Experimentelle Untersuchung molekularer Signalkaskaden in der zellulären Mechanosensorik

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1 Experimentelle Untersuchung molekularer Signalkaskaden in der zellulären Mechanosensorik Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn vorgelegt von Verena Niediek aus Marburg Bonn, September 2012

2 Anfertigung mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn 1. Gutachter: Prof. Dr. Rudolf Merkel 2. Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Kubitschek Tag der Promotion: Erscheinungsjahr: 2013

3 Zusammenfassung Physikalische Signale stellen für Zellen wichtige Informationen dar, die über eine Reihe von Signalkaskaden auf verschiedenste Zellfunktionen wie Zellzyklus, Differenzierung oder Migrationsverhalten wirken. Die von Zellen wahrgenommenen mechanischen Signale können dabei u.a. Topographie, Elastizität oder Dehnung des Substrates umfassen. Zur Erkennung solcher Signale sind Strukturen notwendig, die solche äußeren Signale ins Zellinnere übertragen. Insbesondere die Fokaladhäsionen, die die Verbindung zwischen der Extrazellulären Matrix und dem Zytoskelett der Zelle aufbauen, scheinen eine wichtige Rolle zu übernehmen. Der Aufbau von Fokaladhäsionen ist hoch komplex. Mehr als 150 bisher bekannte Proteine sind zumindest peripher daran beteiligt. Diese setzen sich in erster Linie aus Struktur-, Adapter- und Signalproteinen zusammen. Ein Großteil der an der Fokaladhäsion beteiligten Proteine wird in Bezug auf Struktur und Funktion reguliert, wobei die Regulation dabei weitgehend über Phosphorylierung erfolgt. Tyrosinkinasen wie FAK und die Tyrosinkinasen der Src-Familie nehmen in den Fokaladhäsionen eine zentrale Rolle ein. Setzt man Zellen dem physikalischen Signal der uniaxialen, zyklischen Dehnung aus, reagieren diese, indem sie ihre Orientierung ändern. Dabei richten Zellen als erstes ihr Zytoskeletts und nachfolgend ihre ganze Zellform senkrecht zur Zugrichtung aus. Die an diesem Prozess beteiligten Signalwege sind noch immer zu großen Teilen unverstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss der Kinasen der Src-Familie auf die Reorientierung bei uniaxialer, zyklischer Dehnung untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Zellen, denen alle drei ubiquitär exprimierten Kinasen der Src-Familie (Src, Yes und Fyn) fehlen, eine im Vergleich zum Wildtypen deutlich verminderte Reorientierung senkrecht zur Zugrichtung aufwiesen. Daraus folgt, dass die Zellantwort auf zyklische Dehnung zumindest teilweise auf der Funktion der Kinasen beruht. Zellen, denen Yes und Fyn fehlen, während Src unverändert exprimiert wird, zeigten einen intermediären Effekt. Das deutet darauf hin, dass die Kinasen einander in diesem Signalweg nur teilweise komplementieren können. Ein Fokaladhäsionsprotein mit möglicher mechanosensitiver Funktion stellt p130cas dar. Für dieses Protein konnte in vitro gezeigt werden, dass es bei mechanischer Dehnung wie eine Feder auseinander gezogen und nachfolgend von den Kinasen der Src-Familie

4 II phosphoryliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle dieses Proteins in vivo bei zyklischer Dehnung untersucht. Die Versuche zeigten, dass Zellen, die nicht mehr über p130cas verfügen, sich nur unvollständig reorientieren können. In Versuchen mit einer p130cas Mutante, in der die Tyrosine der streckbaren Substratdomäne durch Punktmutationen konstitutiv inaktiviert wurden, zeigte sich die gleiche verminderte Fähigkeit zur Reorientierung wie bei p130cas-knockout-mutanten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Dehnung von p130cas sowie die nachfolgende Phosphorylierung einen wichtigen Einfluss auf die Reorientierung von Zellen als Reaktion auf zyklische Dehnung haben. Auf dieser Basis wurden weitere Versuche mit Crk, einem Adapterprotein von p130cas, sowie einer Reihe weiterer Signalproteine wie C3G oder Dock1 durchgeführt. Knockdownoder Knockout-Experimente mit diesen Proteinen stellen eine gute Grundlage für die Untersuchung des weiteren Signalweges dar.

5 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung I 1 Einleitung Mechanosensorik und mögliche Signalwege Fokaladhäsionen als Verbindung zwischen Zytoskelett und der Extrazellulären Matrix Die Extrazelluläre Matrix Integrine Fokaladhäsionen Stressfasern Regulierung und Signalwege der Fokaladhäsion Bildung und Reifung Die Rolle der Phosphorylierung Regulation der Phosphorylierung durch Kinasen Vinculin in der Fokaladhäsion p130cas als möglicher Mechanosensor Das Adapterprotein Crk Bindungspartner von Crk Der ERK1/2 Signalweg Eigene Vorversuche zu MEF-WT, -SYF und -Src Ziele der Arbeit Material und Methoden Zellkultur Zelllinien Kulturbedingungen Transfektion Inhibitor-Experimente Immunocytochemie

6 IV Inhaltsverzeichnis 2.3 Proteinanalyse Proteinisolation SDS-Gelelektrophorese Western Transfer und Antikörperfärbung Quantifizierung von Western Blots RNA-Analyse RNA Isolation und Reverse Transkriptase PCR qrt-pcr Auswertung Zugexperimente Herstellung der Zugkammern Aufbau der Zugapparatur und Durchführung der Experimente Digitale Bildverarbeitung und Auswertung Mikroskopie Statistische Datenverarbeitung Ergebnisse Validierung der Methoden zur Bestimmung der Zellorientierung Die Rolle der Kinasen der Src-Familie bei zyklischer Dehnung Dehnungsexperimente an MEF-WT, -SYF und -Src Kontrolle der Versuche durch SFK-Inhibitoren Die Rolle von p130cas bei zyklischer Dehnung Knockdown von p130cas mittels sirna Charakterisierung der MEF-Cas -/-, -Cas-15F- und -Cas-WT- Zelllinien Dehnungsexperimente mit MEF-Cas-WT, -Cas-15F und -Cas -/ Untersuchung der Rolle direkter und indirekter Bindungspartner von p130cas in der Reorientierung Crk Dock C3G Abl Die Rolle von Vinculin bei zyklischer Dehnung Phosphorylierungsmuster einzelner Proteine bei zyklischer Dehnung Phosphorylierung von Erk1/2 in Podozyten nach zyklischer Dehnung Phosphorylierung von Crk und p130cas in MEF-WT nach zyklischer Dehnung

7 Inhaltsverzeichnis V 4 Diskussion Orientierungsbestimmung von MEF-Zellen Orientierung der Zellform Das Aktinzytoskelett Auswertung der Aktinorientierung Ordnungsparameter Einfluss der SFK auf die Reorientierung p130cas bei zyklischer Dehnung Das Adapterprotein Crk Bindungspartner von Crk Alternative Signalwege zu p130cas Die Signalkaskade bei zyklischer Dehnung Anhang Abkürzungsverzeichnis Materialien Chemikalien Verwendete Antikörper sirnas und TaqMan Sonden Puffer, Medien und Lösungen Verbrauchsmaterial Geräte Literaturverzeichnis VII

