so genannte Perigraftreaktion, deren Ursache noch nicht ganz geklärt ist. Dabei handelt es sich um eine aseptische Flüssigkeitsansammlung um die Prothese herum, mit einer fibrinösen Pseudomembran begrenzt, möglicherweise als Folge einer Filtration durch eine zu poröse Prothese mit ungenügender Abdichtung oder einer immunologischen Reaktion. Auch die Existenz eines transienten humoralen Fibroblasteninhibitors als Ursache wird diskutiert Unser Ansatz: Eine multifunktionelle Gefäßprothese Seit Jahrzehnten hat es trotz aller Anstrengungen auf dem Gebiet des alloplastischen Gefäßersatzes keinen entscheidenden Fortschritt mehr gegeben, die weitere Forschung zur Verbesserung der aktuell verfügbaren Prothesen wird als dringlich und lohnend angesehen 117. Denn momentan erfüllt keine der verfügbaren Prothesen alle Anforderungen an eine ideale Gefäßprothese. Unsere Arbeitsgruppe verfolgt nun mit der Entwicklung der multifunktionellen Gefäßprothese einen neuen Ansatz, um möglichst vielen der oben gelisteten Anforderungen gerecht zu werden: Eine handelsübliche PET-Prothese wird mit einer Hülle aus medical grade - Polydimethylsiloxan (=PDMS), einem üblichen Implantat-Silikon, ummantelt. Silikone sind biologisch inert und damit auch im Körpermilieu lange haltbar. Sie sind leicht verfügbar und dabei sehr preiswert. Im klinischen Alltag werden Silikone seit langem in vielen anderen Anwendungsbereichen verwendet und sind nicht mehr wegzudenken. Durch die Ver- 20

27 wendung von PDMS in der Herstellung einer Gefäßprothese ergeben sich auf einen Schlag mehrere gewichtige Vorteile: Die entstandene Prothese ist primär dicht und kann ohne weitere Vorbereitung direkt implantiert werden. Durch ein spezielles Veredelungsverfahren z.b. mit Polyvinylalkohol ist es möglich, der Silikonoberfläche dauerhaft athrombogene Eigenschaften zu verleihen. Gleichzeitig kann die Silikonmatrix mit beliebigen, pharmakologisch nutzbaren Molekülen zur späteren Freisetzung ( drug-elution ) versehen werden. Hierbei ist in erster Linie an Medikamente zur Unterdrückung der Intimahyperplasie zu denken, was unserem ersten Versuchsansatz entsprach, aber auch die Einbringung von Antibiotika oder Wachstumsfaktoren sind zukünftig denkbar Ziel der Arbeit Nachdem bereits durch unsere Arbeitsgruppe u.a. mittels physikalischer Tests und Untersuchungen am Rasterelektronenmikroskop nachgewiesen werden konnte, dass die neue Prothese hinsichtlich der Stabilität und Elastizität sowie bei der Handhabung, insbesondere bei der Nähbarkeit, herkömmlichen Prothesen ebenbürtig ist und in der Dichtigkeit überlegen ist, sind auch Versuche zur Medikamentenfreisetzung erfolgreich verlaufen 118. Die vorliegende Arbeit widmet sich nun der Auswertung der im Tiermodell gewonnenen Daten bezüglich folgender Fragestellungen: Gelingt im Tiermodell die Unterdrückung der Intimahyperplasie? Wie ist die Offenheitsrate im Vergleich zu handelsüblichen Prothesen? Wie verhält sich die Prothese im Tier bezüglich der Inkorporation? Lässt sich eine lokale Entzündungsreaktion unterdrücken? 21

28 2. Material und Methoden 2.1. Aufbau der multifunktionellen Gefäßprothese Verwendet wurde eine handelsübliche, gewirkte PET-Prothese, die sich den, im Folgenden geschilderten, durch unsere Arbeitsgruppe entwickelten, speziellen Beschichtungsverfahren unterzog. Durch maschinelles Beschichten mit PDMS soll primäre Dichtigkeit erreicht werden. Durch anschließende nasschemische Oberflächenmodifikation erhalten die Prothesen athrombogene Eigenschaften. Zusätzlich kann die PDMS-Matrix der Prothese mit beliebigen Substanzen wie z.b. Antibiotika oder Immunsuppressiva beladen werden, welche dann maßgeschneidert ins umliegende Gewebe abgegeben werden sollen. Damit ließen sich rein lokal Entzündungen, Infektionen und die Intimahyperplasie verhindern oder unterdrücken. Als Trägermaterial für die Beschichtung mittels einer selbsthergestellten Emulsion aus Polydimethylsiloxan MED 4211 mit einem Härtegrad von 30 Shore (Fa. NuSil) und Ethylacetat (=EtAc) (Stoffnummer 1173, R ; S ) dienten in diesem Versuch unbeschichtete 6mm durchmessende PET- Prothesen der Firma Edwards (Albograft ). Abbildung 2.1: Räumliches und strukturelles Modell von PDMS (laut Nomenklatur: catena-poly[(dimethylsilicium)-m-oxo]) 22

29 In mehreren Beschichtungsvorgängen mit jeweils anschließender Trocknung unter Abdampfen des Ethylacetats bei 70 C im Wärmeschrank wird die Prothese bis zur gewünschten Dichtigkeit beschichtet (Abbildung 2.2). Abbildung 2.2: Die native Prothese (a) wird durch die Beschichtung auf Innen- und Außenseite mit einem Silikonmantel (b) versehen. Bild mit freundlicher Genehmigung von A. Larena-Avellaneda, Hamburg Durch einen nass-chemischen Bearbeitungsschritt erhalten die so hergestellten Prothesen eine athrombogene Oberflächenmodifizierung. Hierzu werden geeignete Moleküle durch kovalente Bindung an die Außenseiten der PDMS Matrix gebunden (siehe Abbildung 2.3). Nach Vorstudien 119 erfolgte die Festlegung auf Polyvinylalkohol. Abbildung 2.3: Die Oberfläche der Prothese kann nun eine Oberflächenmodifizierung erhalten (a). Zusätzlich können beliebige Moleküle zur späteren Elution in die Silikonmatrix eingebracht werden (b). Bild mit freundlicher Genehmigung von A. Larena-Avellaneda, Hamburg 23

