Biochemisches Praktikum 1 DNA-Analytik Praktischer Teil

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1 Biochemisches Praktikum 1 DNA-Analytik Praktischer Teil

2 2 Inhaltsverzeichnis Sicherheitshinweise DNA-Analytik 1 Arbeitshinweise DNA-Analytik 2 Gießen von Agarosegelen 3 Isolierung genomischer DNA 4 Isolierung genomischer DNA aus Gewebe 5 Isolierung genomischer DNA aus Hefe 7 Analyse genomischer DNA 10 Restriktionsspaltung genomischer DNA 11 Auftrennung genomischer DNA im Agarosegel 12 Isolierung von Plasmid DNA 13 Alkalische Lyse 15 Boiling Methode 16 Analyse von DNA im Agarosegel 17 Kontrolle der Plasmid-DNA im Agarosegel 18 Restriktionsspaltung 19 Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA 20 Restriktionskartierung - Auftrennung der Plasmidspaltungen im Agarosegel 22 Transformation von Bakterien 23 Polymerase Kettenreaktion - PCR 26 Optimierung von PCR Bedingungen 27 PCR mit genomischer Hefe-DNA 31 DNA-Längenstandard, Plasmidkarten 33 Anzusetzende Puffer 34 Vorhandene Puffer und Stocklösungen 35 Protokoll zum Grundpraktikum DNA-Analytik 36

3 Sicherheitshinweise DNA-Analytik Sicherheitshinweise und Entsorgungsrichtlinien: Mercaptoethanol o Der Lyticase-Puffer enthält β-mercaptoethanol: Mercaptoethanol ist gesundheitsschädlich und riecht schlecht ; Arbeiten mit Mercaptoethanol immer im Abzug durchführen; Flüssige Abfälle, die Mercaptoethanol enthalten, in Sondermüllbehälter (wässrige Abfälle) sammeln! Spitzen/Plastikgefäße, die mit Mercaptoethanol kontaminiert sind, im Abzug in Abfallbehälter sammeln und vor der Entsorgung mindestens 24h abdampfen lassen! SYBR Safe o SYBR Safe ist ein Farbstoff, der sich an DNA quantitativ anlagert. Untersuchungen haben bisher keine kanzerogenen oder genotoxischen Wirkungen gezeigt. Daher ist SYBR Safe im Vergleich zu Ethidiumbromid eine deutlich sicherere Methode, um DNA zu färben. Trotz der getesteten Ungefährlichkeit handhaben wir SYBR Safe wie Ethidiumbromid. D.h. Jeder Kontakt mit der Haut ist zu vermeiden! Beim Handhaben von SYBR Safe IMMER Handschuhe tragen; Alle SYBR Safe-haltigen Fest-Anfälle (Agarosegele, verschmutzte Handschuhe, Wischtücher ) sind als Sondermüll zu sammeln (SYBR-Safe-Abfall, fest). Während der Arbeit mit SYBR Safe Verspritzen von Agarose möglichst vermeiden. Agarosetropfen sofort mit einem saugfähigen Tuch aufnehmen. Beim Eintrocknen bilden Agarosereste Stäube, die SYBR-Safe enthalten und durch die Luft aufgenommen werden können! Der Agarosegel Laufpuffer wird in speziellen Kanistern gesammelt. Mikrowelle o Bei Arbeiten mit der Mikrowelle Vorschrift genau beachten! Zum Aufkochen der Agarose nur Weithals-Erlenmeyerkolben verwenden; Kolben maximal zu 1/3 mit Puffer füllen; zur Vermeidung von Siedeverzügen Rührfisch in den Kolben geben; Agarose stufenweise erhitzen; um Verbrühungen zu vermeiden Handschuhe tragen; UV-Licht o Im Geldokumentationssystem wird ein UV-Illuminator zum Sichtbarmachen der DNA verwendet. UV-Licht schädigt bei zu langer Exposition Haut und Augen; niemals direkt ins UV-Licht schauen, Schutzbrillen und Handschuhe tragen. Die Sicherheitseinrichtung des Iluminators verhindert den direkten Kontakt mit UV-Licht; Sicherheitsfunktionen nutzen und bei Fehlfunktionen sofort die/den Betreuer/in benachrichtigen! Alkalische Lyse o Der Lysispuffer enthält NaOH ätzend! 1

4 Arbeitshinweise DNA-Analytik Arbeitshinweise allgemein: o während der Arbeit Handschuhe tragen (Schutz der Probe vor Kontamination mit DNasen) o für jeden Pipettierschritt frische Spitze verwenden o Eppis mit Gruppennummer beschriften (Edding) o Enzyme immer auf Eis lagern o RNase und Restriktionsenzyme auf Eis lagern! o Taq-Polymerase und dntps auf Eis lagern o Entsorgungsanweisungen beachten Arbeitshinweise Mercaptoethanol: o während der Arbeit Handschuhe tragen o Arbeiten mit Merctapoethanol nur unter dem Abzug! o Entsorgungsanweisungen für Mercaptoethanol beachten Arbeitshinweise SYBR Safe: o während der Arbeit Nitril - Handschuhe tragen o Arbeiten mit SYBR Safe nur an den ausgewiesenen Plätzen! o Entsorgungsanweisungen für SYBR Safe beachten Arbeitshinweise Bakterien: - während der Arbeit Handschuhe tragen - für jeden Pipettierschritt eine frische Spitze verwenden - Eppis und Platten eindeutig beschriften, Platten auf dem Boden beschriften - Verschmutzungen mit Bakteriensuspension sofort mit 70 C Ethanol desinfizieren! 2

5 Gießen von Agarosegelen Gießen der Agarosegele für die Auftrennung der DNA-Proben: - Benötigtes Gelvolumen berechnen - 1 x TAE Puffer ansetzen (verdünnen aus 50 x TAE) Setzen Sie 1 L 1 x TAE an; Sie brauchen diesen Puffer auch als Laufpuffer und für weitere Agarosegele; wenn Ihnen der 1x TAE Puffer ausgeht, neuen verdünnen; - Agarose abwiegen für eine Endkonzentration von 0,8 bzw. 1,2 % (bezogen auf 100 % Volumen) und in entsprechend großen Weithals-Erlenmeyerkolben geben; - Ca. 60 % des benötigten Endvolumen 1 x TAE zugeben, Agarose durch Schwenken suspendieren; Rührfisch in den Kolben geben (verringert Gefahr des Siedeverzugs) - 2 x in Mikrowelle aufkochen lassen: Wiederholt nur kurz erwärmen, dann Kolben entnehmen und schwenken; Vorsicht: Siedeverzug möglich. Deshalb: Schutzbrille tragen und langsam aufheizen. - Solange Aufkochen lassen, bis Gellösung klar und frei von ungelösten Partikeln ist mindestens 2-mal. - Gellösung auf den Rührer stellen und unter Rühren mit 1 x TAE auffüllen auf Endvolumen; Lösung unter Rühren auf ca. 50 C abkühlen lassen. - Gel- Schiffchen in Gießstand einsetzen und fixieren (Betreuer fragen) - Pro 100 ml Gelvolumen 10 µl SYBR Safe Stocklösung zur Gellösung geben, mischen, Gellösung in die Gel-Schiffchen gießen, Kamm einsetzen; - Gel ca. 30 min lang aushärten lassen; das Gel muss fest sein, bevor es abgedeckt wird! - Zur Lagerung (über Nacht) vorsichtig in Alufolie schlagen (im Gießstand); darauf achten, dass der Kamm nicht bewegt wir, da sonst die Taschen beschädigt werden; - Bis zum Gebrauch am nächsten Tag bei Raumtemperatur (RT) lagern; Für ein kleines Gel werden 50 ml Gel gegossen und ca. 300 ml Laufpuffer benötigt, für ein großes Gel werden 150 ml Gel gegossen und ca ml Laufpuffer benötigt. Der Laufpuffer kann über Nacht aufgehoben werden, wenn die Elektrophoresekammer über Nacht mit dem Deckel verschlossen wird. Entsorgung: Die Gele werden über den Sybr-Safe-Festabfall entsorgt (blaue Tonne neben der Geldokumentation), die Laufpuffer werden in speziellen Kanistern gesammelt. Mit SYBR-Safe kontaminierte Pipettenspitzen müssen getrennt gesammelt werden und so wie die Gele entsorgt werden. Beachten Sie die Sicherheitshinweise zu Sybr-Safe im Skript. Folgende Agarosegele werden während der DNA-Analytik Woche benötigt: Analyse Plasmid-DNA: 0,8 % Mini-Gel, ein 8er Kamm, jede Gruppe, Laufstrecke ca. 2/3 Gellänge; Analyse genomische DNA und Restriktionskartierung Plasmid-DNA: 0,8 % Midi-Gel, ein 20er Kamm, jede Gruppe, Laufstrecke ca. 2/3 Gellänge; PCR-Optimierung: 1,2 % Midi-Gel, zwei 20er Kämme, pro vier Gruppen ein Gel; PCR auf genomischer Hefe-DNA: 1,2 % Mini-Gel, zwei 8er Kämme, pro zwei Gruppen ein Gel; 3