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9 1 Einleitung Zellen stehen mit ihrer Umwelt in stetigem Kontakt. Neben zahlreichen chemischen Botenund Signalstoffen werden auch mechanische Signale von der Zelle wahrgenommen. Steifigkeit, Deformation oder Topografie stellen Signale dar, die die Zellen in Differenzierung, Wachstum und Motilität beeinflussen können. Die Mechanosensoren, über die die Zellen mechanische Eigenschaften wahrnehmen können, sind dabei noch nicht vollständig verstanden. Die Ergebnisse aktueller Forschungsarbeiten zur zellulären Mechanosensorik werden im Folgenden vorgestellt und erläutert. 1.1 Mechanosensorik und mögliche Signalwege Die Mechanosensorik ist in erster Linie in der Sinnesphysiologie bekannt: Im Innenohr werden durch mechanische Wellenbewegungen der Basilarmembran Haarzellen ausgelenkt. Dadurch werden mechanosensitive Ionenkanäle geöffnet, wodurch der Einstrom von Ionen ein Aktionspotential auslöst. Damit wird ein mechanisches Signal in ein neuronales umgewandelt [3]. Doch auch auf zellulärer Ebene spielt die Mechanosensorik eine Rolle in verschiedenen Prozessen. Die mechanischen Reize können dabei Härte, Topographie oder Bewegung eines Substrates umfassen, welche z.b. Differenzierung oder Motilität von Zellen beeinflussen können [26, 31]. In Abb. 1.1 sind Stammzellen auf Substraten unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert. Die Steifigkeiten wurden dabei so eingestellt, dass sie verschiedenen Gewebetypen wie Gehirn, Muskel oder Knochen gleichen. Nachdem die Zellen für 96 h auf diesen Substraten kultiviert wurden, zeigten sie eine Morphologie, die den jeweiligen Gewebetypen entspricht. Zellen zeigten auf sehr weichem Substrat viele dünne Ausläufer, was für Neuronen typisch ist, während Zellen auf besonders harten Substraten die Morphologie von Knochenzellen aufweisen [34]. Nicht nur Differenzierung, auch Ausrichtung oder Orientierung von Zellen kann durch mechanische Signale beeinflusst werden. In Abb. 1.2 sind die Endothelzellen einer Arterienwand abgebildet. Alle Zellen liegen mit einer Ausrichtung parallel zum Blutfluss bzw. senkrecht zum Pulsdruck. In vitro lässt sich die Ausrichtung senkrecht zur Zugrichtung reproduzieren, indem Zellen auf einem elastischen Substrat kultiviert und für eine bestimmte Zeit zyklisch gezogen werden [17].

10 2 Einleitung Abbildung 1.1: Mesenchymale Stammzellen wurden auf Substraten unterschiedlicher Steifigkeiten kultiviert. Die Steifigkeiten entsprechen verschiedenen Gewebetypen (0,1-1 kpa entspricht der Hirnsubstanz, 8-17 kpa den Muskeln und kpa dem Knochengewebe). Die Zellen zeigen nach 96 h eine Morphologie, die den Zelltypen der jeweiligen Gewebetypen entspricht. Verändert nach [34]. Die Wahrnehmung und Verarbeitung mechanischer Reize ist für Zellen essentiell. Über welchen Mechanismus sie in der Lage sind, Dehnung oder Bewegung im Substrat zu erfassen ist noch nicht geklärt. Es existieren einige Hypothesen, welche im Folgenden vorgestellt werden. Ein Mechanismus der Wahrnehmung von Substratdehnung funktioniert über Ionenkanäle, ähnlich zur Mechanosensorik des Innenohres. Die Kanäle sind in der Plasmamembran lokalisiert und werden über die Dehnung der Membran geöffnet, so dass Ionen einströmen. Naruse et al. konnten 1997 zeigen, dass die intrazelluläre Calzium (Ca 2+ ) Konzentration bei zyklischer Dehnung ansteigt [83]. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass sich uniaxial zyklisch gedehnte Zellen in Ca 2+ -freiem Medium nicht senkrecht zur Zugrichtung ausrichten. Ein Inhibitor gegen Ca 2+ -Ionenkanäle verhindert ebenfalls eine zelluläre Reorientierung [81].

11 1.1 Mechanosensorik und mögliche Signalwege 3 Abbildung 1.2: Ausrichtung von arteriellen Endothelzellen. Die inneren Zellen der Arterienwand liegen alle parallel zur Richtung des Blutflusses. Aus Langille & Adamson, 1981 [71]. Allerdings konnte von Hayakawa et al gezeigt werden, dass die Umorientierung der Stressfasern im Gegensatz zur Zellform nicht Ca 2+ abhängig ist. Hierfür wurden Zellen in einem Medium, das mit einem Ca 2+ -Chelat versetzt war, zyklisch gezogen. Sie passten ihre Zellform der Dehnung nicht an während die Stressfasern weiterhin ausgerichtet wurden [49]. Das Aktinzytoskelett ist ebenfalls an der Mechanosensorik beteiligt. Zum einen wird durch das Aktin-Myosin-System die Kraft der Zelle generiert und eine charakteristische Zellspannung aufgebaut, die ein Equilibrium zur Spannung der EZM darstellt [58, 113]. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass bei Dehnung im Zytoskelett Risse entstehen, in die verstärkt Zyxin zusammen mit a-actinin und VASP eingelagert wird [120]. Ein weiterer vorgeschlagener Weg der Mechanosensorik läuft über Filamin A, einem Protein welches mit dem Aktinzytoskelett als Kreuzvernetzer interagiert [33]. Im Bereich der Extrazellulären Matrix (EZM) findet eine Mechanosensorik durch die Entfaltung von Fibronektin oder anderen EZM Proteinen statt [35]. Die Mehrzahl an Untersuchungen deutet jedoch darauf hin, dass die zelluläre Mechanosensorik über integrinvermittelte Adhäsionen, den Fokaladhäsionen (FA) läuft, die die EZM mit dem Zytoskelett verbinden [11, 43, 115]. An Nadelverzugsexperimenten konnte gezeigt werden, dass bei Substratdehnung das Zytoskelett stabil bleibt, während in der Fokaladhäsion eine Dehnung erfolgt [63]. Zudem werden FA von der Zelle verstärkt, wenn Dehnungskraft auf sie wirkt [94]. In den letzten Jahren sind viele Experimente zu mechanosensorischen Mechanismen unter Beteiligung der FA vorgestellt worden. Aufbau, Reifung und wichtige beteiligte Proteine sind schematisch in Abb. 1.3 abgebildet und werden im folgenden Abschnitt vorgestellt.