30 Durch einen weiteren nass-chemischen Prozess ist es jetzt möglich, Moleküle (Immunsuppressiva, Wachstumsfaktoren oder Antibiotika) zur späteren Freisetzung ( elution ) in die Silikonmatrix einzubringen Wahl des Immunsuppressivums Neben Paclitaxel (PAX) stand auch Sirolimus (SRL) zur Wahl. Da für PAX kein gewerblicher Assay verfügbar war, erfolgte die Festlegung auf Sirolimus (Rapamune, s. Abb. 2.4) der Fa. Wyeth, welches neben dem neueren Everolimus (Certican ) zur Senkung der Restenoserate geeignet erschien 109. Abbildung 2.4: Stäbchenmodell von Sirolimus. Bildquelle: ( ) Sirolimus (SRL, Rapamycin) ist ein makrozyklisches Immunsuppressivum aus streptomyces hygroscopicus. Dieser Bakterienstamm wurde erstmals im Boden der Insel Rapa Nui, auch bekannt als Osterinsel, gefunden. Daher auch der Name RapaMycin. 24

31 SRL inhibiert eine Reihe von cytokinvermittelten Signaltransduktionswegen durch Komplexbildung mit dem Protein mtor (mammalian Target of Rapamycin). Dieses hat zur Folge, dass das Voranschreiten der T-Zellen von der G1-Phase in die S-Phase des Zellzyklus verhindert wird 120. SRL ist im Gegensatz zu Tacrolimus oder Cyclosporin, welche die Interleukin 2 (IL-2) Produktion hemmen, kein Calcineurininhibitor, sondern hemmt direkt die Wirkung von IL-2. Nach Gabe von Rapamycin verringert sich die Proteinsynthese glatter Muskelzellen um 40-60%, gleichzeitig werden kontraktile Proteine exprimiert 121. Ein starker anti-proliferativer Effekt auf glatte Muskelzellen konnte nachgewiesen werden , eine Verwendung in drug-eluting stents lag somit nahe. Durch Langzeitergebnisse zeigte sich jedoch, dass ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen nötig ist, um spezifische Therapien gegen IH zu entwickeln. Aufgrund der Thermolabilität von Sirolimus wurden die Prothesen abschließend im Plasmasterilisator (Sterrad -System, Fa. Johnson&Johnson) sterilisiert Tiermodell Die Wahl des Versuchstiers wurde nach Literaturrecherche getroffen. Die Mehrzahl ähnlicher Versuchsreihen wurde entweder mit Hunden diverser Art oder am Minischwein durchgeführt. Aufgrund der leichteren Handhabe und Verfügbarkeit entschieden wir uns für das Minischwein. Abbildung 2.5: Göttinger Minischwein ID# 421; - (=kastriert) Körpermasse 60,4kg ein typischer Vertreter für die im Versuch verwendeten Tiere 25

32 Vorversuch Nach Vorversuchen mit 46 Hunden 123, folgte eine Versuchsreihe an 6 Göttinger Minischweinen, sogenannten mini-pigs zur Ermittlung des zu verwendenden Immunsuppressivums. Das OP-Team bestand aus einem am Klinikum tätigen Facharzt für Gefäßchirurgie, einem chirurgischen Assistenten, einem Anästhesisten und einem Tierpfleger. Alle Operationen wurden im Tier-OP der experimentellen Chirurgie der Universität Würzburg durchgeführt. Präoperativ wurde ein Langzeitantibiotikum (Ampicillin) und ein Sedativum (Stresnil-Janssen ) verabreicht. Nach Intubationsnarkose erfolgte unter sterilen Bedingungen eine Medianlaparatomie in Rückenlage. Je zwei Tieren wurde entweder mit Sirolimus, Paclitaxel oder IS (aus patentrechtlichen Gründen darf der Name des weiteren Immunsuppressivums nicht genannt werden)... beladenes und freisetzendes (vgl. Kap. 2.1.) Prothesenmaterial in die Iliakalgabel eingesetzt. Auf der Gegenseite wurde als Kontrolle jeweils ein herkömmlicher kollagenisierter Prothesenstreifen, sog. patch in die eröffnete Gefäßwand eingenäht. Die Implantation erfolgte beidseits in gegenläufiger 4 Punkt-Technik mit 5/0 USP (Prolene ). Zur Antikoagulation wurden 3000 IE Heparin verabreicht. Das Retroperitoneum wurde mit resorbierbarem Nahtmaterial (Maxon 4/0) vernäht, die Bauchdecke mittels PDS II -Schlingennaht verschlossen. Die Hautnaht nach Donati erfolgte mit 2/0 Prolene und wurde zusätzlich mit Sprühpflaster versorgt. Nach beendeter Operation verblieben die Tiere über Nacht in Intensivüberwachung und erhielten Tramal und Novalgin s.c. zur Schmerzstillung, die anschließende Betreuung erfolgte im Tierhaus der Universität. Postoperativ wurde täglich 100mg ASS zur Antikoagulation verabreicht. Nach 6 Wochen wurden die Tiere eingeschläfert und die Iliakalgabeln zur histologischen Aufarbeitung explantiert Hauptversuch Die abschließende Tierstudie mit 24 Tieren gliederte sich in Bypass- und Patch-OPs. Als Versuchsspezies dienten wiederum Göttinger Minischweine. Die Tiere wurden in vier Gruppen zu je sechs Tieren randomisiert, in jeder Gruppe erfolgte bei je 3 Tieren beidseits die Implantation eines ca. 8 cm langen Prothesenstücks, beziehungsweise das Einnähen eines ca. 3x1cm messenden Patches im Gebiet der Iliakalgabeln. In der Kontrollgruppe fand handelsübliches, kollagenisiertes Prothesenmaterial (Albograft Ø6mm, Fa. 26