6 Isolierung genomischer DNA Im Genom (=genomische DNA) eines jeden Organismus sind alle Informationen gespeichert bzw. kodiert, die notwendig sind um diesen Organismus funktionieren zu lassen. Jede Zelle enthält mindestens eine Kopie dieser Organismus-spezifischen DNA. Obwohl mittlerweile viele Genome sequenziert sind und damit theoretisch alle Informationen über ihre DNA in einer Datenbank vorliegen, ist es sowohl im normalen Leben als auch in der medizinischen, genetischen, molekularbiologischen oder biochemischen Forschung immer wieder notwendig genomische DNA zu gewinnen. Abstammungsnachweise oder forensische Tatort Analysen basieren genauso auf der Untersuchung genomischer DNA, wie die genaue Charakterisierung von Hefe- oder Mausmutanten, die im Labor für wissenschaftliche Untersuchungen generiert oder verwendet werden. Abhängig vom Organismus und der zu untersuchenden Probe kommen verschiedene Methoden zum Einsatz, um Zellen zu zerstören und die genomische DNA freizusetzen. So lassen sich viele Bakterien oder vereinzelte Säugetierzellen schon mit milden Detergenzien zerstören. Andere Zellen, z.b. Hefen, sind durch eine spezielle Zellwand geschützt, die mit besonderen Methoden geöffnet werden muss, um die genomische DNA freizusetzen. In der Zelle befindet sich neben der genomischen DNA eine Vielzahl anderer Stoffe (Proteine, Lipide, Zucker, Salze usw.), die von der DNA abgetrennt werden müssen, um weitere Analysen zu ermöglichen. Im Praktikum werden Sie genomische DNA aus zwei verschiedenen Quellen Hefezellen und Säugetiergewebe mit zwei unterschiedlichen Methoden isolieren: Die Isolierung der genomischen DNA aus Gewebe erfolgt durch Behandlung mit ProteinaseK in einem speziellen Lysispuffer und anschließender Fällung der DNA zur Reinigung und Konzentrierung. ProteinaseK baut Proteine bis zu den einzelnen Aminosäuren ab. Der Abbau der Membranproteine führt zur Zerstörung der Zellen und der Freisetzung aller Zellinhaltsstoffe. Zelluläre Proteine werden von ProteinaseK abgebaut, unlösliche Bestandteile (Haare, Knochen, Sehnen ) können durch Zentrifugation abgetrennt werden. Zur Abtrennung löslicher Verunreinigungen (Aminosäuren, Salze, Zucker ) wird die DNA mit Alkohol präzipitiert und anschließend in einem geringeren Volumen Puffer wieder gelöst. So wird zusätzlich eine Konzentrierung der DNA erreicht. Hefezellen besitzen eine zweischichtige Zellwand, die aus speziellen Proteinen, langkettigen Zuckern und Chitin aufgebaut ist. Diese Zellwand kann weder durch Detergenzien noch durch ProteinaseK abgebaut werden. Um Hefezellen zu zerstören muss zunächst mit einem speziellen Enzym, Lyticase, die kovalente Verknüpfung der Zellwandkomponenten abgebaut werden. Um Verunreinigungen, die mit der Lyticase eingebracht werden, entfernen zu können, erfolgt die enzymatische Behandlung in einem Sorbitolpuffer, der zellwandlose Hefen (= Spheroplasten) osmotisch stabilisiert und ihr Zerplatzen im wässrigen Puffer verhindert. Nach dem Waschen werden die Spheroplasten in einem wässrigen Puffer resuspendiert und durch Zugabe von SDS lysiert. DNA gebundene und zelluläre Proteine werden durch Inkubation bei 70 C denaturiert. Durch K+-Ionen (Zugabe von Kaliumacetat) werden die denaturierten Proteine zusammen mit Dodecylsulfat ausgefällt und können durch Zentrifugation abgetrennt werden. Durch Präzipitation der DNA mit Alkohol werden lösliche Verunreinigungen abgetrennt und die DNA konzentriert. Bitte auch Theorieteil zur DNA-Analytik lesen! 4

7 Isolierung genomischer DNA aus Gewebe, Tag 1 Materialien: - ca. 30 mg Gewebe - Gewebe-Lysispuffer - ProteinaseK Lösung 20 mg/ml - sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml (Eppi) - Isopropanol - 70 % Ethanol p.a. - TE 10/1 - Pipetten - Pipettenspitzen (weiß, gelb, blau) - Schüttel-Heizblock 55 C - Schüttel-Heizblock 42 C - Tisch-Zentrifuge - 3M Na-Acetat Versuchsdurchführung: 500 µl Gewebe-Lysispuffer zur Gewebeprobe pipettieren (1000 µl Pipette, blaue Spitzen) 2,5 µl ProteinaseK, 20 mg/ml, zugeben, mischen durch schwenken (10 µl Pipette, weiße Spitzen) inkubieren bei 55 C über Nacht im Schüttelheizblock bei mittlerer Schüttelfrequenz Achtung: Die DNA-Proben für den Versuch Optimierung von PCR-Bedingungen Pferdefleisch und unbekannte Probe werden identisch zum Versuch DNA-Isolierung aus Gewebe behandelt und hier mit bearbeitet. Jede Gruppe setzt damit 3 Proben zur ProteinaseK Behandlung an: - Gewebe - Pferdefleisch - Unbekannte Probe 5

