Molekulare Biophysik. NMR-Spektroskopie (Teil 1)

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1 Molekulare Biophysik NMR-Spektroskopie (Teil 1)

2 Das Vorlesungs-Programm 2/94 Vorlesung Molekulare Biophysik : NMR-Spektroskopie Tag 1 Theoretische Grundlagen der NMR-Spektroskopie (1) Tag 2 Theoretische Grundlagen der NMR-Spektroskopie (2) Tag 3 Mehrdimensionale NMR- Spektroskopie Tag 4 NMR-Spektroskopie an Peptiden Tag 5 NMR-Spektroskopie an Proteinen (1) Tag 6 NMR-Spektroskopie an Proteinen (2) Scripte:

3 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie

4 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 4/94 Nuclear Magnetic Resonance NMR-Spektroskopie beobachtet die Resonanz von Atomkernspins mit elektromagnetischer Strahlung. Der Effekt ist nur in einem starken Magnetfeld beobachtbar. Jeder Atomkern wird getrennt beobachtet und eine Wechselwirkung zwischen Atomkernen kann detektiert werden. NMR entspricht daher sehr gut der Sicht eines Chemikers, der Moleküle als Atome und Bindungen betrachtet.

5 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 5/94 NMR ist extrem wichtig bei der Synthese-Analytik ppm

6 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 6/94 Strukturbestimmung von Naturstoffen NMR ist sehr hilfreich bei der Bestimmung der Konstitution von Naturstoffen.

7 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 7/94 Bestimmung der 3D Struktur von Proteinen Mit NMR kann die Raumstruktur von Proteinen bestimmt werden, in Lösung und im Festkörper.

8 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 8/94 Detektion von Molekül-Molekül-Wechselwirkungen NMR kann für die Detektion von Protein-Ligand Wechselwirkungen genutzt werden.

9 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 9/94 Detektion von Dynamik in Biomolekülen Mit der NMR- Spektroskopie kann die interne Beweglichkeit von Proteinen bestimmt werden.

10 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 10/94 Detektion von Vorgängen in lebenden Zellen Mit der in-cell-nmr- Spektroskopie kann man Veränderungen von Proteinen in 15 1H N 15 N Ser Zellen beobachten. Serine 1H 15 N 15 N 1H phospho-serine pser 1H

11 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 11/94 Bücher James Keeler gibt es auf: z.b.

12 Grundlagen der NMR-Spektroskopie

13 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 13/94 Das Konzept des Spins wurde von Wissenschaftlern eingeführt um bestimmte experimentelle Beobachtungen zu erklären. Als quantenmechanisches Konzept ist es außer im Rahmen von mathematischen Gleichungen nicht vollständig zu verstehen. Man kann aber im Rahmen von physikalischen und geometrischen Modellen gut damit umgehen, solange man sich der Limitierungen dieser Modelle bewusst ist.

14 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 14/94 Grundlage für die NMR-Spektroskopie ist der Kernspin, den man sich als Mischung von Kreisel und Stabmagnet vorstellen kann. + =

15 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 15/94 Ein Kreisel hat ein Drehmoment dessen Achse im Raum stabil ist.

16 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 16/94 Ein Magnet richtet sich in einem statischen Magnetfeld aus, diese Ausrichtung wird durch die Kreiseleigenschaft verhindert, die Kerne beginnen mit einer Präzesionsbewegung.

17 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 17/94 Der Kernspin hat aber, als quantenmechanische Größe, einige Eigenschaften, die vom klassischen Bild abweichen. Er wird charakterisiert durch ein Kernspindrehmoment I, dessen Betrag I = (ћ 2 [I(I+1)]) ist, wobei I die Kernspinquantenzahl ist.

18 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 18/94 Es kann nur der Betrag I und die z-komponente I z des Kernspins gleichzeitig angegeben werden. Die z-komponente ist parallel zum äußeren Magnetfeld B 0 und gegeben durch I z = ћ m wobei m die magnetische Quantenzahl ist m = (-I, -I+1,...,I-1, I)

19 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 19/94 Für die hochauflösende NMR sind fast ausschließlich Kerne mit einem Kernspin von I = 1/2 interessant. I = 3 ћ/2 I z = ћ/2

20 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 20/94 Der Zustand mit m = +1/2 wird als -Zustand, der Zustand mit m = -1/2 als den -Zustand bezeichnet. Die Bilder oben sind graphische Repräsentationen, keine physikalischen Darstellungen.