33 Edwards) Verwendung. Für die drei anderen Gruppen wurden native Ø 6mm PET- Prothesen der Fa. Edwards mit dem in Kapitel 2.1. beschriebenen Verfahren silikonisiert. Das Silikon der ersten Gruppe erhielt eine Oberflächenmodifikation mit PVA, bei dem der zweiten Gruppe wurde Sirolimus zur späteren Freisetzung eingebracht. Das Silikon der dritten Gruppe enthielt Sirolimus und wurde zusätzlich mit PVA oberflächenmodifiziert (siehe hierzu Tabelle 2.1 auf nächster Seite). Das OP-Team bestand aus einem Facharzt für Gefäßchirurgie, einem chirurgischen Assistenten, sowie einem Anästhesisten und einem Tierpfleger. Alle Operationen wurden im Tier-OP der experimentellen Chirurgie der Universität Würzburg durchgeführt. Präoperativ wurde ein Langzeitantibiotikum (Ampicillin) und ein Sedativum (Stresnil-Janssen ) verabreicht. Nach Intubationsnarkose erfolgte unter sterilen Bedingungen eine mediane Laparatomie in Rückenlage. Der Anatomie männlicher Versuchstiere musste beim Zugang zusätzlich Rechnung getragen werden. Der Harnröhrenausgang liegt, optisch einem menschlichen Nabel ähnlich, median im Unterbauch, und somit direkt im Bereich unserer Laparatomie. Wir passten die Schnittführung in diesem Bereich ähnlich einem Nabelschnitt halbkreisförmig an, um diese anatomischen Strukturen zu schonen. Um das Eindringen von möglicherweise keimbelastetem Harn in die Bauchhöhle zu verhindern, punktierten wir intraoperativ mehrmals die Harnblase und leiteten den Harn steril ab. Unter zu Hilfenahme eines Selbsthalters (Omnitract, Fa. Medino) erfolgte die Darstellung der Iliakalgabeln beidseits. Unter Antikoagulation mit 3000 IE Heparin. erfolgte die Implantation des jeweiligen Prothesenmaterials in gegenläufiger 4 Punkt-Technik mit 5/0 Prolene im Gebiet der Iliakalgabeln. Nach Freigabe der Strombahn erfolgte zum Nachweis der SRL-Elution in vivo nach 5, 15, 30 und 60 min eine Blutentnahme. Das Retroperitoneum wurde mit resorbierbarem Nahtmaterial (Maxon 4/0) vernäht, die Bauchdecke mittels PDS II Schlingennaht verschlossen. Die Hautnaht nach Donati mit 2/0 Prolene wurde zusätzlich mit Sprühpflaster versorgt. Nach beendeter Operation verblieben die Tiere über Nacht in Intensivüberwachung und erhielten Tramal und Novalgin als s.c. Depot zur Schmerzstillung, die anschließende Betreuung erfolgte im Tierhaus der Universität. Postoperativ wurde täglich 100mg ASS p.o. zur Antikoagulation verabreicht. Die überlebenden Tiere der Bypassgruppe wurden nach 6 Monaten eingeschläfert und die Anastomosenregion zur Bestimmung der Offenheitsrate explantiert. Die Tiere mit Patchplastik wurden zum Zeitpunkt der theoretisch größten Ausprägung der IH (nach ca. 6 Wochen) eingeschläfert und der gepatchte Gefäßabschnitt zur Auswertung der Intimahyperplasie explantiert. 27

34 ID m / - Geplante OP Prothesentyp ,4 - Bypass bds. Edwards kollag ,8 Bypass bds. = Kontrolle ,0 Bypass bds. 7 55,0 - Patch bds ,7 - Patch bds ,0 Patch bds ,1 - Bypass bds. Edwards nativ, ,8 - Bypass bds. silikonisiert +PVA ,0 Bypass bds ,8 Patch bds ,0 Patch bds. 227 n/a - Patch bds. 4 60,3 Bypass bds. Edwards nativ, ,2 Bypass bds. silikonisiert+ SRL ,5 - Bypass bds ,8 - Patch bds ,0 - Patch bds ,0 - Patch bds ,7 - Bypass bds. Edwards nativ, 74 72,0 - Bypass bds. silikonisiert+srl+pva 79 58,7 Bypass bds ,0 - Patch bds ,5 - Patch bds ,9 - Patch bds ,7 - Patch re. Edwards nativ, ,1 Patch re. silikonisiert+pax (Vorversuch) Tabelle 2.1: Aufgliederung des Tierversuches. Einer Kontrollgruppe von 6 Tieren wurde das Kollagenprothesenmaterial von Edwards eingesetzt, die anderen gleich starken Gruppen erhielten entweder oberflächenmodifizierte (PVA), immunsupprimierende (SRL) oder kombinierte Beschichtungen (SRL+PVA). mit einer nativen, silikonisierten PET-Prothese als Grundlage. Zusätzlich die Gruppe mit Paclitaxel beschichteter Prothesen aus dem Vorversuch. 28