8 Isolierung genomischer DNA aus Gewebe, Tag 2 Eppi zentrifugieren rpm, 20 min in der Eppendorf-Tischzentrifuge; Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen, falls notwendig, Tara Eppi verwenden Überstand vorsichtig in frisches Eppi überführen (1000 µl Pipette, blaue Spitze), bei der Probeentnahme auf ein mögliches Pellet achten; dieses nicht mit der Pipettenspitze berühren und aufwirbeln (Pellet ist eventuell lose ) 500 µl Isopropanol zum Überstand zugeben, mischen: Isopropanol langsam an der Eppi Wand einlaufen lassen; dies führt zu einem Überschichten der wässrigen DNA- Lösung mit dem Alkohol; an der Phasengrenze fällt die genomische DNA sichtbar aus; Phasen vorsichtig, aber gründlich durch schwenken mischen DNA knäult. zentrifugieren rpm, 15 min Tischzentrifuge Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen, falls notwendig, Tara Eppi verwenden Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen, Pellet nicht mit der Spitze berühren, langsam abpipettieren, das Pellet sollte sich nicht von der Eppi Wand lösen; 1 ml 70 % Ethanol zugeben (Waschschritt), zentrifugieren rpm, 10 min, Tischzentrifuge (siehe oben) Überstand abnehmen und verwerfen (siehe oben), Eppi in Zentrifuge, 10 sec Quick run restlichen Ethanol mit Pipette abnehmen (je nach Menge 10 oder 100 µl Pipette und weiße oder gelbe Spitze) DNA Pellet sofort in 250 µl TE 10/1 lösen TE zu DNA Pellet geben, im Heizblock bei 42 C unter leichtem Schütteln inkubieren; nach ca. 30 min. Lösung vorsichtig auf und ab pipettieren, darauf achten, dass ein eventuell noch nicht gelöstes Pellet nicht in der Spitze kleben bleibt und dadurch verloren geht. sobald sich die DNA vollständig gelöst hat 25 µl 3 M Na-acetat zugeben, mischen, 250 µl Isopropanol zugeben, mischen >DNA fällt aus; (diese zweite Fällung dient der zusätzlichen Reinigung Abtrennen von Salzen) zentrifugieren rpm, 15 min Tischzentrifuge (siehe oben) Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen (siehe oben) 200 µl 70 % Ethanol zugeben, zentrifugieren rpm, 10 min, Tischzentrifuge (siehe oben) Überstand abnehmen und verwerfen (siehe oben), Eppi in Zentrifuge, 10 sec Quick run restlichen Ethanol mit Pipette abnehmen (je nach Menge 10 oder 100 µl Pipette und weiße oder gelbe Spitze) DNA Pellet an Luft trocken (Eppi offen ca. 5 min stehen lassen) DNA lösen in 50 µl TE 10/1 TE auf das DNA-Pellet pipettieren, ca min inkubieren bei 42 C; wenn sich die DNA gelöst hat, mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren und bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank lagern; 6

9 Materialien: Isolierung genomischer DNA aus Hefe, Tag 1 - Hefe Zellpellet - Lyticase-Puffer = Y1 - Spheroplasten-Waschpuffer = Y2 - Lyticase Lösung 10 U/µl - TE 50/ % SDS - 5 M Kaliumacetat - Isopropanol - 70 % Ethanol - TE 10/1 - Pipetten - Pipettenspitzen (weiß, gelb, blau) - Wasserbad 37 C - Eisbad - Tisch-Zentrifugen - sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml - Heizblock, 70 o C und 42 o C - 3 M Na-Acetat Sicherheitshinweise und Entsorgungshinweise auf Seite 1 beachten! Achtung bei Arbeiten mit Mercaptoethanol! Versuchsdurchführung: Hefe Zellpellet resuspendieren in 500 µl Lyticase-Puffer; (1000 µl Pipette, blaue Spitzen); zum Resuspendieren Puffer mehrmals auf und ab pipettieren, vortexen (15 sec, Maximum), und Suspension erneut mehrmals auf und ab pipettieren; es soll eine homogene Suspension vorliegen; Achtung: Lyticase-Puffer enthält Mercaptoethanol giftig! Im Abzug arbeiten! 10 µl Lyticase Lösung, 10 U/µl zugeben (10 µl Pipette, weiße Spitzen); Suspension zum mischen kurz vortexen; Inkubieren bei 37 C, 45 min, im Wasserbad, Suspension ca. alle 10 min vorsichtig mischen zentrifugieren rpm, 5 min in der Tischzentrifuge Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen, falls notwendig, Tara Eppi verwenden Überstand sehr vorsichtig abnehmen, Pellet ist eventuell sehr lose (1000 µl Pipette, blaue Spitzen), mit der Spitze nicht ans Pellet kommen; Überstand in Sondermüll, Spitzen in Abfallbehälter im Abzug; Pellet vorsichtig resuspendieren in 1 ml Spheroplasten-Waschpuffer. Dieser Schritt dient zum Entfernen des restlichen Mercaptoethanols und Verunreinigungen in der Lyticasepräparation. Puffer zugeben und Eppi vorsichtig schwenken; nicht vortexen, nicht oder nur sehr vorsichtig auf und ab pipettieren; Suspension muss nicht vollständig homogen sein; zu kräftiges Mischen kann zur Zerstörung der sehr empfindlichen Hefe Spheroplasten führen (Zellen sind nur noch von einer Zellmembran geschützt) geringere Ausbeute an genomischer DNA 7

10 Isolierung genomischer DNA aus Hefe, Tag 1 zentrifugieren rpm, 5 min in der Tischzentrifuge Überstand sehr vorsichtig abnehmen (siehe oben, Überstand in Sondermüll!) Waschschritt mit Spheroplasten-Waschpuffer wiederholen (500 µl Puffer zugeben, vorsichtig resuspendieren, zentrifugieren) Überstand vorsichtig abnehmen (Überstand in Sondermüll) Pellet resuspendieren in 500 µl TE 50/100 (1000 µl Pipette, blaue Spitzen), zum resuspendieren auf und ab pipettieren, eventuell vorsichtig vortexen; Spheroplasten müssen vollständig resuspendiert sein; 50 µl 10 % SDS zugeben, mischen, inkubieren bei 70 C, 30 min (100 µl Pipette, gelbe Spitzen), 250 µl 5 M K-acetat zugeben, mischen, vorsichtig mischen, nicht vortexen, inkubieren auf Eis, 15 min (1000 µl Pipette, blaue Spitzen); zentrifugieren rpm, 20 min Tischzentrifuge Überstand überführen in frisches Eppi, 700 µl Isopropanol zugeben, mischen (1000 µl Pipette, blaue Spitzen), zentrifugieren rpm, 10 min, Tischzentrifuge Überstand abnehmen und verwerfen, 200 µl 70 % EtOH zugeben zentrifugieren rpm, 5 min, Tischzentrifuge Überstand abnehmen und verwerfen, Eppi in Zentrifuge, 10 sec Quick run Restflüssigkeit abnehmen DNA Pellet sofort in 500 µl TE 10/1 lösen TE zu DNA Pellet geben, im Heizblock bei 42 C unter leichtem Schütteln inkubieren; 8

11 Isolierung genomischer DNA aus Hefe, Tag 2 nach ca. 30 min oder am nächsten Tag Lösung vorsichtig auf und ab pipettieren, darauf achten, dass ein noch nicht gelöstes Pellet nicht in der Spitze kleben bleibt und dadurch verloren geht. sobald sich die DNA vollständig gelöst hat 50 µl 3 M Na-Acetat zugeben, mischen, 500 µl Isopropanol zugeben, mischen >DNA fällt aus; (diese zweite Fällung dient der zusätzlichen Reinigung Abtrennen von Salzen) zentrifugieren rpm, 15 min Tischzentrifuge Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen (siehe oben) 200 µl 70 % Ethanol zugeben, zentrifugieren rpm, 10 min, Tischzentrifuge Überstand abnehmen und verwerfen (siehe oben), Eppi in Zentrifuge, 10 sec Quick run restlichen Ethanol mit Pipette abnehmen (je nach Menge 10 oder 100 µl Pipette und weiße oder gelbe Spitze) DNA Pellet an Luft trocken (Eppi offen ca. 5 min stehen lassen) DNA lösen in 50 µl TE 10/1 TE auf das DNA-Pellet pipettieren, ca min inkubieren bei 42 C; wenn sich die DNA gelöst hat, mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren und bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank lagern; 9