12 4 Einleitung 1.2 Fokaladhäsionen als Verbindung zwischen Zytoskelett und der Extrazellulären Matrix Die Extrazelluläre Matrix Die Extrazelluläre Matrix (EZM) befindet sich im Extrazellularraum zwischen tierischen Zellen. Dort übt sie unterschiedliche Funktionen aus, beispielsweise als Bindegewebe, Basalmembran oder auch Knorpelgewebe. Die EZM besteht aus Faserproteinen wie Kollagen oder Fibronektin, die der EZM ihre Stabilität verleihen sowie aus Glycosaminoglykanen und Proteoglykanen. Diese bilden eine wasserhaltige, gelartige Substanz. Die genaue Zusammensetzung und die sich daraus ergebenen Eigenschaften der EZM variieren mit den ausgeführten Aufgaben. Der Einfluss von EZM und Zellen ist wechselseitig. Die Zelle sekretiert die Bestandteile der EZM und verändert diese konstant während die EZM ihrerseits die Zelle in Adhäsion, Migration und Proliferation beeinflusst [3] Integrine Integrine vermitteln die Bindung von Zellen an die EZM. Sie stellen eine homologe Familie von Transmembranproteinen dar, die sich in zwei Klassen (a und b) unterteilen lassen. Jeweils ein a- und ein b-integrin bilden einen Heterodimer, wobei bisher 18 a- und 8 b- Integrine in 24 bisher möglichen Kombinationen bekannt sind wodurch die Spezifität der Integrine erhöht ist. Fibronektin wird beispielsweise von a 5 b 1 an einer speziellen Arg-Gly- Asp (RGD) Sequenz gebunden, während a V b 3 an die gleiche Sequenz in Vitronektin bindet [53]. Integrine bestehen aus einer langen N-terminalen extrazellulären Domäne, einer helikalen Transmembrandomäne und einer kurzen intrazellulären Domäne am C-Terminus. In der inaktiven Form sind die extrazellulären Domänen angewinkelt und die Bindestellen zu EZM Proteinen verdeckt. Die intrazellulären Domänen sind dann in engem Kontakt zueinander und ebenfalls nicht für Bindungspartner zugänglich [9]. Die Aktivierung von Integrinen kann bidirektional erfolgen. Zum einen kann durch die Bindung von Integrinen an EZM Proteine die intrazelluläre Domäne Bindestellen für Talin und Vinculin frei geben. Zum anderen können intrazelluläre Bindungen von Adapterproteinen wie Talin Integrine aktivieren [20] Fokaladhäsionen Fokaladhäsionen sind Proteinkomplexe, die die EZM über Integrine mit dem Aktin- Zytoskelett verbinden. Diese Strukturen sind seit 1971 bekannt und immer noch Teil der aktuellen Forschung [1, 43]. Sie haben vielfache und wichtige Funktionen in Adhäsion

13 1.2 Fokaladhäsionen als Verbindung zwischen Zytoskelett und der Extrazellulären Matrix 5 Abbildung 1.3: Schematische Darstellung einer FA. Die Integrine stellen den transmembranen Bestandteil an den Adhäsionsproteine wie Talin oder Vinculin binden und die Verbindung zum Aktinzytoskelett herstellen. Verändert nach [78]. und Migration. Des weiteren sind sie an der beidseitigen Signal- und Kraftübertragung zwischen extra- und intrazellulären Strukturen beteiligt [125]. An der FA sind 91 bisher bekannte Proteine beteiligt und wenigstens 65 interagieren mit diesem Proteinkomplex, wobei sich die Zusammensetzung der FA im Zuge der Entstehung, Reifung bis zum Abbau verändert [123]. Einen wichtigen Anteil der Proteine der FA machen Adapter- und Strukturproteine aus, die zwei andere Proteine zur Interaktion zusammenbringen [43]. Zu diesen Gruppen gehören beispielsweise Vinculin und Crk. FA sind stark reguliert, wobei die wichtigste Regulation über Phosphorylierungen vermittelt sind. Die wichtigsten Kinasen sind hier FAK (Fokale Adhäsions Kinase) und Src. Bildung und Reifung von FA sind in Abschnitt ausführlich beschrieben.

14 6 Einleitung Stressfasern Stressfasern sind Bündel aus 10 bis 15 Aktinfilamenten, die die ganze Zelle durchspannen. Die Filamente werden über Kreuzvernetzer wie a-actinin und Filamin gebündelt wobei in den Zwischenräumen Myosin Motorproteine eingelagert werden [89]. Über die Myosine wird eine ins Zellinnere gerichtete Spannung erzeugt, die von den Stressfasern auf die FA und darüber auf die EZM übertragen wird [8]. FA sind von einem sehr frühen Zeitpunkt ihrer Bildung mit dem Aktin Zytoskelett assoziiert und viele FA-Proteine haben Aktin- Bindestellen. Des weiteren spielt die Zellkraft eine wichtige Rolle für die Regulation von FA. Wird eine größere Kraft auf FA ausgeübt werden diese verstärkt, bei fehlendem Zug abgebaut [94]. 1.3 Regulierung und Signalwege der Fokaladhäsion Bildung und Reifung Die Bildung von integrinvermittelten Adhäsionen ist ein Prozess, der trotz intensiver Forschung noch nicht vollständig verstanden ist. Die erste Zelladhäsion wird vermutlich durch Hyaluronsäure, einem Bestandteil der EZM vermittelt [24], die auch später noch zur Stabilisierung von FA notwendig ist [112]. Dieser schwachen Adhäsion folgt die Aktivierung der Integrinrezeptoren durch Liganden der EZM oder intrazelluläre Proteine wie Talin. So konnten schwache, integrinabhängige slip-bonds, nachgewiesen werden, die durch Krafteinwirkung von 2 pn gebrochen werden können und für deren Funktion Talin nötig ist [61]. Fokalkomplexe (FX) sind die ersten Adhäsionen, die mit 100 nm Durchmesser im Mikroskop sichtbar sind. In migrierenden Zellen entstehen sie am vorderen Rand von Lamellipodien und enthalten neben Integrin bereits Talin und Paxillin. Im Zuge der Reifung werden später auch Vinculin und a-actinin sowie FAK und VASP in den FX nachweisbar [121]. Die Reifung von FX zu FA findet an der Grenze vom Lamellipodium zur Lamelle statt und ist durch ein Wachstum und eine damit einhergehende Stabilisierung der FA gekennzeichnet. Neben dem Einbau charakteristischer FA Proteine wie Zyxin und Tensin ist ein weiteres Merkmal von FA die stabile Verankerung von Stressfasern [122]. Über die Stressfasern wird ein Zug auf die FA ausgeübt, der für deren Bildung notwendig ist. Fehlt das Motorprotein Myosin IIA werden die FX wieder aufgelöst statt zu FA zu reifen [22]. Reguliert wird die Reifung der FA über Phosphorylierung. Insbesondere die Tyrosinphosphorylierung scheint einen Einfluss auf die Regulation von Adhäsionen zu haben. Junge FA zeigen einen hohen phospho-tyrosin (py) Gehalt und damit einhergehend eine hohe Dynamik. Reife und stabile FA sind wenig phosphoryliert während FA, die im Abbau begriffen sind, erneut eine starke Phosphorylierung zeigen [79].