35 2.4. Histologische Aufarbeitung der Gefäßabschnitte Zuschneidung und Einbettung in Paraffin Die in Formalin fixierten Gefäße wurden in standardisierter Weise zurechtgeschnitten sowie proximal und distal markiert. Anschließend erfolgte die Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe (40%-70%-90%) für je 24 Stunden. Der Alkohol wurde dann durch Einlegen in Xylol entfernt. Nachfolgend sind die Gefäßsegmente in Paraffin gesättigtes Xylol übertragen und dann in reines Paraffin gelegt worden, welches dann nochmals gewechselt wurde, wo sie dann 5 Stunden verblieben. Diese Prozeduren verliefen im Brutschrank. Es erfolgte schließlich die Einschmelzung eines frischen Paraffinblocks und das Übertragen der Präparate in eine Einbettkassette. Das anschließende Schneiden der Gewebsblöcke wurde mit dem Mikrotom mit einer Schichtdicke von 5 µm durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass insbesondere im Anastomosenbereich doch häufig das Prothesenmaterial und die Neointima ausrissen. Die Schnitte wurden auf dem Objektträger platziert und dann entparaffiniert. Dieses geschah nun wieder durch Bedeckung mit Xylol für kurze Zeit im Thermostat. Zur Vorbereitung der Färbung erfolgte das Einlegen der Schnitte in einer absteigende Alkoholreihe (90%-60%) HE-Färbung Zur morphologischen Untersuchung wurde eine Standard-Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (HE) durchgeführt. Dabei zeigen sich die Zellkerne blau und das Zytoplasma und die Interzellularsubstanz rosa bis pinkfarben. Die Schnitte wurden 5 min zur Kernfärbung in Mayers Hämalaun Lösung (Fa. Merck, Darmstadt) und nach anschließendem Spülen mit Wasser für weitere 5 min in die Eosin-G-Lösung (Fa. Merck, Darmstadt) zur Gegenfärbung gelegt. Nach dem erneuten Spülen mit Leitungswasser erfolgte wieder die Entwässerung in einer ansteigenden Alkoholreihe und schließlich die Einbettung in Neomount 29

36 E-v-G-Färbung Zur Differenzierung von Zellkernen, Muskulatur, Bindegewebe und elastischen Fasern wurde nun eine zweite Färbemethode verwendet. Im Ergebnis zeigen sich hier die Zellkerne braun bis schwarz, die elastischen Fasern schwarz und die Muskulatur gelb sowie das Kollagen rot. Die Elastica-van Gieson-Färbung wird ebenfalls mit einer gewerblich vertriebenen Lösung der Fa. Merck nach standardisiertem Prozedere vollzogen. Dabei werden die Schnitte in typischer Weise wieder entparaffiniert und rehydratisiert. Es erfolgt zuerst die Elastin-Färbung nach Weigert für 10 min, nach Spülen in fließendem Leitungswasser wird Weigerts Lösung A und B 1:1 gemischt und 5 min angewendet. Nachfolgend dann erneutes Spülen mit Leitungswasser und Baden in Pikrofuchsin- Lösung für 2 min sowie die Fixierung mit 70% Ethanol für 1 min. Die Entwässerung erfolgt wieder in aufsteigender Alkoholreihe. Schließlich werden die Präparate wiederum mit Neo-Mount eingedeckt Auswertung Beurteilung der Offenheitsrate Direkt nach Explantation wurde die Offenheitsrate durch einen Spülversuch mit Wasser ermittelt. Im Falle eines Verschlusses wurde längs eröffnet und der Befund makroskopisch verifiziert. Die Auswertung erfolgt anhand der Tierversuchsprotokolle. Anschließend wurde die Fixierung in Formalin vorgenommen. Die so fixierten Präparate wurden dann weiter bearbeitet und in Paraffin eingebettet. Die Färbung erfolgte, wie oben beschrieben, in HE (Hämatoxilin-Eosin) und EvG (Elastica nach van Gieson) in unserem gefäßmedizinischem Forschungslabor am UKE Hamburg Semiquantitative Einschätzung der Einheilung Die Auswertung und Beurteilung der Schnitte hinsichtlich Entzündungsreaktion und Einheilungsmuster wurde am Institut für Anatomie und Experimentelle Morphologie des UKE vorgenommen und semiquantitativ unter dem Lichtmikroskop eingeschätzt. Die Quer- 30

37 schnitte auf dem Objektträger variierten in der Anzahl von 1-4, die sämtlich befundet wurden. Die Inkorporation wurde ähnlich, wie McGee et al. 124 und Kang et al. 125 es beschrieben, graduell aufsteigend, von keine bis komplette Einheilung, eingeschätzt (s. Tabelle 2.2). 0 = keine Einheilung 1 = minimale Einheilung 2 = moderate Einheilung 3 = komplette Einheilung Tabelle 2.2 Graduierung der Inkorporation ähnlich McGee und Kang Semiquantitative Einschätzung der Entzündungsreaktion Die Entzündungsreaktion wurde ebenfalls unter dem Lichtmikroskop entsprechend des von Hofma 126 aufgestellten Scores in 4 Ausprägungsgrade (0-3) eingeteilt (s. Tabelle 2.3): Präparate in denen keine Entzündungszellen (Neutrophile Granulozyten oder Fremdkörper-Riesenzellen) zu sehen waren, wurden in Kategorie 0 eingestuft. Die Präparate mit nur sehr wenigen Entzündungszellen wurden in Kategorie 1 eingeordnet. In Kategorie 2 fielen diese mit gering bis mittelgradiger Anhäufung. Alle Präparate bei denen schon in der Übersichtsvergrößerung massive Ansammlungen von Entzündungszellen erkennbar waren, wurden in Kategorie 3 eingestuft. 0 = keine Entzündungsreaktion 1 = Entzündung infiltriert die Adventitia 2 = diffuse, klar sichtbare Entzündung infiltriert die Adventitia 3 = schwere, oft granulomatöse Entzündungsreaktion in der Adventitia, teilweise bis in die Intima ausgedehnt Tabelle 2.3: inflammatory response n. Hofma et al. 31