12 Analyse genomischer DNA Die Analyse von Nukleinsäuren (DNA und RNA) erfolgt in der Regel durch Auftrennung in Agarosegelen und gleichzeitiger Anfärbung der DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff. (Kurze Nukleinsäuren bis ca. 250 Basen können auch in Polyacrylamidgelen aufgetrennt werden). Nukleinsäuren besitzen eine gleich bleibende Ladungsdichte, d.h. das Verhältnis von Molekulargewicht zur Ladung ist konstant. Die unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld in einer (Agarose-) Gelmatrix beruht auf der Größen-abhängigen Interaktion der Nukleinsäuremoleküle mit der Gelmatrix. Große Moleküle interagieren stärker und wandern daher langsamer. Die Wandergeschwindigkeit ist daher nicht nur von der Größe der Nukleinsäuren, sondern auch von der Gelmatrix selber abhängig. Je enger vernetzt die Gelmatrix, Agarose, ist, umso langsamer bewegen sich die Nukleinsäuren. Für große Nukleinsäuren werden daher niedrig prozentige (0,6 0,8%) Agarosegele verwendet, für kürzere Nukleinsäuren höher prozentige (1,0 4,0%). Das Anfärben der DNA im Agarosegel erfolgt im Praktikum mit SYBR Safe, einem DNA interagierenden Cyanin-Farbstoff, der sich an die DNA anlagert. Der Farbstoff wird in die Gelmatrix mit eingegossen. Wenn sich die DNA durch die Agarose bewegt, bindet SYBR Safe an die DNA. Auf einem UV-Schirm kann dann die DNA über die Fluoreszenz des Farbstoff- DNA-Komplexes sichtbar gemacht werden. Für die Größenbestimmung der untersuchten DNA-Fragmente wird auf jedem Gel ein käuflicher DNA Größenstandard mit aufgetragen und aufgetrennt. Der Vergleich der Laufstrecke der zu untersuchenden DNA-Fragmente mit diesem Größenstandard erlaubt dann eine Längenabschätzung. Da die Größenstandards verschiedene DNA-Fragmente in einer definierten Konzentration enthalten, kann der Vergleich der Fluoreszenzintensität von Markerbanden mit zu analysierender DNA-Bande auch zu einer groben Mengenabschätzung verwendet werden. Bei der Isolierung genomischer DNA wird nicht nur die DNA freigesetzt, sondern auch die in den Zellen vorhandene RNA. Die im Praktikum verwendeten Methoden können nicht zwischen DNA und RNA unterscheiden. Deshalb wird mit der DNA auch RNA gefällt. Abhängig vom Zelltyp kann so viel RNA mit der DNA isoliert werden, dass weitere Analysen durch die RNA gestört werden. Durch die Behandlung der gereinigten genomischen DNA mit RNase wird die RNA abgebaut und stört dann weder bei der Analyse im Agarosegel noch bei weiteren enzymatischen Behandlung der DNA. Für weiterführende Arbeiten mit (genomischer) DNA ist es oft sinnvoll und notwendig diese in kleinere, definierte Fragmente zu zerschneiden. Hierfür werden Restriktionsendonukleasen (= Restriktionsenzyme) verwendet. Restriktionsenzyme binden sequenzspezifisch an doppelsträngige DNA und spalten den DNA-Doppelstrang an spezifischen Stellen. Die Bindeund Spaltungsstellen der gängigen Restriktionsenzyme sind vier bis acht Basenpaare lang und meist palindromisch. Wie häufig eine Restriktionsstelle statistisch innerhalb eines DNA- Fragments vorkommt hängt von der Länge der Erkennungssequenz ab. Die vier Basenpaar lange Erkennungsstelle von HaeIII sollte daher viel häufiger in genomischer DNA auftreten als die sechs Basenpaar lange Erkennungssequenz von EcoRI. Bei der Spaltung der beiden genomischen DNAs mit HaeIII sollten daher statistisch kleinere Fragmente entstehen, als mit EcoRI. Bitte auch Theorieteil zur DNA-Analytik lesen! 10

13 Restriktionsspaltung genomischer DNA, Tag 2 Materialien: - genomische Gewebe- und Hefe-DNA aus Versuch 1.) und 2.) - Restriktionsendonuklease EcoRI - Restriktionsendonuklease HaeIII - EcoRI 10 x Reaktionspuffer (10 x Eco, schwarz beschriftet) - 10 x Reaktionspuffer R, (10 x R, rot beschriftet) - H 2 O bidest (autoklaviert) - RNaseA 10 mg/ml - Pipetten - Spitzen (weiß, gelb) - Eppendorf Tubes 1,5 ml, steril - Agarose - 50 x TAE - SYBR Safe Lösung - Agarosegel Kammern, Kämme - DNA-Längenstandard GeneRuler TM, 1 kb DNA Ladder - 5 x DNA Auftragspuffer - Wasserbad 37 C - Eisbad - Geldokumentationssystem Sicherheitshinweise und Entsorgungshinweise auf Seite 1 beachten! Achtung bei Arbeiten mit SYBR Safe! Versuchsdurchführung: RNase Behandlung und Restriktionsspaltung: Genomische DNA RNase A 10 x Eco (10 x Puffer) EcoRI (Restriktionsenzym) 10 x R (10 x Puffer) HaeIII (Restriktionsenzym) H 2 O (autoklaviert) Gewebe 10 µl µl Gewebe 10 µl 2 µl Hefe 10 µl µl Hefe 10 µl 2 µl Gewebe 10 µl 3 µl 3 µl 3 µl µl Gewebe 10 µl 3 µl µl 3 µl 11 µl Hefe 10 µl 3 µl 3 µl 3 µl µl Hefe 10 µl 3 µl µl 3 µl 11 µl DNA vorlegen, Puffer, RNaseA, Restriktionsenzym und H 2 O bidest pipettieren, Eppis kurz anzentrifugieren, dann den Spaltungsansatz durch mehrmaliges auf und ab pipettieren mischen; Spaltungsansatz inkubieren bei 37 C über Nacht, am Mittwoch einfrieren auf 20 C; Achtung: Sie benötigen noch einige µl Hefe-DNA für die PCR Reaktion 11

14 Auftrennung genomischer DNA im Agarosegel, Tag 4 Agarosegelelektrophorese 0,8 % Agarosegel gießen (Tag 3, siehe Vorschrift Seite 3) Vorbereiten der Apparatur: - Elektrophoreseapparatur, Gelträger, Kamm und Gelgießstand gründlich mit Wasser und Spülmittel reinigen (Nitril - Handschuhe tragen); - Mit deionisiertem Wasser (VE-Wasser) nachspülen und trocknen lassen (oder mit Küchentuch nachtrocknen - Gel entsprechend Vorschrift auf Seite 3 herstellen und verpacken - Alufolie und Kamm vorsichtig entfernen, Schiffchen aus dem Gießstand nehmen; - Eventuell ausgelaufenes oder verspritztes Gel aufnehmen und in SYBR Safe-Abfall fest geben. - Gelschiffchen in die Kammer einsetzen Laufrichtung der DNA beachten! - Puffer vorsichtig in die Gelkammer einfüllen; der Puffer soll ca. 2-3 mm über dem Agarosegel stehen; Gelauftrag: Tasche Probe Proben- menge Proben- volumen Auftrags- puffer 5 x H 2 O bidest END- volumen 1 Längenstandard 1000 ng 10µl -- 2 Gewebe-DNA, - RNase 5 µl 2 µl 3 µl 10 µl 3 Gewebe-DNA, + RNase 5 µl 2 µl 3 µl 10 µl 4 Hefe-DNA, - RNase 5 µl 2µl 3 µl 10 µl 5 Hefe-DNA, + RNase 5 µl 2 µl 3 µl 10 µl 6 Gewebe-DNA/EcoRI 20 µl 5 µl 25 µl 7 Gewebe-DNA/HaeIII 20 µl 5 µl 25 µl 8 Hefe-DNA/EcoRI 20 µl 5 µl 25 µl 9 Hefe-DNA/HaeIII 20 µl 5 µl 25 µl Konzentration Längenstandard: 100 ng/µl Proben mit 100 µl Pipette/gelben Spitzen vorsichtig in die Geltaschen füllen, Deckel aufsetzen; (Achtung! Proben aus Versuch Plasmidspaltung werden ebenfalls auf dieses Gel aufgetragen!) Elektrophorese erfolgt bei V für ca. 30 min., dann mit V bis der blaue Farbstoff etwas weiter als zur Mitte des Gels gewandert ist; Am Ende der Elektrophorese Strom abstellen, Gel mit Träger aus der Kammer nehmen und in Tragschale mit saugfähigem Papier legen (Nitril - Handschuhe!) Gelbild am Dokumentationssystem erstellen Gelkammer, Gelträger und Kämme nach Gebrauch sofort mit reichlich Wasser reinigen; 12