21 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 21/94 Verbunden mit dem Kernspindrehmoment ist ein magnetisches Moment, das sich aus dem Drehmoment über das gyromagnetische Verhältnis ergibt: = I z = I z = ћ m Je größer das gyromagnetische Verhältnis, desto größer das magnetische Moment.

22 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 22/94 In einem externen Magnetfeld ergibt sich die Energie der Spinzustände als das Skalarprodukt von magnetischem Moment und externem Magnetfeld B. E = - B E m =- z B 0 = - I z B 0 = - ћ mb 0

23 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 23/94 Es ergeben sich 2I+1 (2 für I = 1/2) unterschiedliche Energieniveaus, die hier geltende Auswahlregel ist: m = 1 E 1/2 =- z B 0 = - I z B 0 = - ћ 1/2B 0 } E -1/2 =- z B 0 = - I z B 0 = ћ 1/2B 0 E = ћ B 0

24 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 24/94 Der Energieunterschied entspricht einer Frequenz elektromagnetischer Strahlung. B = 0 B = B 0 E = ћ B 0 E = h 0 = B 0 /2 0 = 2 0 = B 0

25 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 25/94 Das ist auch genau die Rotationsfrequenz der Spins. Sie ist somit dem äußeren Magnetfeld direkt proportional. B 0 [Tesla] 0 [MHz]

26 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 26/94 Eigenschaften der wichtigsten NMR-Kerne Kern I natürliche Häufigkeit gyromagnetisches Verhältnis 1 H 1/ % C % 0 13 C 1/ % N % N 1/ % F 1/2 100 % P 1/2 100 % Cd 1/ % -5.96

27 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 27/94 Wir kennen jetzt die Eigenschaften einzelner Kerne, messen werden wir aber immer Proben mit sehr vielen Kernen. Was im Magneten passiert wollen wir uns jetzt bis hin zur Aufnahme eines 1D- Spektrums anschauen.

28 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 28/94 Ohne externes Magnetfeld sind die Spins in alle Raumrichtungen gleichmäßig verteilt.

29 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 29/94 Wenn ein Magnetfeld eingeschaltet wird, ändert sich das nicht sofort, aber die thermische Bewegung erzeugt eine Orientierung mit Vorzugsrichtung.

30 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 30/94 Es baut sich eine Magnetisierung...

31 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 31/94 entlang des Magnetfeldes auf, man erhält eine Bolzmannverteilung. In x,y-richtung ist dagegen alles gleich verteilt und kein magnetisches Moment vorhanden.

32 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 32/94 Aus dem Energieunterschied ergibt sich auch die Differenz in der Besetzung der Energieniveaus, es liegt eine Boltzmannverteilung vor, die man mit einem Energieniveauschema darstellen kann.

33 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 33/94 N /N = exp(- E/kT) = exp(- h B 0 / 2 kt) Bei 600 MHz Messfrequenz ergibt sich N /N = Dieser kleine Unterschied ist der Grund für die Unempfindlichkeit der NMR-Spektroskopie.

34 CW vs. FT

35 CW vs. FT 35/94 Nun haben wir die Probe im Magneten und wollen die Messung durchführen. Dazu gibt es zwei grundsätzliche Methoden, die Messung durchzuführen: CW-Technik (continous wave) FT-Technik (fourier transform)

36 CW vs. FT 36/94 Die CW-Technik ist die Methode, die man von anderen Spektroskopie-Arten kennt (z.b. UV), sie wird aber heute kaum mehr verwendet, da das Signal-zu-Rausch-Verhältnis ein Problem ist.

37 CW vs. FT 37/94 Moderne NMR-Experimente verwenden alle die FT- NMR-Technik, die auch als gepulste NMR bezeichnet wird und bei der sich das Signal-zu-Rausch-Verhältnis leichter verbessern lässt... FT

38 CW vs. FT 38/94... durch Wiederholung der Messung und Addition der aufgenommenen Signale.

39 CW vs. FT 39/94 Wir führen also in Wirklichkeit unsere Messung mehrmals durch, man spricht von dabei immer noch von eine Anzahl von scans.