38 Morphometrische Messung der Intimahyperplasie Zusätzlich zu einer auch durchgeführten semiquantitativen Einschätzung sollte besonderes Augenmerk auf die Quantifizierung der Intimahyperplasie an den Präparaten der Patch-Serie gelegt werden. Neben einer Ausmessung der Intimahyperplasie in genau festgelegten Abständen und Errechnung eines Mittelwerts stand auch die Methode der IH-ratio 127 zur Auswahl (siehe Abbildung 2.6). Diese Methode erbrachte zwar in Studien von Terry et al. verlässliche Ergebnisse 128, aber war für unsere Arbeitsgruppe in dieser Form nicht praktikabel. Abbildung 2.6: Methode der IH-ratio : Die Fläche der IH auf der Lumenseite wird optometrisch ermittelt und mit der Breite des Patches ins Verhältnis gesetzt. Bild aus 127 Daher erschien eine Kombination dieser beiden Methoden als gute Alternative. Die Messung erfolgte an den HE-gefärbten Schnitten. Durch das Digitalisieren der Schnitte mit der Okularkamera und Verarbeitung mittels Software zur histomorphometrischen Auswertung (Pannoramic Viewer, Fa. 3DHISTECH Ltd.), musste noch das Fällen des Lots zur augenscheinlichen Verlaufsrichtung der Intimahyperplasie manuell erfolgen. Die Längenmessung des Lotes erfolgte per Auswertungssoftware und wurde direkt in die Datenverarbeitung eingespeist. Dadurch kann die Messarbeit exakt und trotzdem schnell erfolgen. Durch die entfernungsunabhängige Messpunktauswahl unter einem Winkel von 20 wird die Wahrscheinlichkeit einer schnitttechnisch bedingten Fehlmessung sowie die Einflussnahme des Anwenders auf die Wahl der Messpunkte stark vermindert. Alle Schnitte wurden zur späteren Auswertung unter Verwendung einer digitalen Mikroskopkamera 32

39 (Auflösung 1,2 Megapixel) und eines Objektmikrometers fotografiert und archiviert. Mittels Auswertungssoftware erfolgte die Vermessung der Intimahyperplasie. An jeweils drei durch die Schablone (s. Abbildung 2.7 ) definierten Punkten wurde die Di cke der Intima durch Mittelwertbildung bestimmt. Abbildung 2.7: verwendetes Schema zur Quantifizierung der IH: durch Verwendung eines 20 Rasters wurden pro Seite 3 Schnittpunkte mit der Intima bestimmt. Durch Fällen eines Lots (blau) zur augenscheinlichen Verlaufsrichtung der Elastica Interna (schwarz unterlegt) oder der Intima wurde die Dicke der Schicht an diesen 3 Punkten bestimmt und die erhaltenen Werte gemittelt Statistische Auswertung Alle im Tiermodell gewonnenen Daten wurden mit den Programmen MS-Excel und SPSS v18 weiterverarbeitet. Eine Untersuchung auf statistisch signifikante Abweichungen erfolgte mit dem t-test für unabhängige Stichproben (metrische Parameter). Mittelwertbildung und Standardabweichung sowie der Kruskal-Wallis-Test wurden für eine beschreibende Statistik herangezogen, das Signifikanzniveau wird einseitig mit 0,05 festgesetzt. 33

40 3. Ergebnisse 3.1. Tiermodell Vorversuch Bei der Implantation der medikamentenfreisetzenden Silikonpatches (2x SRL, 2x PAX, sowie 2x IS) sowie der kollagenisierten Kontrollpatches in die Iliakalarterien der Minischweine hatten sich intraoperativ keine Besonderheiten ergeben. Alle Materialien erwiesen sich als ausreichend dicht (s. Abb. 3.1b). Die Handhabbarkeit der Prothesen wurde vom Operateur als ordentlich beschrieben. Vermehrte Stichkanalblutungen traten nicht auf. Abbildung 3.1: Kollagenisiertes (a) und silikonisiertes Prothesenmaterial (b) nach Freigabe des Blutstroms. Während bei Kollagenprothesen ein Blutverlust durch das Maschenwerk feststellbar ist, imponiert die Wand silikonisierter Patches blutdicht. (a) zeigt eine Microvel -Prothese (Fa. Boston Scientific) aus den Hundevorversuchen 123 Bei einem Tier kam es nach vier Wochen zu einer Bauchdeckennekrose aufgrund eines infizierten Hämatoms. Es fand sich jedoch kein Kontakt zum retroperitonealen Situs. Zwei der Tiere hatten geringfügig an Gewicht verloren, die andern hatten zugenommen. Es wurden zu keiner Zeit klinische Zeichen für eine Ischämie der Hinterläufe festgestellt. 34

41 Unabhängig vom verwendeten Material waren alle Prothesen gleich gut eingeheilt, das Retroperitoneum imponierte reizlos. Bei Explantation nach 6 Wochen fiel bei zwei Tieren (1x Kontrolle, 1x IS-Silikon) ein Verschluss der Iliakalgefässe auf. Mit den medikamentenfreisetzenden Prothesen konnte eine bereits makroskopisch erkennbare Reduktion der Intimahyperplasie erzielt werden, wie in den Bildern von Abbildung 3.2 ersichtlich ist. Abbildung 3.2 a-d: Intimahyperplasie in makroskopischer und mikroskopischer Darstellung. In (a) ist die luminale Seite des PAX enthaltenden Patches zu sehen. Im Gegensatz zur Kontrolle (b) findet sich eine deutliche Zellreduktion. Dies zeigt sich auch in (c) durch eine diskrete Zellauflagerung, während in (d) eine deutliche Verdickung zu erkennen ist. (Pfeile). (a,b) aus 123 c,d aus

42 Hauptversuch Die Darstellung der Iliakalgabeln erwies sich aufgrund der Situsverhältnisse, trotz des verwendeten Selbsthalters, als unerwartet schwierig und zeitaufwendig (Darstellung der OP in Abb. 3.3). Durch erhöhte Vulnerabilität der porzinen Blutgefäße gegenüber gefäßchirurgischen Manipulationen musste besonders sorgfältig und vorsichtig operiert werden, der Zeitbedarf der OPs stieg hierdurch zusätzlich an. Das silikonisierte Prothesenmaterial von Edwards imponierte steifer als das silikonisierte Material der Vorversuche; hier war Prothesenmaterial der Firma Intergard verwendet worden. Das verwendete Prothesenmaterial erwies sich als primär dicht, Stichkanalblutungen wurden nicht beobachtet. Abbildung 3.3, a-d: Darstellung der OP-Vorgehensweise anhand einer Patchplastik: a) Aufsuchen der Iliakalgabel b) Darstellung der Iliakalgefäße nach Eröffnen des Retroperitoneums c) Abklemmen der Gefäße und Einnähen des Prothesenmaterials d) nach Entfernung der Klemmen. 36