15 Isolierung von Plasmid-DNA Plasmide sind kleine, zirkuläre DNA-Moleküle, die in einigen Mikroorganismen (Bakterien, Hefen) natürlich vorkommen. Sie sind nicht Bestandteil der genomischen DNA (extrachromosomal). Um stabil in einer Bakterienkultur erhalten zu bleiben, müssen Plasmide zwei genetische Grundelemente enthalten: Einen Replikationsursprung (origin), der vom bakteriellen Replikationapparat erkannt wird und das Plasmid vervielfältigt und ein Gen, das den Bakterien einen Wachstumsvorteil gegenüber plasmidlosen Bakterien vermittelt. - Für die Manipulation von DNA bieten Plasmide einige wichtige Vorteile, die sie zu einem unverzichtbaren Bestandteil aller Labors, die mit DNA arbeiten, gemacht haben: - Plasmide vereinen auf einer minimalen DNA-Sequenz alle Faktoren (Replikationsursprung, Markergen), die notwendig sind, um sie stabil in Bakterienzellen zu vermehren. - Plasmide können in großer Menge (µg mg) getrennt von der genomischen DNA aus Bakterien isoliert werden. - Plasmide lassen sich hoch effizient in speziell präparierte Bakterien einführen (transfomieren). - Durch (heute) einfache Verfahren können Plasmide modifiziert und dadurch den Bedürfnissen des Nutzers angepasst werden. (Einführen verschiedener Markergene, speziell Antibiotika-Resistenzgene, Einführen von Restriktionsschnittstellen => Klonierungsvektoren, Einführung von Promotoren => Expressionsvektoren, ) Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien ist im Vergleich zur Isolierung von genomischer DNA aus Hefe oder Gewebe schnell, einfach und sehr effizient. Im Praktikum werden zwei weit verbreitete Methoden vorgestellt: Auf der Isolierung von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse basieren die meisten heute kommerziell erwerbbaren Kits zur Plasmidisolierung. Die Bakterienzellen werden in einer Pufferlösung, die auch EDTA zur Komplexierung zweiwertiger Kationen enthält, resuspendiert. Die Zugabe eines NaOH und SDS haltigen Puffers führt zur Denaturierung aller Proteine (und damit zur Lyse der Zellen) und der DNA (sowohl genomische DNA als auch Plasmid-DNA). Die Zugabe von Kaliumacetat neutralisiert die Lösung. Die DNA beginnt wieder zu renaturieren, wobei dieser Prozess bei den kleinen Plasmiden deutlich schneller geht, als bei genomischer DNA. Da die beiden Einzelstränge eines Plasmid aufgrund der zirkulären Natur miteinander verlinkt bleiben, finden sich die komplementären Stränge auch schnell wieder. Die Zugabe von K + -Ionen fällt außerdem das Dodecylsulfat zusammen mit den Proteinen aus. Die genomische Bakterien DNA wird dabei mit ausgefällt, da sie einerseits kovalent an Membranproteine gebunden ist und außerdem von denaturierten Proteinen bedeckt ist, die sie bei der Fällung mitreißen. Das Kalium-dodecylsulfat-Protein-genomische DNA Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt. Die renaturierte Plasmid-DNA befindet sich im wässrigen Überstand und kann daraus mit Alkohol zur weiteren Reinigung und Konzentrierung ausgefällt werden. Einhalten der Inkubationszeiten und ein vorsichtiges Mischen (nicht kräftig Schütteln, nicht vortexen) sind wichtig um ein Freisetzen der genomischen DNA zu verhindern. Wird diese durch zu langes Einwirken der NaOH von den gebundenen Membranproteinen gelöst oder mechanisch (heftiges Schütteln) geschert, geht sie ganz oder teilweise in Lösung und kann dann nicht mehr von der Plasmid-DNA abgetrennt werden. Bei der Isolierung von Plasmid-DNA nach der Boiling Methode werden die Bakterienzellen durch ein Enzym (Lysozym) zusammen mit einem milden Detergenz aufgeschlossen. Proteine werden durch kurzzeitiges Erhitzen im kochenden Wasserbad denaturiert. Das für die Zelllyse verwendete Detergenz ist nicht stark genug, um die denaturierten Proteine in Lösung zu halten. 13

16 Isolierung von Plasmid-DNA Sie fallen zusammen mit Zelltrümmern aus. Auch hier reißen die denaturierten Proteine die genomische DNA mit. Durch Zentrifugation können daher Zelltrümmer, denaturierte Proteine und genomische DNA abgetrennt werden. Wie bei der alkalischen Lyse ist das Einhalten der Inkubationszeiten äußerst wichtig, da bei zu kurzen Zeiten die Zellen nicht lysieren und die Proteine nicht denaturieren und bei zu langen Zeiten die genomische DNA freigesetzt wird und in Lösung geht. Bitte auch Theorieteil zur DNA-Analytik lesen! Es werden 4 verschiedene Bakterienkulturen ausgegeben (beschriftet mit 9, 12, 16 oder 26), die jeweils ein unterschiedliches Plasmid tragen. Pro Gruppe wird ein Plasmid auf zwei verschiedene Methoden isoliert. Sie entnehmen dafür 2 x 5 ml Bakterienkultur aus einem Erlenmeyerkolben (vor der Entnahme Kultur aufschütteln), überführen sie in je ein Plastikröhrchen und zentrifugieren die Röhrchen in der Eppendorfzentrifuge bei 4000 rpm für 5 min. Der Überstand wird abgegossen und die Bakterienpellets auf Eis gelagert. Notieren Sie sich die Nummer Ihrer Bakterienkultur! Falls die Bakterien nicht als Übernachtkultur, sondern als fertiges Zellpellet ausgegeben werden, achten Sie darauf, dass Ihre beiden Bakterienpellets die gleiche Nummer tragen! Die Entnahme aus dem Erlenmeyerkolben, die Zentrifugation und das Abgießen des Überstandes entfallen dann natürlich. 14

17 Isolierung von Plasmid-DNA, Tag 2 Isolierung von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse: Materialien: - Bakterienpellet aus 5 ml Kultur - Resuspensionspuffer =P1 - Lysispuffer =P2 - Neutralisationspuffer =P3 - Isopropanol - 70 % Ethanol p.a. - TE 10/1, steril (autoklaviert) - RNaseA Lösung 10 mg/ml - 15 ml Rundbodenröhrchen - Glaspipetten - Pipettierhilfe - sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml (Eppi) - Pipetten - Pipettenspitzen (weiß, gelb, blau) - Eisbad - Tisch-Zentrifugen - Eppendorf-Zentrifuge für 15ml Röhrchen Versuchsdurchführung: Bakterienpellet mit 300 µl Resuspensionspuffer aufnehmen; 1000 µl Pipette, blaue Spitze; Zellpellet resuspendieren durch auf und ab pipettieren; der Resuspensionspuffer enthält keine RNaseA, daher keine Inkubation nach Resuspendierung; Bakteriensuspension überführen in 1,5 ml Eppi; 300 µl Lysispuffer zugeben, vorsichtig mischen bis Suspension klar wird (nicht schütteln, nicht vortexen! Mischen durch auf den Kopf drehen) 3 5 min inkubieren bei RT; 300 µl Neutralisationspuffer zugeben (zwischen der Zugabe von Lysis- und Neutralisationspuffer sollen nicht mehr als 5 min vergehen), vorsichtig, aber vollständig mischen (nicht schütteln, nicht vortexen), inkubieren auf Eis für 5 min Zentrifugieren bei rpm, 10 min in der Tisch-Zentrifuge; Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen, Klaren Überstand überführen in frisches 1,5 ml Eppi, 600 µl Isopropanol zugeben, gründlich mischen Zentrifugieren bei rpm, 20 min in Tischzentrifuge, Eppis tariert stellen, Überstand abnehmen und verwerfen; (vorsichtig abgießen oder mit 1000 µl Pipette abnehmen) 200 µl 70 % Ethanol zugeben, zentrifugieren 5 min/ rpm in Tischzentrifuge Überstand abnehmen und verwerfen; (100 µl Pipette, gelbe Spitze), Eppi kurz anzentrifugieren (in Tischzentrifuge, 10 sec Quick run) restliche Flüssigkeit abnehmen; DNA Pellet 5 min an Luft trocknen (Eppi offen stehen lassen) DNA Pellet lösen in 45 µl TE 10/1, 5 µl RNase A, 10 mg/ml zugeben 15