15 1.3 Regulierung und Signalwege der Fokaladhäsion 7 Eine in der FA häufig auftretende Signalübertragung durch Proteininteraktion wird über strukturell konservierte Src-Homology-Domänen (SH Domänen) vermittelt. SH3 Domänen können an bestimmte prolinreiche Regionen binden. SH2 Domänen interagieren dagegen mit Sequenzen, die ein phosphoryliertes Tyrosin enthalten. Diese Domänen finden sich in vielen Proteinen und sind oft mit der Regulation des Zytoskeletts assoziiert [3]. Ein weiteres wiederkehrendes Motiv in der Regulation von FA ist die Interaktion zweier Proteine, die über ein Adapterprotein vermittelt wird [43] Die Rolle der Phosphorylierung Phosphorylierungen sind Bestandteile von vielen zellulären Signalwegen. Bei dieser posttranslationalen Modifikation werden Phosphatgruppen an die Seitenketten von Serin (Ser, S), Threonin (Thr, T) oder Tyrosin (Tyr, Y) angefügt. Die Übertragung des g-phosphats von ATP auf die Seitenketten der Aminosäuren wird über Proteinkinasen vermittelt und durch Phosphatasen wieder entfernt. Serin/Threonin-Kinasen wirken auf die beiden Aminosäuren, Tyrosinkinasen meist ausschließlich auf Tyrosine. Die Bindung der Phosphatgruppe kann eine intramolekulare Konformationsänderung bewirken, die zumeist durch die negative Ladung der Phosphatgruppe Wasserstoffbrückenbindungen im Molekül erzeugt oder verlagert. Der gleiche Mechanismus kann auch Interaktionen mit einem anderen Molekül ermöglichen. Die Phosphatgruppe kann die Bindestellen oder direkt das aktive Zentrum durch sterische Hinderung blockieren. [90] In FA reguliert die Phosphorylierung die Reifung der Strukturen. In migrierenden Zellen ist die Lebensdauer von FA besonders kurz. An der Zellfront werden FA aufgebaut und verbleiben dann ortsstabil relativ zum Substrat und werden wieder abgebaut, wenn die Zelle darüber hinweggewandert ist [79]. In Abb. 1.4 ist die Phosphorylierung in migrierenden Keratinozyten dargestellt. Zu sehen ist, dass in jungen FA ebenso wie in FA, die im Abbau begriffen sind, der Grad der Phosphorylierung erhöht ist. Im Gegensatz dazu sind stabile FA unter dem Zellkörper weniger phosphoryliert. Bei nicht motilen Zellen ist die Phosphorylierung ähnlich verteilt: Die FA an der Zellperiperie sind stärker phosphoryliert als die unter dem Zellkörper (siehe Abb. 1.5). Des weiteren spielt Phosphorylierung in der zellulären Mechanosensorik, insbesondere bei der Wahrnehmung von zyklischer Dehnung eine Rolle. Sie steigt wenige Minuten nach Beginn der Dehnung sehr deutlich an [36, 44]. Zellen ohne FAK oder der Src Kinase zeigen eine verminderte Fähigkeit zyklischer Dehnung auszuweichen [96, 82] und eine erhöhte Aktivität der FAK bei zyklischer Dehnung [116]. Diese Ergebnisse unterstreichen die Rolle der Kinasen und damit einhergehend der Phosphorylierung in der Wahrnehmung mechanischer Signale.

16 8 Einleitung Abbildung 1.4: Phosphorylierung von Vinculin in FA migrierender Keratinozyten. Links sind Immunfärbungen gegen Vinculin (Vin) und phosphoryliertem Vinculin (pvin) dargestellt. Rechts ist das Verhältnis phosphorylierten und unphosphorylierten Vinculins in Falschfarben dargestellt, wobei wärmere Farben eine stärkere Phosphorylierung darstellen. Verändert nach [79] Regulation der Phosphorylierung durch Kinasen In den FA sind eine Reihe von Kinasen vertreten. Die wichtigsten sind dabei die FAK und die Kinasen der Src-Familie (Src-family kinases, SFK). FAK FAK (Fokale Adhäsions Kinase, auch PTK2 genannt) ist eine ubiquitär exprimierte Tyrosin-Kinase und die erste Kinase die in entstehenden FA eingebaut wird, wo sie auch ihre wichtigsten Funktionen ausübt [103]. FAK -/- Zellen zeigen deutliche Defekte in Adhäsion und Migration [57]. Die FAK lokalisiert über eine C-terminale FAT (Focal Adhesion Targeting) Domäne in der FA und vermittelt die Interaktion mit Paxillin [2, 52]. N-terminal liegt eine FERM-Domäne, die im inaktiven Zustand der FAK mit der zentralen Kinasedomäne interagiert. Durch eine Bindung mit einem Liganden (z.b. b-integrin) wird die Autophosphorylierungsstelle Y397 frei und auch schnell phosphoryliert, wodurch die Kinase aktiv wird und Proteine mit einer SH2-Domäne binden können. Src verfügt über eine solche Domäne und wird durch FAK an Y527 phosphoryliert. Im Gegenzug phosphoryliert Src die FAK an Y576 und Y577, wodurch die Kinaseaktivität verstärkt wird [19, 127]. Zusätzlich wird FAK an Y861 phosphoryliert, was die Bindung an p130cas erhöht [2, 73]. Eine weitere Phosphorylierung an Y925 ermöglicht eine Aktivierung von

17 1.3 Regulierung und Signalwege der Fokaladhäsion 9 Abbildung 1.5: Phosphorylierung von Vinculin in MEF-WT-Zellen. Links ist eine Immunfärbung gegen Vinculin, in der Mitte gegen phosphoryliertes Vinculin (Y100) dargestellt. Rechts ist das Verhältnis von phosphoryliertem zu unphosphoryliertem Vinculin in Falschfarben zu sehen, wobei warme Farben eine stärkere Phosphorylierung zeigen. Maßstab = 10 µm. Verändert nach [84]. MLCK und damit eine indirekte Regulation der FA-Dynamik [78]. Die vielseitige und zentrale Position von FAK unterstreicht die Wichtigkeit der Phosphorylierung als Signalmechanismus der FA. Die Kinasen der Src-Familie Von der Familie der Src Kinasen sind insgesamt 9 Vertreter (Lyn, Fyn, Lck, Hck, Fgr, Blk, Yrk, Yes, Src) bekannt, von denen jedoch nur Src, Yes und Fyn ubiquitär exprimiert werden, während alle anderen auf hämatopoietische Zellen, Neuronen oder Lymphozyten beschränkt sind [4, 66]. Der Prototyp der Src-Familie wurde 1977 als v-src, dem transformierenden Onkogen des Rous-Sarkoma Retrovirus, entdeckt. Das zelluläre Analog ist Src (c-src oder pp60src), eine mehrfach regulierte Tyrosin Kinase die an Zelldifferenzierung, Proliferation und Migration beteiligt ist [4]. Src (60 kda) besteht aus einer C-terminalen Kinasedomäne, einer N-terminalen SH3 Domäne, die an prolinreichen Sequenzen bindet und einer SH2 Bindedomäne, die tyrosinphosphorylierte Proteine erkennt [3]. N-terminal findet sich zusätzlich ein Myristidyl-Anker, der die Kinase in der Plasmamembran verankert (siehe auch Abb. 1.6). Am C-Terminus befindet sich nahe der Kinasedomäne ein Tyrosin (Y530), welches phosphoryliert (vermittelt durch C-terminal Src Kinase, CSK) eine intramolekulare Bindung zur N-terminalen SH2 Domäne eingeht. Zur Aktivierung von Src muss dieses Tyrosin dephosphoryliert werden, was u.a. von der Rezeptor-Tyrosin Phosphatase a und den Phosphatasen Shp-1 und Shp-2 vermittelt wird [4]. Ein weiteres Tyrosin an Y416 befindet sich in der sogenannten Aktivierungsschleife und muss für eine vollständige Aktivität der Kinasedomäne von FAK phosphoryliert werden. Eine weitere Möglichkeit der Aktivierung von Src liegt in der