43 In keiner der Operationen kam es zu nennenswerten Komplikationen, alle Tiere überlebten den Eingriff. Bei den Tieren der Patchgruppe war der Puls der Hinterläufe postoperativ bei jedem Tier gut zu tasten; Ischämiezeichen wurden nicht festgestellt. Bei zwei Drittel aller Kollagen-Bypässe traten intraoperative Frühverschlüsse auf, es wurde in diesen Fällen beidseitig thrombektomiert. Bei silikonisiertem Material war dies nur bei einem einzelnen Bypass erforderlich. Die Bypass-OP erwies sich aufgrund ihrer längeren OP- Dauer im Vergleich zur Patch-OP als kräftezehrender. Während die Patch-Tiere sich schnell vom Eingriff erholten und bereits nach wenigen Stunden wieder auf ihren Beinen standen, brauchten die Bypass-Tiere eine 2-3h längere Erholungsphase. Die Gewichtsveränderung der bis zum Versuchsende verbleibenden Tiere betrug im Schnitt (Mittelwert±SD) 2,5 ±3,7kg (n=23); in Patch- und Bypassgruppe (n=11 bzw. n=12) ergaben sich Werte von 0,6 ±1,5kg respektive 3,9 ±4,2kg. Postoperativ trat bei einem Tier nach Dehiszenz eine Bauchdeckeninfektion auf, vermutlich wurde die Bauchnaht durch ein anderes Tier manipuliert. Der Infektherd wurde reseziert und die Wunde neu vernäht, worauf sich das Tier rasch erholte. Drei andere Tiere (alle mit Bypässen versorgt) verweigerten nach wenigen Tagen die Nahrungsaufnahme oder fielen durch Funktionsverlust der Hinterbeine auf. Bei einem dieser Tiere (SRL-Bypass) fand sich ein vollständiger Verschluss der Aortenstrombahn. Es fand sich kein operationstechnischer Fehler, die Ursache blieb ungeklärt. Ein weiteres Tier (PVA-Bypass) zeigte ein massives, infiziertes Bauchdeckenhämatom, es fand sich zudem eine Unterbauchperitonitis sowie ausgeprägte Darmverwachsungen unklarer Genese. Das dritte Tier (SRL+PVA-Bypass) litt an einem Verwachsungsbauch sowie an einem epifaszialen Bauchdeckeninfekt. Hierfür ist unseres Erachtens eine im Situs gelandete Fliege verantwortlich zu machen. Diesen drei Tieren konnte trotz Re-OP nicht geholfen werden, sie mussten schon nach sieben, neun, beziehungsweise zwölf Tagen vorzeitig eingeschläfert werden. Die verbleibenden Tiere waren bis zum Versuchsende alle gesund, keines hatte Verhaltensauffälligkeiten oder Ischämiezeichen gezeigt. In den intraoperativ abgenommenen Blutproben ließ sich bereits in der nach fünf Minuten abgenommenen Probe ein Sirolimus-Spiegel von 1,5 ng/ml = µg/l nachweisen. Nach 15 Minuten wurde < 0,5ng/ml, nach 30 bzw. 60 Minuten ein Wert von 0,5 ng/ml bzw. 1,0 ng/ml ermittelt. Bei der Explantation der Patches (n=22) fand sich makroskopisch nur ein SRL+PVA Patch nicht ausreichend inkorporiert, alle anderen waren reizlos eingeheilt und gut inkorporiert (siehe Abbildung 3.4 auf nächster Seite). 37

44 Abbildung 3.4: Typischer Situs bei Explantation: Es findet sich ein reizloses Retroperitoneum. Bei einem der Kontrollbypässe (n=6) fiel eine Entzündung sowie fehlende Endothelialisierung auf. Bei einem Tier der SRL-Gruppe war nur noch ein schmallumiger, aber blutdurchströmter Prothesenrest auffindbar, das Prothesenmaterial zeigte schwerste Anzeichen von Prothesendegeneration. In der PVA-Gruppe zeigte ein Bypass fehlende Inkorporation, die restlichen Prothesen waren makroskopisch gut eingeheilt. Alle PVA+SRL- Prothesen waren ebenfalls gut eingeheilt, in einem Fall fiel jedoch eine ausgeprägte Verdickung der Gefäßwand auf Makroskopische Beurteilung der Offenheitsrate In den mit Wasser durchgeführten Spülungen der Explantate erwiesen sich in der Bypass-Gruppe nach 6 Monaten alle die mit nativer Kollagenprothese (n=6) als verschlossen. Bei den Bypässen mit Silikonmaterial waren 7 von 12 verschlossen. In der Gruppe der 11 Tiere, die mit einem Patch versorgt wurden, waren sämtliche Rekonstruktionen (n=22) zum Zeitpunkt der Explantation nach 6 Wochen offen. 38

45 3.3. Histopathologische Auswertung Bei der Beurteilung konzentrierten wir uns aufgrund der hohen Verschlussrate der Bypassgruppe ausschließlich auf die bei den 11 Tieren beidseits explantierten Patches (n=22). Zusätzlich wurden die aus dem Vorversuch gewonnen Daten der mit Paclitaxel beschichteten Patches mit in die Analyse einbezogen. Zum Vergleich wurden die Präparate, den o.a. Scores entsprechend, mit einem Punktwert versehen, der erreichte Gesamtwert durch die Anzahl der Präparate dividiert, um einen Mittelwert zu erhalten Inkorporation Die Einheilung verlief bei den Kollagenpatches der Kontrollgruppe (x) in allen Präparaten komplett (Graduierung 3,0). Die zusätzlich mit Sirolimus (SRL) beschichteten Patches zeigten mit einem durchschnittlichen Wert von 1,81 die vergleichsweise schlechteste, aber immer noch eine befriedigende Inkorporation. Nur unwesentlich besser war das Ergebnis mit Sirolimus und Polyvinylalkohol (SRL+PVA) bei einem Wert von 1,87. Paclitaxel (PAX) und die rein mit Polyvinylalkohol (PVA) oberflächenbehandelten Patches zeigten mit 2,6 und 2,2 eine etwas stärkere und damit ebenfalls eine gute Einheilung (siehe dazu Abb. 3.5 ). 3 Einheilung 2,5 2 1,5 1 0,5 0 x SRL SRL+PVA PVA PAX Abbildung 3.5: Diagramm zur Darstellung der semiquantitativen Auswertung der Einheilung. Der Ausprägungsgrad 3 entspricht dabei der kompletten Einheilung. 39