18 Isolierung von Plasmid-DNA, Tag 2 Isolierung von Plasmid-DNA nach der Boiling Methode: Materialien: - Bakterienpellet aus 5 ml Kultur - Puffer STET - Lysozym Lösung, 10 mg/ml - Isopropanol - 70 % Ethanol (p.a.) - TE 10/1, steril (autoklaviert) - RNaseA Lösung, 10 mg/ml - 15 ml Rundbodenröhrchen - Glaspipetten - sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml (Eppi) - Pipetten - Pipettenspitzen (weiß, gelb, blau) - Wasserbad 100 C - Tisch-Zentrifugen - sterile Zahnstocher/Impfnadeln - Eisbad - Eppendorf-Zentrifuge für 15ml Röhrchen Versuchsdurchführung Bakterienpellet mit 350 µl Puffer STET resuspendieren; 1000 µl Pipette, blaue Spitze; Zellpellet resuspendieren durch auf und ab pipettieren; vorsichtig pipettieren, nicht vortexen, Puffer enthält Triton X-100 und schäumt; Puffer STET enthält keine RNaseA, es ist kein Inkubationsschritt nach dem Resuspendieren notwendig; Bakteriensuspension überführen in 1,5 ml Eppi; 25 µl Lysozym Lösung, 10 mg/ml zugeben, vortexen 3 sec; Eppi sofort in 100 C Wasserbad stellen, inkubieren für 40 sec Eppi zentrifugieren rpm, 10 min, Tisch-Zentrifuge; Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen, falls notwendig, Tara Eppi verwenden Bakterienpellet mit sterilem Zahnstocher (Impfnadel, gelbe Spitze) entfernen; 420 µl Isopropanol zugeben, mischen; zentrifugieren bei rpm, 20 min, Tisch-Zentrifuge Überstand abnehmen und verwerfen; (vorsichtig abgießen oder mit 1000 µl Pipette, blauer Spitze abnehmen) 200 µl 70 % Ethanol zugeben, zentrifugieren 5 min/ rpm, Tisch-Zentrifuge; Überstand abnehmen und verwerfen; (100 µl Pipette, gelbe Spitze), Eppi kurz anzentrifugieren (Tisch-Zentrifuge, 10 sec. Quick run) restliche Flüssigkeit abnehmen DNA Pellet 5 min an Luft trocknen (Eppi offen stehen lassen) DNA Pellet lösen in 45 µl TE 10/1, 5 µl RNaseA zugeben 16

19 Analyse von DNA im Agarosegel Für lineare DNA-Fragmente gibt es bei der Auftrennung im Agarosegel eine lineare Abhängigkeit von Fragmentlänge (in Basenpaaren) und Laufstrecke. So ist es möglich einen linearen DNA-Längenstandard mit auf das Gel aufzutragen und durch Vergleich Rückschlüsse auf die Länge der zu analysierenden DNA zu ziehen. Für zirkuläre Plasmid-DNA gilt diese einfache Korrelation von Laufstrecke zu Größe nicht. Hier ist das Laufverhalten stark von der Form der zirkulären DNA abhängig. Plasmid-DNA liegt in Bakterien in der Regel verdrillt vor. D.h. der DNA-Ring ist zu einer Art Superhelix gewunden. Diese sogenannte supercoiled Form der Plasmid-DNA ist sehr kompakt und nimmt weniger Raum ein, als ein lineares DNA Molekül der gleichen Größe. Im Agarosegel läuft ein supercoiled Plasmid schneller, als man es ausgehend von seiner Größe erwarten würde. Ist nur in einem der DNA-Stränge an einer Stelle das DNA Phosphatrückrat gebrochen, kommt es zu einer Entspannung des verdrillten zirkulären DNA-Moleküls. Dieser entspannte, relaxed DNA-Zirkel ist im Agarosegel sperriger als das supercoiled Molekül und auch sperriger als ein vergleichbar großes lineares DNA-Molekül. Das relaxed Plasmid läuft daher langsamer als das supercoiled und lineare Plasmid. Einzelstrangbrüche im DNA-Rückrat können durch mechanische Belastung oder geringste Spuren von Nuklease Aktivität eingeführt werden und sind in einer Plasmid Präparation nicht vermeidbar. Das Verhältnis von supercoiled zu relaxed Form ist ein Maß für die Qualität der Plasmid Präparation (viel supercoiled = gut). Das Auftrennen der gereinigten Plasmid-DNA im Agarosegel gibt somit Aufschluss über die Qualität der DNA. Durch Auftragen einer Plasmid-DNA mit bekannter Konzentration kann außerdem die ungefähre Konzentration der eigenen Plasmid-DNA abgeschätzt werden. Will man die tatsächliche Größe eines Plasmids im Agarosegel abschätzen, muss man es zunächst mit einem Restriktionsenzym linearisieren. Bitte auch Theorieteil zur DNA-Analytik lesen! 17

20 Kontrolle der Plasmid-DNA im Agarosegel, Tag 3 Kontrolle und Mengenabschätzung der isolierten Plasmid-DNA: Materialien - Kontroll-DNA - Plasmid-DNA aus Versuch Seite 15 und 16 - H 2 O bidest (autoklaviert) - Pipetten - Spitzen (weiß, gelb) - Eppendorf Tubes 1,5 ml, steril - Agarose - 50 x TAE - SYBR Safe Lösung 1 mg/ml (?) - Agarosegel Kammern, Kämme - DNA-Längenstandard GeneRuler TM, 1 kb DNA Ladder - 5 x DNA Auftragspuffer - Geldokumentationssystem Sicherheitshinweise und Entsorgungshinweise auf Seite 1 beachten! Achtung bei Arbeiten mit SYBR Safe! Versuchsdurchführung: 0,8 % Agarosegel gießen siehe Vorschrift Seite 3 Gelauftrag: Alle Proben werden auf ein Endvolumen von 10 µl eingestellt Tasche Probe Probenmenge Probenvolumen Auftragspuffer 5 x 1 Längenstandard 1000 ng? -- H 2 O bidest Endvolumen 2 Kontroll-DNA 500 ng? 2 µl? 10 µl 3 Plasmid-DNA-AL 2,5 µl 2 µl? 10 µl 4 Plasmid-DNA-AL 5 µl 2 µl? 10 µl 5 Plasmid-DNA-B 2,5 µl 2 µl? 10 µl 6 Plasmid-DNA-B 5 µl 2 µl? 10 µl 7 Kontroll-DNA 1000 ng 2 µl? 10 µl Konzentration DNA Marker: 100 ng/µl Konzentration Kontroll-DNA: 200 ng/µl Geltaschen vorsichtig, aber gründlich mit gelber oder blauer Spitze ausspülen Proben mit 10 µl Pipette/weiße Spitzen vorsichtig in die Geltaschen füllen, Deckel aufsetzen Elektrophorese erfolgt bei 80 V bis der blaue Farbstoff etwa in die Mitte des Gels gewandert ist; Am Ende der Elektrophorese Strom abstellen, Gel mit Träger aus der Kammer nehmen und in Tragschale mit saugfähigem Papier legen (Nitril - Handschuhe!) Gelbild am Dokumentationssystem erstellen Gelkammer, Gelträger und Kämme nach Gebrauch sofort mit reichlich Wasser reinigen; 18