18 10 Einleitung Bindung von p130cas [98]. Abbildung 1.6: Schematische Darstellung der Aktivierung von Src. Im oberen Teil ist die Domänenstruktur dargestellt. Unten ist Src in inaktiver Form sowie aktiviert durch die Bindung von FAK an Integrine zu sehen. Verändert nach [4]. Alle weiteren SFK sind im Aufbau analog zu Src, welche die am meisten untersuchte Kinase ist [4]. Über die weiteren Kinasen ist außerhalb der Rolle in der Tumorgenese wenig bekannt. Yes (62 kda) und Fyn (59 kda) sind wie Src in verschiedenen Tumorarten hochreguliert [87, 97, 99]. Fyn hat verschiedene Aufgaben in Zellzyklus-Eintritt, Wachstum und Proliferation. Zusätzlich wurden immunologische und neuronale Funktionen untersucht [97]. Yes hat Funktionen im Zellzyklus und bei der Zytokinese [62]. Alle drei fungieren jedoch in der FA als Signalüberträger [87] Vinculin in der Fokaladhäsion Vinculin ist ein Protein, welches sich als Hauptstrukturprotein in FA und den verwandten Zell-Zell-Kontakten Adherens Junctions gezeigt hat. Vinculin gliedert sich in eine globuläre Kopf- und eine globuläre Schwanzdomäne, die über eine prolinreiche Halsregion verbunden sind [7]. An der Schwanzdomäne befinden sich Bindestellen für Aktin und

19 1.3 Regulierung und Signalwege der Fokaladhäsion 11 Paxillin, in der Kopfdomäne für a-actinin und Talin [126]. Die Halsregion verfügt über Bindestellen für VASP, Vinexin, Ponsin, PIP 2 und Arp2/3 [124]. Die zentrale Funktion in der FA zeigt sich u.a. dadurch, dass Vinculin-Knockout-Zellen kleinere Adhäsionen haben, weniger stark adhärieren und schneller migrieren [119]. Vinculin kann in einer geöffneten und einer geschlossenen Konformation vorliegen. Durch die Bindung der Kopf- an die Schwanzdomäne werden sämtliche Bindungsstellen für andere Proteine unzugänglich und das Protein ist inaktiv [7]. Der Mechanismus, durch den Vinculin aktiviert werden kann, ist noch nicht sicher geklärt, aber es wurden verschiedene Modelle vorgeschlagen. Zum einen kann die Bindung von sauren Phospholipiden an die Schwanzregion von Vinculin die intramolekulare Bindung lösen. Dies wird auch durch die Bindung von mehr als zwei anderen Interaktionspartnern Vinculins bewirkt [7], wobei die hochaffine Bindung von Talin oder a-actinin alleine bereits ausreichen können [15]. Ein anderer Mechanismus beinhaltet die Phosphorylierung von Vinculin an den Tyrosinen Y100 und Y1065, die über die Src Kinase vermittelt wird [126]. Simulationen konnten zeigen, dass eine solche Aktivierung notwendig ist, um eine stabile Bindung von Talin zu ermöglichen [45]. Zusätzlich werden die Austauschdynamiken von Vinculin direkt über die Phosphorylierung reguliert: stabile, reife Fokaladhäsionen zeigen wenig Phosphorylierung. Im Gegensatz dazu sind FA während des Auf- oder Abbaus hoch phosphoryliert. Zellen mit mutiertem, nicht phosphorylierbaren Vinculin (Y1065F) zeigen ebenfalls eine verringerte Austauschdynamik [79] p130cas als möglicher Mechanosensor Bei p130cas (Crk Associated Substrate, Cas, Breast Cancer Anti-estrogen Resistance oder BCAR1) handelt es sich um ein ubiquitär exprimiertes Strukturprotein von etwa 130 kda, das Zellmotilität sowie Proliferation reguliert [28]. Mäuse, die p130cas nicht exprimieren sterben pränatal. p130cas Knockout Zellen zeigen verkürzte und diffusere Aktinfilamente sowie weniger und schwächer ausgebildete FA [54]. In Abb. 1.7 sind die Domänenstrukturen von p130cas dargestellt. Das Protein besteht aus einer aminoterminalen SH3 Domäne, einer zentralen Substratbindedomäne und carboxyterminal einer SFK-Bindedomäne. Die SH3 Domäne kann mit einer Reihe von Proteinen interagieren, darunter die Kinasen FAK und Pyk2 und die Phosphatase PTP-PEST. In der C-terminalen Domäne befindet sich eine Bindestelle für Kinasen der Src-Familie und eine Bindestelle für Proteine der Nsp Familie (Nsp1, And-34 und Chat). Die C-terminale SFK-Bindedomäne lokalisiert zusammen mit der N-terminalen SH3 Domäne das Protein in der FA, während die Substratdomäne daran nicht beteiligt ist [80]. Diese hat 15 Wiederholungen von einer YxxP Sequenz aus Tyrosin und Prolin, die phosphoryliert eine Bindedomäne für das Adapterprotein Crk darstellt [77].

20 12 Einleitung Abbildung 1.7: Domänenstruktur von p130cas. Die SH3 Domäne befindet sich N-terminal und interagiert mit FAK, während die C-terminale Domäne mit Kinasen der Src-Familie interagiert. Die Substratdomäne enthält 15 Wiederholungen einer YxxP Sequenz, die phosphoryliert Bindedomänen für Crk darstellen. Entnommen aus Defilippi et al [28] Die SH3 Domäne ist für die Lokalisation von p130cas in die FA notwendig. Zusätzlich ist Cas durch eine weitere Phosphorylierungsstelle (Y12) in der SH3 Domäne reguliert [60]. Ist Y12 phosphoryliert ist die Lokalisation in der FA sowie die Interaktion mit FAK und PTP-PEST verringert. Und obwohl p130cas von FAK nicht phosphoryliert wird [105, 111]. wirkt FAK als Adapterprotein und rekrutiert Src, was eine verstärkte Phosphorylierung von Cas bewirkt [38]. Eine mutierte Form des Tyrosins (Y12F), das eine nicht phosphorylierbare Form darstellt, zeigt eine deutliche Verstärkung der Phosphorylierung von p130cas [60]. p130cas wurde als eines der Proteine isoliert, die bei einer Transformation mit v-src hochgradig phosphoryliert werden [98]. Die Phosphorylierung von p130cas erfolgt von Src entweder direkt über die Bindung an die SFK-Bindedomäne oder indirekt über die Bindung von Src an die Autophosphorylierungsstelle Y397 von FAK [95]. Die Tyrosine 6 bis 15 der Substratdomäne sind die Hauptstellen, die von Src phosphoryliert werden [106]. Reguliert wird die Phosphorylierung auch von einer sehr großen Anzahl an Wachstumsfaktoren, Hormonen oder EZM-Proteinen aber auch durch mechanische Dehnung, Scherfluß oder osmotischen Stress [13]. Sawada et al. konnten 2006 zeigen, dass p130cas stark phosphoryliert wird, wenn es auf einer elastischen Membran immobilisiert ist und diese gedehnt wird [101]. Die Phosphorylierung erfolgt durch Src, wobei keine Erhöhung in der Aktivität der Kinase zu beobachten war. Die Substratdomäne von p130cas besteht aus einer Reihe von Wiederholungen einer bestimmten Sequenz. Solche Wiederholungen sind typische Merkmale für Proteine, die in ihrer Länge variabel sind, wie beispielsweise Titin. Die 15 Wiederholungen in Cas könnten eine gleiche Funktion haben. Sawada et al.