46 Entzündungsreaktion Unter lichtmikroskopischer Betrachtung bei bis zu 40 facher Vergrößerung, waren die Schnittserien hinsichtlich einer bestehenden Entzündungsreaktion um das eingebrachte Fremdmaterial gut zu beurteilen. Die Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Fremdkörperriesenzellen galt als Kriterium und wurde entsprechend dem in Kap beschriebenen Score von 0-3 graduiert. Insgesamt war die Entzündungsreaktion bei den beschichteten Silikonprothesen deutlich stärker ausgeprägt als in der Kontrollgruppe (s. Abb.3.6), sie war meist schon in Übersichtsvergrößerung als Ansammlung von neutrophilen Zellen erkennbar. Die stärkste Reaktion war bei den mit SRL+PVA beschichteten Patches zu beobachten (2,5). Etwas weniger stark war die Infiltration mit Entzündungszellen bei den nur mit SRL beschichteten Implantaten zu verzeichnen (2,4). Eine ebenfalls vermehrte Inflammation zeigten sich bei der PAX-Gruppe aus den Vorversuchen (1,6) und nur unwesentlich weniger bei den PVA-beschichteten Prothesen (1,5). Im histologischen Bild der Kontrollgruppe hingegen fanden sich kaum Entzündungszeichen (0,6). 3 Entzündung 2,5 2 1,5 1 0,5 0 x SRL SRL+PVA PVA PAX Abbildung 3.6: Diagramm zur Darstellung der semiquantitativen Auswertung der Entzündungsreaktion. Der Ausprägungsgrad 3 entspricht dabei dem Maximum. 40

47 Morphometrie der Intimahyperplasie Bei mikroskopischer Begutachtung der HE-gefärbten Präparate war dem Verlauf der Lamina elastica interna problemlos zu folgen. In allen Präparaten war es problemlos möglich, die Intimahyperplasie vom gesundem Gewebe abzugrenzen. Eine auffällig verdickte Intima im Patchbereich zeigte sich bei allen Prothesen (s. nachfolgende Abb ) Abbildung 3.7: Digitales Photomerge eines Präparats aus Tier 7 (Kontrollgruppe): Hier hat sich eine deutliche Intimahyperplasie (Doppelpfeil) entwickelt. Die Elastica interna (einfache Pfeile) ist leicht auszumachen. Kaum Entzündungszeichen. 41

48 Abbildung 3.8: Digitales Photomerge von Präparat 34 (Sirolimuselution) bei Übersichtsvergrößerung: zwischen Lumen (*) und silikonisiertem Patch hat sich Intimahyperplasie (Doppelfeil) entwickelt. Man erkennt zudem einen neutrophilen Zellsaum im Gewebe um den Patch herum, der für ein entzündliches Geschehen spricht. Die Lamina elastica interna ist durch einfache Pfeile markiert. Das Patchmaterial wurde beim Schneiden akzidentiell entfernt, es sind nur noch vereinzelte Fasern erkennbar. 42

49 Abbildung 3.9 a&b: Digitales Photomerge von Präparaten aus Tier 22 (Sirolimuselution + PVA Modifikation): Zugleich Beispiel für Variabilität innerhalb eines Tieres. a) Iliakalgefäß auf linker Seite: subtotaler Verschluss durch IH (Doppelfeil) b) Iliakalgefäß auf rechter Seite: Auch hier hat sich Intimahyperplasie (Doppelpfeil) entwickelt. Deutliche Ausprägung eines neutrophilen Saums zwischen IH-Zone und Patchmaterial. 43

50 Abbildung 3.10: Digitales Photomerge von Präparat aus Tier 399 (PVA-Modifikation): Es zeigen sich IH und diskrete Entzündungszeichen Abbildung 3.11: Digitales Photo eines Präparats aus Tier 111 (Paclitaxel): Auch hier hat sich eine Intimahyperplasie (Pfeil) entwickelt, die vergleichsweise jedoch geringer ausgeprägt ist. Die Elastica interna ist leicht auszumachen. Auch in der Übersichtsaufnahme sind Entzündungszellen zu sehen. 44