21 Restriktionsspaltung Restriktionsenzyme spalten DNA sequenz-spezifisch unter Ausbildung definierter Enden. Die Verteilung der Restriktionsschnittstellen ist für jedes DNA Fragment charakteristisch (da Sequenz abhängig). Restriktionsanalysen bzw. Restriktionskartierungen können daher zur Charakterisierung und Identifizierung von DNA-Fragmenten verwendet werden. Die Ausbildung definierter Enden ermöglicht es nicht nur große DNA-Moleküle in kleinere Fragmente zu zerschneiden, sondern auch, bei passenden Enden, DNA-Fragmente in neuer Anordnung wieder zusammen zufügen. Die im Labor üblicherweise verwendeten Restriktionsenzyme Typ II haben palindromische Erkennungssequenzen und schneiden innerhalb dieser Erkennungssequenz symmetrisch. Auf diese Weise werden, je nach Enzym, überhängende oder glatte Enden erzeugt. Da Restriktionsenzyme sequenz-spezifisch spalten, sind die Basen an den neu erzeugten Enden für jedes Restriktionsenzym immer gleich und bekannt. Überhängende Enden, die vom selben Restriktionsenzym erzeugt wurden, können durch spezielle Enzyme (Ligasen) wieder zusammengefügt werden. Überhängende Enden, die von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen gebildet wurden, sind nicht kompatibel und lassen sich nicht miteinander ligieren (von dieser Regel gibt es einige Ausnahmen). Auf diese Weise kann man z.b. gezielt bestimmte DNA-Fragmente in Plasmide einführen. Ein mit EcoRI linearisiertes Plasmid hat zwei EcoRI spezifische Enden, die sich mit einem Fragment, das ebenfalls EcoRI Enden hat, verbinden lassen. So wird das Fragment in das Plasmid eingefügt. Anschließend kann das Plasmid in Bakterien transformiert und dort vermehrt werden. Zur Kontrolle, ob das Einfügen des Fragments funktioniert hat, wird das Plasmid wieder aus Bakterien isoliert und erneut mit EcoRI gespalten. Da durch das Zusammenfügen zweier EcoRI Enden die EcoRI Erkennungsstelle wieder regeneriert wird, lässt sich anhand der Spaltprodukte einfach feststellen, ob das Plasmid das Fragment aufgenommen hat oder ob nur die kompatiblen Plasmidenden zusammengefügt wurden. Glatte Enden können ebenfalls von Ligasen zusammen gefügt werden. Allerdings können bei glatten Enden auch durch verschiedene Restriktionsenzyme erzeugte Enden miteinander ligiert werden. In der Regel wird dabei aber keine Restriktionsschnittstelle regeneriert. Im Praktikum verwenden Sie eines von vier verschiedenen Plasmiden (die DNA haben Sie im vorherigen Versuch selber isoliert). Die Plasmid-DNA werden Sie mit verschiedenen Restriktionsenzymen spalten und anschließend auf einem Agarosegel auftrennen und sichtbar machen. Die Spaltungsmuster, das Sie finden, sind spezifisch für ein bestimmtes Plasmid. Durch die Spaltung mit einzelnen Enzymen und unterschiedlichen Kombinationen aus zwei Enzymen, können Sie aus den Spaltungsmustern eine Restriktionskarte des Plasmids erstellen, die Ihnen Auskunft darüber gibt, welche Restriktionsschnittstelle wie oft und in welchen Abstand zueinander auf Ihrem Plasmid vorkommen. Bitte auch Theorieteil zur DNA-Analytik lesen! 19

22 Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA, Tag 3 Materialien: - Plasmid-DNA aus 4.) oder 5.); (qualitativ bessere DNA verwenden) - H 2 O bidest, autoklaviert - verschiedene 10 x Reaktions-Puffer - verschiedene Restriktionsenzyme - H 2 O bidest, autoklaviert - Eppendorf Tubes, steril, 1,5 ml (Eppi) - Agarose - 50 x TAE - SYBR Safe Lösung - Pipetten - Pipettenspitzen (weiß, gelb) - Wasserbad 37 C - Tisch-Zentrifugen - Agarosegel Kammern, Kämme - DNA-Längenstandard GeneRuler TM, 1 kb DNA Ladder - 5 x DNA Auftragspuffer - Geldokumentationssystem - Eisbad Versuchsdurchführung: allgemeiner Spaltungsansatz: Spaltungen: x µl Plasmid-DNA 1/10 Vol 10 x Puffer (entsprechend Enzym) y µl Enzym (maximal 1/10 Vol. des Gesamtansatzes) z µl H 2 O bidest, autoklaviert (H 2 O ad Endvolumen) - Setzen Sie jeweils 1000 ng Plasmid-DNA pro Spaltung ein - Konzentration der Plasmid-DNA entsprechend Ihrer Berechnung - Plasmid-DNA falls notwendig verdünnen - Setzen Sie 10 Units Enzym pro Spaltung ein, bei Doppelspaltungen 10 Units für jedes Enzym - Konzentration der Enzymlösungen: 10 Units/µl - Endvolumen der Spaltungsansätze: 20 µl Enzym 1 Enzym 2 10 x Puffer EcoRI (schwarz) EcoRI unique (10 x Eco, schwarz) HinDIII (rot) Fermentas R (10 x R, rot) NdeI (grün) Fermentas O (10 x O, grün) EcoRI HinDIII Fermentas R (10 x R, rot) EcoRI NdeI Fermentas O (10 x O, grün) HinDIII NdeI Fermentas R (10 x R, rot) (schwarz, rot, grün = Farbe der Beschriftung auf ausgegebenen Tubes) 20

23 Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA, Tag 3 Eppis für Spaltungen vorbereiten beschriften, in sinnvoller Reihenfolge in Ständer sortieren Plasmid-DNA in Eppis vorlegen (10 µl Pipette, weiße Spitzen) entsprechenden 10 x Puffer zugeben (10 µl Pipette, weiße Spitzen) Enzym(e) zugeben, eventuell Eppis kurz zentrifugieren (quick run) um Enzym am Eppi- Boden zu sammeln; (10 µl Pipette, weiße Spitzen) H 2 0 bidest autoklaviert zugeben, mischen durch auf und ab pipettieren (100 µl Pipette, gelbe Spitzen) Inkubieren bei 37 C für 2 3 h, eventuell auch über Nacht 0,8 % Agarosegel gießen siehe Vorschrift Seite 3 21

24 Restriktionskartierung Auftrennung der Plasmidspaltungen im Agarosegel, Tag 4 Markerproben vorbereiten (siehe Auftragsschema), Auftragspuffer zu DNA-Proben geben Auftragsschema: Tasche Probe Proben- menge Proben- volumen Auftrags- puffer 5 x H 2 O bidest End- volumen 1 Längenstandard 1000 ng? -- 2 Plasmid-DNA, ungesp. 500 ng? 2µl 10 µl 3 EcoRI-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl 4 HinDIII-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl 5 NdeI-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl 6 EcoRI/HinDIII-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl 7 EcoRI/NdeI-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl 8 HinDIII/NdeI-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl Elektrophorese bei 60 V für min, dann bei 120 V bis blauer Farbstoff etwas weiter als die Mitte des Gels gelaufen ist; Gel dokumentieren 22