21 1.3 Regulierung und Signalwege der Fokaladhäsion 13 konnten zeigen, dass die Substratdomäne wie eine Feder funktioniert und die Phosphorylierungsstellen für Src zugänglich werden, wenn das Protein entfaltet oder aufgezogen wird (siehe Abb. 1.8). Zusätzlich detektiert ein Antikörper, der gegen die entfaltete Form von p130cas gerichtet ist, das Protein verstärkt in FA an der Zellperipherie, wo besonders starke Zellkräfte wirken. An phosphoryliertes p130cas bindet das Adapterprotein Crk. welches mit verschiedenen weiteren Proteinen interagiert und weitere Signalkaskaden aktiviert [13]. Abbildung 1.8: Schematische Darstellung von p130cas in entspannter und aufgezogener Form. Wird das Protein auseinander gezogen werden kryptische Phosphorylierungsstellen frei, an die das Adapterprotein Crk bindet und große Anzahl verschiedener Proteine rekrutiert, die auf Proliferation, Motilität und das Aktinzytoskelett wirken. Aus [101]. Zur Cas-Familie gehören noch zwei weitere Proteine, HEF1 und Efs/Sin. HEF1 (Human Enhancer of Filamentation) reguliert Mitose und Neuritenwachstum, Efs/Sin (Embryonal

22 14 Einleitung fyn substrate/src interacting) ist in T-Lymphozyten aktiv [28]. Vieles deutet darauf hin, dass diese Proteine keine überlappenden Funktionen ausüben [13], so dass sie für die vorliegende Arbeit vernachlässigt wurden Das Adapterprotein Crk Crk (CT10 Regulator of a Tyrosine Kinase) wurde 1990 als Protein beschrieben, das in der Lage ist den Phosphorylierungsgehalt deutlich zu erhöhen ohne eine eigene Kinasedomäne zu haben. Dabei war das am stärksten phosphorylierte Protein p130cas [75]. Crk-Proteine gehören zur Gruppe der Adapterproteine und sind in der Lage andere Proteine in räumliche Nähe zu bringen und so die Signalübertragung zu vermitteln. In Abb. 1.9 sind die verschiedenen Isoformen der Crk Proteine dargestellt. CrkI bis III sind dabei Spleißvarianten des gleichen Gens, während CrkL (Crk Like) von einem anderen Gen transkribiert wird und mit CrkII zu 60 % homolog ist [100]. Allen Isoformen ist eine N-terminale SH2- und SH3-Domäne (SH3 N ) gemein. v-crk, welches von Sarkoma Retroviren exprimiert wird, verfügt zusätzlich noch über eine GAG-Sequenz, die virale Funktionen enthält. CrkII und CrkL haben eine weitere, C-terminale SH3 Domäne (SH3 C ), die über eine 50 Aminosäure lange, prolinreiche Sequenz mit der SH3 N verbunden ist [76, 13]. Über die dritte Spleißvariante CrkIII ist nur bekannt, dass sie eine verkürzte SH3 C Domäne hat [91]. Abbildung 1.9: Die Isoformen von Crk. CrkI ist der viralen Form ähnlich und konstitutiv aktiv. CrkII und CrkL sind über die Phosphorylierungsstelle reguliert. Verändert nach [108] Während CrkI konstitutiv aktiv ist, sind CrkII und CrkL über eine intramolekulare Bindung regulierbar, durch die alle 3 Domänen für Bindungspartner unzugänglich werden. Dabei bindet die SH2 Domäne an ein Phosphotyrosin, in CrkII an Position 221, in Crk L an Position 207. Die Phosphorylierung wird durch die Abl Kinasen übertragen [37]. Ob CrkI+II und CrkL unterschiedliche Funktionen haben, wird in der aktuellen Forschung diskutiert. Im Reelin-Signalweg spielen sie überlappende Rollen [86] während

23 1.3 Regulierung und Signalwege der Fokaladhäsion 15 Knockout Mäuse unterschiedliche, aber auch übereinstimmende Defekte zeigen [85, 47]. Auch zeigen Experimente, dass CrkI und CrkII unterschiedliche Funktionen haben können, obwohl sie mit Ausnahme einer weiteren Bindedomäne bei Crk II identisch sind. Antoku et al. haben 2009 gezeigt, dass nach Stimulation mit dem Wachstumsfaktor PDGF durch CrkI die kleine GTPase Rap1 aktiviert wird, während CrkII und CrkL Rac1 aktivieren [5]. Eine Deletionsmutante von CrkII, der die SH3 Domäne fehlt, zeigte ebenfalls eine verstärkte Aktivierung von Rap1. Wie es sein kann, dass die beiden Isoformen trotz ihres ähnlichen Aufbaus unterschiedliche GTPasen aktivieren, ist noch unklar. Möglicherweise wird dies über sterische Hinderung durch die SH3 C Domäne vermittelt [5, 67]. Diese Domäne könnte generell die Affinität von CrkII zu Bindungspartnern durch sterische Hinderung beeinflussen und dadurch bestimmte Bindungspartner bevorteilen. Crk bindet an phosphoryliertes p130cas und rekrutiert dann eine Reihe weiterer Signalproteine. Dazu gehören u.a. C3G, Dock1 und SOS1, die verschiedene Rollen in der Regulation von Proliferation, Zytoskelett und Motilität spielen Bindungspartner von Crk Crk interagiert mit einer Reihe von Proteinen [13]. Als Adapterprotein agiert es als Vermittler, indem Crk mit der SH2 Domäne an ein py enthaltendes Protein bindet und ein weiteres Protein rekrutiert wird. So kann Crk die Interaktion von p130cas mit Dock1, C3G, Abl, JNK, SOS und PI3K vermitteln. JNK und SOS sind in Zusammenhang mit p130cas in der Kontrolle des Zellzyklusses involviert und damit für mechanosensorische Signalwege von untergeordneter Rolle. Abl ist dagegen eine Kinase, die Crk deaktivieren kann, bei C3G und Dock1 handelt es sich um GEFs die auf kleine GTPasen wirken, die im Zusammenhang mit Adhäsion und Migration stehen. Abl Abl1 (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1, c-abl) und Abl2 (auch Arg, Abelson related gene) sind Tyrosinkinasen, die zueinander zu 70 % homolog sind [13]. Die Kinasen liegen sowohl zytoplasmatisch als auch im Nucleus vor. Sie sind zunächst inaktiv und werden durch Autophosphorylierung und Phosphorylierung durch SFK aktiviert [110]. Abl wirkt auf Zellmigration, Zelladhäsion, Zelldifferenzierung sowie Apoptose. Durch Phosphorylierung von CrkII und CrkL an Y221 bzw. Y207 regulieren sie die Aktivität dieser Adapterproteine, wobei Crk selbst in der Lage ist Abl zu aktivieren [107]. Des weiteren fördert Zelladhäsion die Aktivierung von Abl und bewirkt eine Translokalisation des Proteins vom Nucleus zum Zytoplasma [72].