51 Intimadicke in mm Nach im Kap beschriebenem Schema erfolgte nun die Ausmessung der Intima anhand der digitalisierten Schnittbilder mittels Auswertungssoftware. Dabei wurde auch die dem Patch gegenüber befindliche, also die gesunde Seite untersucht. Hierbei zeigten sich in den Messungen keinerlei Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. Wie in Kap bereits erwähnt wurden alle Schnitte (1-4 pro Objektträger) beurteilt, daher ergeben sich folgende Werte. Bei insgesamt 180 ausgewertetenen Messungen betrug die Intimadicke im Mittel 0,0293 ± 0,012 mm, für die Kollagenkontrolle (n=57) 0,032 ± 0,014 mm, für SRL+PVA (n=45) 0,028 ± 0,005 mm, für SRL (n=33) 0,027 ± 0,007 mm und für PVA (n=27) 0,029 ± 0,006 mm sowie für PAX (n=18) 0,030 ± 0,003 mm.bei der Messung der Intimahyperplasie im Patchbereich wurden insgesamt und in den einzelnen Gruppen gleich viele Werte gemessen. Hier variierte die Intimadicke teilweise inter- und intraindividuell beträchtlich. Es zeigten sich hier erwartungsgemäß deutlich höhere Messwerte im Vergleich zu den gesunden Gefäßabschnitten. Überraschender Weise war jedoch bei den beschichteten Prothesen, mit Ausnahme der Paclitaxel-Gruppe aus den Vorversuchen, eine deutlichere Intimahyperplasie als in der Kontrollgruppe zu messen. Für Kollagen wurde sie mit 0,783 ± 0,408mm, für SRL mit 1,567 ± 0,523 mm, für PVA mit 1,308 ± 0,441 mm und für die Kombination von SRL+PVA mit 1,564 ± 0,421mm ermittelt. Bei PAX fand sich eine mittlere Dicke der IH von 0,421 ± 0,168 mm. Eine zusammenfassende graphische Darstellung dessen findet sich in Abb ,5 1,567 1,308 1, ,783 gesund Patch 0,5 0, ,032 0,027 0,029 0,028 0,030 Kontrolle SRL PVA PVA+SRL Paclitaxel Abbildung 3.12: Mittlere Intimadicke der gesunden Gefäßwand sowie mittlere Dicke der Intimahyperplasie auf Patchseite in Übersicht. 45

52 Dicke der IH (in mm) im Patchbereich 3.4. Statistische Auswertung. Die Art der Prothese hatte keinen signifikanten (p<0,05) Einfluss auf die Dicke der Intima der gegenüberliegenden Gefäßwand.. Die Varianz der Messwerte war in der Kollagengruppe am größten, die Mittelwerte unterschieden sich nicht signifikant. Die Dicke der Intimahyperplasie auf Patchseite hingegen war signifikant (p<0,05) von der Anwesenheit von Fremdmaterial abhängig. Die Varianzen der Messwerte unterschieden sich bis auf die PAX-Gruppe nicht wesentlich (siehe Abbildung 3.13). Daraus errechnet sich ein IH-Faktor (durchschnittliche Dicke der Intimahyperplasie zur Dicke der gesunden Gefässwand) von 24,6 für die Kollagen Kontrollgruppe, von 58,1 für SRL, von 44,8 für PVA und von 56,2 für die Kombination von SRL+PVA sowie von nur 12,6 für Pax. Im Durchschnitt fand sich die Intimahyperplasie in der Pax-gruppe also am geringsten ausgeprägt (siehe Abbildung 3.13). 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 Kollagen PAX PVA SRL+PVA SRL Art des implantierten Materials Abbildung 3.13: Boxplot, Ordinate Dicke der Intimahyperplasie auf der Patchseite in mm (Balken symbolisiert Mittelwert u. Standardabweichung); Abszisse Prothesentypen. 46

53 Sowohl die Kontrollgruppe (Kollagen), als auch die Pax-Gruppe hatten eine signifikant verminderte Ausbildung der IH gegenüber SRL, PVA und SRL+PVA zu verzeichnen. Bei Pax fand sich kein signifikanter Unterschied, hingegen aber eine Tendenz zur geringeren Ausbildung der IH gegenüber Kollagen (s. Tab. 3.1). p-wert, p-wert p-wert p-wert Kolla- PVA SRL SRL PAX Kollagen Kollagen Kollagen Kollagen gen + vs. vs. vs. vs. PVA PVA SRL+ SRL Pax PVA Dicke der IH 0,783 1,308 1,564 1,567 0,421 0,005 <0,001 <0,001 0,051 auf Patchseite ± ± ± ± ± in mm 0,408 0,441 0,421 0,523 0,168 Inflammations- 0,687 1,555 2,529 2,437 1,666 0,098 0,001 0,002 0,234 Score ± ± ± ± ± 0,814 0,289 0,488 0,422 0,118 Tabelle 3.1: Übersicht Meßwerte Intimadicke und Inflammationsscore, Signifikanzen. Die Werte sind Mittelwert und ± Standardabweichung, ein p-wert< 0,05 zeigt einen signifikanten Unterschied (t-test) an Es fand sich ebenso eine unterschiedliche Ausprägung der Entzündungsreaktion in den einzelnen Gruppen (s. auch Tab. 3.1), wobei die Kollagengruppe im Mittel (0,687 ± 0,814) den niedrigsten Inflammations-Score und die mit Sirolimus + PVA beschichteten Prothesen (2,529 ± 0,488) den höchsten Wert aufwiesen. Kollagen zeigte dabei eine signifikant niedrigere Reaktion, als die mit Sirolimus beschichteten Prothesen. Die Mittelwerte und Varianzen der einzelnen Gruppen sind in Abb auf der nächsten Seite dargestellt. 47

54 Ausprägungsgrad der Entzündung 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 PVA PAX SRL SRL+PVA Kollagen Art des implantierten Materials Abbildung 3.14: Boxplot, Ordinate semiquantitativ bestimmter Ausprägungsgrad der Entzündungsreaktion Abszisse eingesetzte Prothesentypen.Balken symbolisiert Mittelwert und Standardabweichung 4. Diskussion Wenn man den individuellen Gefäßstatus des Patienten außer Acht lässt, hängt der Erfolg einer Revaskularisierung neben den technischen Möglichkeiten und Fertigkeiten des Operateurs maßgeblich von den verwendeten Materialien ab. Primäre und sekundäre Offenheitsraten gefäßerhaltender Operationen werden in entscheidendem Maße dadurch bestimmt. In Ermangelung autologer Transplantate, die eindeutig die besten Ergebnisse liefern, ist die moderne Gefäßchirurgie auf Kunststoffe zum Ersatz von Blutleitern angewiesen, die sich im Wesentlichen seit Jahrzehnten nicht veränderten. Die bisher verfügbaren alloplastischen Ersatzmaterialien weisen in einem oder mehreren Problemfeldern trotz umfangreicher Forschung und Entwicklung immer neuer Beschichtungen immer noch teils gravierende Schwächen auf, die jedoch mangels Alternativen toleriert werden 48