40 Das rotierende Koordinatensystem ( Wie funktioniert ein Puls? )

41 Das rotierende Koordinatensystem 41/94 NMR-Experimente werden heute fast ausschließlich mit der FT-Methode durchgeführt. Während des NMR-Experiments werden für kurze Zeit Radiowellen (RF) für kurze Zeit (man spricht deshalb von einem Puls ) auf die Probe eingestrahlt. z y B x

42 Das rotierende Koordinatensystem 42/94 z y B x Das Magnetfeld des Pulses ist aber verglichen mit dem Hauptmagnetfeld (z.b. 14 T bei 600 MHz) recht schwach, es liegt bei einem typischen Puls bei ca. 500 T.

43 Das rotierende Koordinatensystem 43/94 Der Puls kann aber nur eine Anregung bewirken wenn er das Hauptmagnetfeld übertreffen kann. Das gelingt, weil die Radiowellen genau die richtige Frequenz haben, es kommt dann zur Resonanz mit den Spins. Um dieses Resonanzphänomen gut verstehen zu können, bedient man sich des rotierenden Koordinatensystems.

44 Das rotierende Koordinatensystem 44/94 Ausgangspunkt ist unsere Bolzmannverteilung von Spins im Magnetfeld.

45 Das rotierende Koordinatensystem 45/94 Alle Kerne vollführen immer noch ihre Rotationsbewegung, Wir wechseln jetzt in ein rotierendes Koordinatensystem.

46 Das rotierende Koordinatensystem 46/94 Die Idee des rotierenden Koordinatensystems ist einleuchtend, bedenkt man dass wir uns auf der Erde auch auf einem rotierenden Objekt Befinden. Der Beobachter rotiert mit einer Frequenz, der Spin mit einer Frequenz 0.

47 Das rotierende Koordinatensystem 47/94 Die Bewegung des Spins wird durch das Magnetfeld Hervorgerufen: 0 =2 0 = B 0 Ist die Bewegung langsamer, erscheint dem Beobachter das Magnetfeld schwächer: 0 - = = (B 0 - / )

48 Das rotierende Koordinatensystem 48/94 Innerhalb dieses Bildes sind dann auch negative Frequenzen möglich, d.h. Rotationen in die entgegengesetzte Richtung. Keine Bewegung bedeutet kein Magnetfeld!!

49 Das rotierende Koordinatensystem 49/94 p normale Darstellung Das Einstrahlen funktioniert über die Messspule, die Radiofrequenz wird (in der modernen Form der NMR- Spektroskopie) in Form eines kurzen Pulses in der x,y-ebene ins System eingebracht.

50 Das rotierende Koordinatensystem 50/94 Die linear polarisierte Oszillation wird als eine Überlagerung von zwei in umgekehrter Richtung wandernde Komponenten betrachtet. Eine Komponente ist sehr schnell und kann ignoriert werden...

51 Das rotierende Koordinatensystem 51/94...während die andere im rotierenden Koordinatensystem fast statisch erscheint, sie ist on resonance oder zumindest nahe an der Resonanzfrequenz, man spricht vom B 1 -Feld.

52 Das rotierende Koordinatensystem 52/94 Im rotierenden Koordinatensystem sind somit das Hauptfeld θ und das RF-Feld von ähnlicher Größe, es resultiert ein effektives Feld, B eff.

53 Das rotierende Koordinatensystem 53/94 θ B eff = (B 1 ) 2 + (B 0 / ) 2 B eff ( B ) ( B0 / ) B eff = ( B 1 ) B1 tan tan = (B 0 / ) = ( B / ) B1 B 1 0 B eff B 1 B eff B 1

54 Das rotierende Koordinatensystem 54/94 Die Präzession der Magnetisierung erfolgt nun natürlich um das neue effektive Feld, B eff.

55 Das rotierende Koordinatensystem 55/94 Ist der RF-Puls on resonance verschwindet das Hauptfeld und die Magnetisierung beginnt eine Präzession um das B 1 -Feld. Der Winkel wird von der Länge und Stärke des Pulses bestimmt

56 Pulse und Vektor-Model

57 Pulse und Vektormodel 57/94 Die Pulse werden durch ein starkes B1-Feld erzeugt und decken so eine große Frequenzregion ab Frequenz 600 MHz 90 Puls = 10 sec B 1 = 25 khz (586 T) θ 3000 Hz 10 ppm 0 Hz 5 ppm Hz 0 ppm = 3000 tan =0.12 = 6.8 on-resonance = 0 tan =0 = 0 = tan =-0.12 = -6.8

58 Pulse und Vektormodel 58/94 Jeder einzelne Spin wird um den gleichen Winkel gedreht und somit auch das in der Summe resultierende magnetische Moment

59 Pulse und Vektormodel 59/94 Nach einem 90 -Puls resultiert ein magnetisches Moment in der x,y-ebene, es liegt keine Z-Magnetisierung mehr vor.