24 16 Einleitung C3G C3G (Crk SH3-domain-binding guanine-nucleotide releasing factor, Rapgef1) ist ein Guanin Austauschfaktor für die kleinen GTPasen Rap1, Rap2 und R-Ras. Es entfernt das GDP von der inaktiven Kinase, ermöglicht damit eine erneute Bindung von GTP und bewirkt damit eine Aktivierung der GTPase [46]. Rap1 reguliert das Zytoskelett, Zellproliferation, Zell-Zell Verbindungen sowie die Zelladhäsion. Bei letzterem verstärkt aktiviertes Rap1 die Affinität von Integrinen zu EZM-Liganden [16]. Weitere Signalwege, die aktiviert werden können, laufen über JNK1 und MAPK. Dock1 Bei Dock1 (Dedicator of cytokinesis, Dock180) handelt es sich ebenfalls um einen Guanin Austauschfaktor, der jedoch Rac1 aktiviert indem das Protein im nucleotidfreien Zustand stabilisiert wird [25]. Für die Aktivierung von Rac1 ist jedoch noch die Aktivierung eines weiteren Proteinkomplexes (ELMO) durch die SFK notwendig [74]. Die Rho-Familie der kleinen GTPasen, zu denen Rac1, Rho und Cdc42 gehören, regulieren Zellwachstum, zytoskeletale Organisation sowie die Organisation von FA [10, 92] Der ERK1/2 Signalweg ERK1 (Extracellular signal-regulated kinase, MAPK3) und ERK2 (Extracellular signalregulated kinase, MAPK1) gehören zu den MAP Kinasen (Mitogen activated protein kinase). Sie wirken auf eine Reihe zellulärer Funktionen wie Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose oder Motilität und Adhäsion [68, 88]. Der Signalweg, der zur Aktivierung von ERK1/2 führt verläuft in vielen Einzelschritten. Im ersten Schritt werden Zelloberflächenrezeptoren stimuliert, die die kleine GTPase Ras aktivieren. Diese bindet und aktiviert Raf, welche wiederum durch Phosphorylierung die MEK1 und 2 (MAPK and ERK kinase) aktiviert. MEK1/2 sind selbst Kinasen und aktivieren schließlich ERK1/2 wiederum durch Phosphorylierung [68]. Aktiviertes ERK1/2 phosphoryliert und aktiviert ihrerseits verschiedene Proteinkinasen oder Transkriptionsfaktoren [23]. Eine Rolle in der zyklischen Dehnung konnte an Fibroblasten festgestellt werden. Die Phosphorylierung von ERK1/2 steigt bei zyklischer Dehnung nach 10 min stark an. In FAK Knockout Zellen ist dieser Anstieg reduziert [116]. Dieser Signalweg scheint ebenso in der Erkennung zyklischer Dehnung beteiligt zu sein.

25 1.4 Eigene Vorversuche zu MEF-WT, -SYF und -Src Eigene Vorversuche zu MEF-WT, -SYF und -Src++ Für die Versuche der zellulären Reorientierung wurden Fibroblastenzelllinien aus der Maus, MEF-WT, -SYF und -Src++ verwendet. MEF-SYF fehlen die drei ubiquitär exprimierten SFK (Src, Yes und Fyn) während MEF-Src++ nur Yes und Fyn fehlen. Die Charakterisierung der Zelllinien wurde im Rahmen meiner Diplomarbeit durchgeführt. Die Ergebnisse daraus bildeten eine Grundlage für die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche und werden hier noch einmal zusammengefasst 1. Abb zeigt Immunfärbungen der verwendeten Zelllinien. MEF-WT und -SYF wurden zusammen gegen Vinculin (links, grün) und Phosphotyrosin (mitte, rot) gefärbt und mit gleichen Einstellungen aufgenommen. MEF-WT zeigt eine starke Phosphotyrosin-Färbung in den FA, während MEF-SYF zwar FA normal ausbildet, die Phosphotyrosin-Färbung jedoch bis auf eine schwache Restfärbung nicht zu erkennen ist. MEF-Src++ wurde zu einem späteren Zeitpunkt aufgenommen und statt Vinculin ist das Aktinzytoskelett gefärbt. Die Phosphotyrosin-Färbung in den FA ist auch hier gut zu erkennen. Verschiedene Versuchsreihen an MEF-WT und -SYF-Zellen konnten zeigen, dass die FA in allen drei Zelllinien normal gebildet werden. Sie zeigen eine vergleichbare Größe mit dem Unterschied, dass MEF-SYF im Mittel doppelt soviele FA wie MEF-WT oder -Src++ aufweist. Die über Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) gemessenen Austauschraten von GFP-Vinculin zeigten keinen Unterschied. Die Kraft, die von Zellen auf ihr Substrat übertragen, wurde über Traction Force Microscopy gemessen und zeigte keinen eindeutigen Unterschied zwischen den Zelllinien [84]. 1.5 Ziele der Arbeit Mechanische Reize wirken nicht nur auf ganze Organismen sondern sind auch auf zellulärer Ebene von entscheidender Bedeutung. Sie regulieren Proliferation, Migration und beeinflussen die Zelle in Morphologie oder Ausrichtung. Die an der Erkennung von externen mechanischen Reizen beteiligten Signalwege sind stark vernetzt und es ist durchaus möglich, dass verschiedene Signalwege zur gleichen Reaktion führen bzw. ein einzelner Reiz verschiedene Reaktionen auslöst. Der bisherige Ansatz zur Entschlüsselung der Signalwege war es, in vitro über die Interaktionen von Proteinen auf deren Funktion zu schließen, oder aber Proteine bzw. das Zytoskelett zu isolieren und die Reaktion getrennt zu beobachten. In dieser Arbeit sollte die Reaktion von ganzen Zellsystemen statt isolierter Bestandteile 1 Auswirkung der Phosphorylierung auf die Eigenschaften und Mechanosensorik von Fokaladhäsionen, Bonn 2009, Institut für Bio- und Nanosysteme, IBN 4, Forschungszentrum Jülich GmbH

26 18 Einleitung auf zyklischer Dehnung als mechanischen Reiz untersucht werden. Als Zellsystem sollten MEF-Zellen verwendet werden, über die auf dem Gebiet der Mechanosensorik bereits viel Abbildung 1.10: Tyrosin-Phosphorylierung von MEF-SYF, -Src++ und -WT. Die Abbildung aus der Diplomarbeit zeigt eine Färbung gegen Phosphotyrosin und Vinculin bzw. Aktin. MEF-WT und -SYF wurden zusammen gefärbt und mit gleichen Einstellungen aufgenommen, während - Src++ nachträglich hinzugenommen wurde. Bei MEF-WT und -Src++ ist die Phosphorylierung der FA zu sehen, während MEF-SYF nur eine sehr schwache Restfärbung zeigt. Die FA sind bei MEF-SYF trotz fehlender Phosphorylierung normal ausgebildet. Maßstab = 10 µm.