60 Pulse und Vektormodel 60/94 Strahlt man die Radiowellen noch länger ein, dann kommt man über den 90 Winkel hinaus und erreicht irgendwann die 180

61 Pulse und Vektormodel 61/94 Diese beiden Winkel sind von besonderer Bedeutung: der 90 Puls und der 180 Puls. Weil die Länge so wichtig ist, gibt man Pulswinkel in sec an 90 Puls ( /2) aus x: Der Vektor dreht sich um die x-achse nach (-y) Ein typischer Wert für einen 90 Puls sind 10 sec 180 Puls ( ) aus x: Der Vektor dreht sich um die x-achse nach (-z) Der Wert für den 180 Puls ist dann 20 sec

62 Pulse und Vektormodel 62/94 Die Richtung des B1-Feldes (die Phase des Pulses) kann im Experiment festgelegt werden und verändert dann die Wirkung des Pulses auf die Magnetisierung. z y B 1 aus x z y x x B 1 aus y y B 1 aus x y B 1 aus x x Kommen Puls und Magnetisierung aus der x gleichen Richtung passiert nichts!!

63 Pulse und Vektormodel 63/94 Diese klassische Betrachtung eines magnetischen Moments unter dem Einfluss von Magnetfeldern (Hauptfeld oder Pulse) wird als Vektormodel bezeichnet, es wird mathematisch durch die Bloch-Gleichungen beschrieben.

64 Detektion des Signals

65 Detektion des Signals 65/94 Das FT Experiment besteht also zunächst aus einem Radiofrequenzpuls, der die Magnetisierung dreht.

66 Detektion des Signals 66/94 Die Drehung führt die Magnetisierung von der z- Richtung in die x,y Richtung.

67 Detektion des Signals 67/94 Wird der Puls nach 90 abgeschaltet, ist wieder das statische Magnetfeld das entscheidende, die Spins führen wieder ein Präzession um dieses Feld durch, aber mit ihrer neuen Orientierung.

68 Detektion des Signals 68/94 Die Präzession induziert einen Strom in der Detektionsspule, das resultierende Signal wird aufgezeichnet.

69 Detektion des Signals 69/94 Entlang der x und y Achse ergeben sich Sinus- und Cosinus-Funktionen. cos t t y sin t x M x t M x = cos t exp (-t/t 2 ) M y t M y = sin t exp (-t/t 2 )

70 Detektion des Signals 70/94 Zusätzlich kehrt das System wieder in den Ausgangszustand zurück, es relaxiert, was durch eine Exponentialfunktion beschrieben wird: M x,y ~ exp (-t/t 2 )

71 Detektion des Signals 71/94 Beide Signale werden aufgezeichnet, es ergibt sich ein komplexes Signal: M = M x + i M y M = exp (i t) exp (-t/t 2 ) Dabei werden die berühmten Euler-Gleichungen verwendet: exp(i ) = cos + i sin exp(-i ) = cos -i sin

72 Detektion des Signals 72/94 M x Berechnung von Pulssequenzen t M y t M x = cos 0 t exp (-t/t 2 ) M y = sin 0 t exp (-t/t 2 ) M = M x + i M y = [cos 0 t + i sin 0 t ] exp (-t/t 2 ) M = exp (i 0 t) exp (-t/t 2 )

73 Detektion des Signals 73/94 Die Aufnahme beider Signale nennt man Quadraturdetektion, man erhält einen komplexen Datenpunkt und kann in der Mitte des Spektrums sitzen

74 Detektion des Signals 74/94 Zur Verarbeitung des Signals muss es in eine computergerechte Form gebracht werden, dazu wird ein Analog-Digital-Konverter (ADC) verwendet.

75 Detektion des Signals 75/94 Das hat aber Konsequenzen: die Punkte müssen equidistant sein (wegen der DFT) und man braucht drei Punkte pro Periode 2 t

76 Detektion des Signals 76/94 Also gibt es Grenzen bei den Frequenzen die digitalisiert werden können. Es gilt das die Nyquist-Frequenz f n = 1/(2 t) die größte Frequenz ist, die bei einem Abstand t der Datenpunkten noch erfasst werden kann. Da wir in der Mitte sitzen und +/- f n detektieren können gilt für die spektrale Breite ( spectral width ) SW = 2 * f n = 1/ t

77 Detektion des Signals 77/94 Das schauen wir uns noch näher an z y x 90 -x z y x 2000 Hz -500 Hz Hz y Das Spektrum nehmen wir mit SW = 6000 Hz auf (+/- 3000), also einem t = 166 sec t = 0 sec x

78 Detektion des Signals 78/94 y y 500 Hz * 166 sec = Umdrehungen = 30 y y x x x x t = 0 sec t = 166 sec t = 332 sec t = 498 sec 1 Iy t [msec] 1 Ix Man erkennt das die Ränder (+/ Hz) in 166 usec 180 laufen würden!

79 Detektion des Signals 79/94 1 Iy t [msec] 1 Ix FT [Hz] [ppm]

80 Die Fourier-Transformation

81 Fourier-Transformation 81/94 Die FT ermittelt aus dem Signal von überlagerten Schwingungen welche Frequenzen enthalten sind. FT Wie funktioniert das?

82 Fourier-Transformation 82/94 Von der folgenden Schwingung soll die Frequenz ermittelt werden.

83 Fourier-Transformation 83/94 Dazu raten wir eine Frequenz und erzeugen das dazugehörige Zeitsignal.

84 Fourier-Transformation 84/94 Dann werden die beiden miteinander multipliziert.

85 Fourier-Transformation 85/94 Schließlich wird über alle Zeitpunkte aufsummiert. Hier passt die Frequenz nicht, es gibt ähnlich viele positive wie negative Punkte, das Resultat ist nahe 0!

86 Fourier-Transformation 86/94 Hier passt die Frequenz sehr gut, fast alle Punkte sind größer als null, das Resultat der Summe ist daher auch sehr groß.

87 Fourier-Transformation 87/94 Das machen wir nun ganz systematisch für alle möglichen Frequenzen und erhalten eine Kurve aufgetragen gegen die Frequenz, ein Spektrum.

88 Fourier-Transformation 88/94 Die Fouriertransformation ist in Gleichungen am einfachsten mit einem komplexen Signal zu erläutern Ein komplexes NMR-Signal hat - wie gesehen - die Form s(t) = exp (i 0 t) exp (-t/t 2 ) Signaloszillation (die Frequenz) Signalabfall (Relaxation)

89 Fourier-Transformation 89/94 Wir führen eine Fouriertransformation durch, die Summation ist eine Integration. S( ) = S( ) = s(t) exp (-i t) dt 0 S( ) = exp (i 0 t) exp (-t/t 2 ) exp (-i t) dt 0 1 Lorentzlinie (1/T 2 ) + i( 0 ) Eine komplexe Funktion besteht aus Realteil und Imaginärteil: S ( ) = R( ) + i I( )

90 Fourier-Transformation 90/94 Im einfachsten (besten) Fall ist der Realteil absorbtiv und der Imaginärteil dispersiv : S ( ) = A( ) + i D( ) A( ) = (1/T 2 ) (1/T 2 ) 2 + ( 0 ) 2 D( ) = -( 0 ) (1/T 2 ) 2 + ( 0 ) 2

91 Fourier-Transformation 91/94 s(t) = exp (i 0 t) exp (-t/t 2 ) Signaloszillation (die Frequenz) Signalabfall (Relaxation)

92 Fourier-Transformation 92/94 FT FT Die Einhüllende ergibt die Linienform, die Oszillation die Position im Spektrum.

93 Fourier-Transformation 93/94 Was ist mit konstanten Faktoren? s(t) = A exp (i 0 t) exp (-t/t 2 ) S( ) = s(t) exp (-i t) dt 0 S( ) = A exp (i 0 t) exp (-t/t 2 ) exp (-i t) dt 0 A S( ) = (1/T 2 ) + i( 0 ) Die Fouriertransformation ist eine lineare Operation, deshalb kann man Spektren integrieren.

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