27 1.5 Ziele der Arbeit 19 untersucht wurde und von denen eine Reihe Mutationen zur Verfügung stehen und die sich zudem gut transfizieren lassen, was die Verwendung von sirna ermöglicht. Durch Quantifizierung der Zellantwort auf einen mechanischen Reiz, in diesem Fall die Umorientierung der Zelle bei zyklischer Dehnung in eine Richtung, die für die Zelle minimalen Stress bedeutet, sind die Wirkungen einzelner Proteine auf Funktionen in der ganzen Zelle sichtbar. Die wichtigsten Ankerpunkte der Zelle sind die FA, deren Rolle in der Mechanosensorik vielfach untersucht wurde. Bekannt ist, dass die Phosphorylierung von Kinasen bei zyklischer Dehnung kurzzeitig stark ansteigt [36]. Die für die Regulierung der FA wichtigsten Kinasen sind die FAK und Src. Von beiden ist bekannt, dass sie die Reorientierung von Zellen bei zyklischer Dehnung beeinflussen [82, 96]. Die Rolle der anderen Kinasen der SFK sowie über Proteine des weiteren Signalweges ist noch nicht untersucht. Insbesondere p130cas stellt einen interessanten Ansatz in der Mechanosensorik dar, da von diesem Protein gezeigt wurde, dass es wie eine Feder bei mechanischer Dehnung aufgezogen wird wodurch kryptische Phosphorylierungsstellen frei werden, die dann weitere Signalproteine aktivieren können [101]. Im Rahmen dieser Dissertation sollten mittels der genauen Bestimmung der Reorientierung von Zellen aufgrund zyklischer Dehnung die Funktionen von Bestandteilen der Signalkaskaden in der Wahrnehmung und Verarbeitung mechanischer Reize untersucht werden.

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29 2 Material und Methoden 2.1 Zellkultur Zelllinien Für die vorliegende Arbeit wurden verschiedene MEF (mouse embryonic fibroblast) Zelllinien verwendet. Die MEF-Wildtyp (MEF-WT) Zelllinie wurde uns von B. de Strooper (Neuronal Cell Biology Laboratory, Katholieke Universiteit Leuven and Flanders Interuniversitary Institute for Biotechnology, Belgien) überlassen [51]. MEF-SYF (Src, Yes und Fyn) ist eine dreifach-knockout Mutante, der die drei ubiquitär exprimierten Kinasen der Src-Familie fehlen. MEF-Src++ fehlen ausschließlich Yes und Fyn, während Src weiterhin normal exprimiert wird [66]. Bei diesen beiden Zelllinien kann man mit Ausnahme der fehlenden Kinasen von einem vergleichbaren genetischen Hintergrund ausgehen, da die Isolation zeitgleich aus Tieren des gleichen Wurfs erfolgte. Beide Zelllinien wurden über ATCC erworben (ATCC CRL-2459 und CRL-2497). Die MEF-Cas-Zelllinien basieren auf Cas-Knockout-Zellen, die 1998 unter der Leitung von H. Hirai (Third Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, University of Tokyo, Japan) isoliert wurden [55]. Sie wurden von P. M. Fonseca (Prof. S. K. Hanks, Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine, Nashville, TN, USA) mit Plasmiden stabil transfiziert und uns zur Verfügung gestellt [38]. MEF-Cas -/- trägt einen leeren Vektor, MEF-Cas-WT exprimiert unverändertes p130cas und MEF-Cas-15F exprimiert eine mutierte Form von p130cas, in der alle 15 Tyrosine der Substratdomäne durch Phenylalanin ersetzt wurden. Dadurch stellt MEF-Cas-15F eine stille und nicht phosphorylierbare Form des Proteins dar. Alle drei Zelllinien exprimieren zur Kontrolle der Transfektion GFP, das jedoch nicht an die Proteine gebunden ist. Die MEF-Crk-Knockout-Zelllinien wurden uns von T. Curran (The Children s Hospital of Philadelphia, Philadelphia, PA, USA) zugeschickt. MEF-Crk-/-CrkL+/+ (im Folgenden Crk -/-) fehlt Crk I und Crk II während CrkL normal exprimiert wird, bei MEF- Crk+/+CrkL-/- (im Folgenden CrkL -/-) fehlt CrkL während beide Isoformen von Crk exprimiert werden. MEF-Crk+/+CrkL+/+ (im Folgenden Crk-WT) ist eine unveränderte WT Zelllinie, die als Kontrolle für die beiden Knockout Zelllinien fungiert [86].

30 22 Material und Methoden Die Vinculin Knockout Zelllinie (MEF-Vinc -/-) wurde uns zusammen mit einer MEF- WT Zelllinie (im Folgenden zur Unterscheidung MEF-WT-V genannt) von W. H. Goldmann (Friedrich Alexander Universität, Erlangen-Nürnberg) zur Verfügung gestellt [69]. Für einzelne Versuche wurden auch HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), humane Nabelschnurfibroblasten sowie Podozyten verwendet. Diese Experimente wurden von T. Feichtmeier im Rahmen seiner Bachelorarbeit durchgeführt 1. Die HUVECs wurden von Lonza (Bestellnummer C2519A) erworben, die Nabelschnurfibroblasten wurden uns von T. Noll (Universität Bielefeld) zur Verfügung gestellt. Die differenzierten Podozyten aus der Maus wurden ebenfalls von W. H. Goldmann (Friedrich Alexander Universität, Erlangen-Nürnberg) zur Verfügung gestellt. Die Podozyten wurden wie beschrieben kultiviert [32] Kulturbedingungen Die MEF-Zellen wurden bei 37 C und 5 % CO 2 in gesättigter feuchter Luft gehalten. Als Kulturmedium diente Dulbecco s Modified Eagles Medium, dem zur Kultur 10 % fötales Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin zugegeben wurde (DMEM++). Die Zellen wurden alle 3 bis 4 Tage bei % Konfluenz passagiert. Hierfür wurden alle benötigten Lösungen auf 37 C vorgewärmt und eine mit Medium befüllte Kulturflasche bereit gestellt. Zur Passage wurden die Zellen zunächst mit PBS gewaschen und anschließend mit einer geeigneten Menge (1 ml pro T25-Flasche) einer Trypsin/EDTA-Lösung inkubiert. Nach vollständigem Ablösen der Zellen wurde die Reaktion mit der gleichen Menge Medium abgestoppt. Die Zellen wurden bei 200 g für 2 min abzentrifugiert, der Überstand abgesaugt, verworfen und die Zellen in DMEM++ resuspendiert. Die HUVECs wurden in EGM-2 und die Nabelschnurfibroblasten in ECGM kultiviert Transfektion Für die Transfektion mit Plasmiden wurden die Zellen am Vortag in gewünschter Zellzahl ausgesäht. Die Transfektion erfolgte über Lipofectamin Pro Transfektion wurden zwei Ansätze vorbereitet: im ersten Ansatz wurde Medium (DMEM - -, d.h. DMEM ohne weitere Zusätze) mit dem Transfektionsreagenz vermischt, im zweiten Ansatz mit Plasmid-DNA. Für eine 6-Loch-Platte wurden pro Ansatz je 250 µl Medium und 5 µl Lipofectamin 2000 bzw. 2 µg DNA verwendet, für eine 12-Loch-Platte je 100 µl Medium und 2 µl Lipofectamin 2000 bzw. 0,8 µg DNA. Die Ansätze wurden für 5 min bei RT (Raumtemperatur) inkubiert, anschließend Ansatz 1 zu Ansatz 2 pipettiert und weitere 1 Tim Feichtmeier, Etablierung von Phosphorylierungsanalysen an Adhäsionsproteinen tierischer Zellen unter zyklischer Dehnung, Bonn 2010