25 Transformation von Bakterien Unbehandelte Zellen nehmen DNA gar nicht oder nur sehr schlecht auf. Um Zellen zu transformieren, d.h. DNA in sie einzubringen, muss die Zellmembran zunächst permeabel gemacht werden. Es gibt verschiedene Methoden mit denen unterschiedliche Zelltypen transformiert werden können. Im Praktikum transformieren wir Bakterien, die zuvor durch Behandlung mit einem Ca 2+ -Ionen haltigen Puffer kompetent für die Aufnahme von DNA gemacht wurden. Kompetente Bakterien sind relativ empfindlich. Sie werden direkt nach dem kompetent machen in kleine Arbeitsportionen aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Nach dem Auftauen sollten sie weder heftig gemischt (nicht vortexen) werden, noch zu lange rumstehen. Besonders wichtig ist es die Zellen vor der Transformation ständig auf Eis gekühlt zu halten. Beachtet man diese Regeln nicht, verlieren die Zellen sehr schnell ihre Kompetenz und die Effizienz der DNA Aufnahme und damit die Anzahl der erhaltenen Bakterienkolonien sinkt drastisch ab. Für die Transformation werden die Bakterienzellen mit einer definierten Menge Plasmid-DNA gemischt und auf Eis inkubiert. Es erfolgt dann ein kurzer Hitzeschock bei 42 Grad. Dieser führt dazu, dass die DNA in die Zelle aufgenommen wird. Um den Zellen Zeit zur Erholung zu geben, werden sie kurz auf Eis gestellt und dann mit wenig Medium ohne Selektionsantibiotikum gemischt und bei 37 C inkubiert. Die Inkubation ohne Selektionsantibiotikum ermöglicht es den Bakterien das Resistenz vermittelnde Protein (kodiert auf dem transformierten Plasmid) zu expremieren. Bei einigen Antibiotika, die die Translation irreversibel inhibieren ist dies ein essentieller Schritt. Würde das Resistenzgen nicht vor Zugabe des Antibiotikums schon in der Zelle vorliegen, könnte es wenn Translationshemmer als Selektionsmittel verwendet werden, nicht mehr gebildet werden. Nachdem die Bakterienzellen Zeit hatten sich vom Transformationsstress zu erholen und das Resistenzgen zu expremieren, wird der Transformationsansatz verdünnt und Aliquots der Verdünnungen auf Medienplatten, die den Selektionsmarker enthalten ausplattiert. Bitte auch Theorieteil zur DNA-Analytik lesen! 23

26 Transformation von Bakterien, Tag 4 Materialien: - kompetente Bakterien (Stamm Top10F ) - Plasmid-DNA pgex oder pet-acid - TE 10/1, steril - LB flüssig Medium - LB amp /LB kan Platten - Glasperlen - sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml (Eppi) - Pipetten - Pipettenspitzen (weiß, gelb, blau) - Eisbad - Wasserbad 42 C - Schüttler 37 C - 15 ml Rundbodenröhrchen Versuchsdurchführung: Verdünnen der Plasmid-DNA auf 10 ng/µl in 10/1 TE; die Konzentration der ausgegebenen Plasmid-DNA ist auf den Eppis angegeben; bei der Verdünnung falls nötig in Schritten vorgehen nicht 1 µl Plasmid-DNA 1000 ng/µl in 99 µl TE geben, sondern 1 µl Plasmid-DNA 1000 ng/µl zu 9 µl TE DNA-Lösung mit 100 ng/µl Plasmid; von dieser Verdünnung wieder 1 µl zu 9 µl TE geben Konzentration DNA-Lösung 10 ng/µl 50 ng DNA bzw. 5 µl TE vorlegen in je ein Eppi inkubieren auf Eis für 5 min (die 5 µl TE dienen als Negativkontrolle) Bakterien Suspension auftauen auf Eis nicht schütteln, nicht vortexen Je 50 µl Bakterien zur DNA bzw. TE geben, mischen durch vorsichtiges pipettieren inkubieren auf Eis für 30 min Bakteriensuspension in Wasserbad 42 C stellen inkubieren für 2 min (Heatshock) auf Eis für 5 min Inkubationszeiten bei 42 C exakt einhalten, auf keinen Fall länger inkubieren; 950 µl LB zugeben mischen Bakteriensuspensionen (= Trafoansatz TS) inkubieren bei 37 C im Thermo-Schüttler bei 700 rpm, für 45 min; Platten vorbereiten: - Beschriften und Glasperlen (ca pro Platte) aufbringen, Platten bis zu Verwendung umgedreht auf dem Deckel liegen lassen) Plattieren: In der Tabelle angegebene Verdünnungen ansetzen: Transformationsansatz vortexen, 100 µl entnehmen und zu 900 µl LB geben = Verdünnung 10-1 ; diese 10-1 Verdünnung vortexen, 100 µl entnehmen und zu 900 µl LB geben = Verdünnung 10-2 ; 24

27 Transformation von Bakterien, Tag 4 Verdünnungs- Verdünnungs- Plattierungs- Anzahl faktor ansatz volumen Platten Plasmid-Trafo: µl TS µl LB 100 µl µl µl LB 100 µl 2 Negativkontrolle µl 1 Bakteriensuspension/-verdünnung kurz vortexen (5 sec.), 100 µl auf entsprechende Platte überführen, Deckel schließen, zur Verteilung der Suspension Platte schütteln bis die Flüssigkeit gleichmäßig verteilt ist.; darauf achten, dass die Kugeln sich über die gesamte Fläche der Platte bewegen; Plattiert wird nur auf LB amp -Platten (pgex-trafo) oder nur auf LB kan -Platten (pet-acid- Trafo)!! Platten ca. fünf min ruhen lassen, kurz schütteln und Glasperlen in Becherglas abschütten (Glasperlen im Autoklaviermüll entsorgen). Platten beim Betreuer abgeben (werden über Nacht bei 37 C inkubiert) Auswertung der Transformationseffizienz durch Auszählen der Platten und Eintragen der Ergebnisse in Tabelle (Moodle). 25

28 Polymerase Kettenreaktion - PCR Die Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Methode mit der DNA-Fragmente schnell und einfach von einer sehr geringen Menge Ausgangsmaterial ausgehend spezifisch vermehrt werden können. Dazu kopiert die Methode auf einfache Weise in vitro (im Reagenzglas ) die Art und Weise nach der in vivo (in der Zelle) DNA repliziert d.h. vermehrt wird. Möglich wurde die Methode durch die Entdeckung einer DNA-Polymerase aus einem thermophilen Organismus (Thermus aquaticus), die Temperaturen von bis zu 100 C ausgesetzt werden kann ohne dabei an Funktionalität zu verlieren. Ausgangspunkt einer PCR Reaktion kann jede DNA aus einer beliebigen Quelle sein. Da DNA- Polymerasen Primer benötigen, von denen aus sie die Neusynthese des DNA-Stranges beginnen können, muss die Sequenz des gewünschten DNA-Fragments bekannt sein. Die Primer müssen komplementär zu den Enden des Zielfragments sein. Template-DNA, Primer und Taq-Polymerase werden zusammen mit dntps in einem speziellen Puffer gemischt und auf C erhitzt. Dabei trennt sich die doppelsträngige Template-DNA in ihre beiden Einzelstränge auf. Beim Abkühlen auf die Annealing Temperatur binden die Primer an ihre komplementären Stellen an die Einzelstränge. Da die Primer in deutlich höherer Konzentration im Ansatz vorliegen als die Template-DNA ist dieser Schritt einer Rehybridisierung der Template-DNA Einzelstränge bevorzugt. Die Taq-Polymerase bindet an das kurze Primer-Template Doppelstrang DNA Stück. Wird die Temperatur dann auf die optimale Reaktionstemperatur der Taq-Polymerase (72 C) erhöht beginnt diese mit der Neusynthese des komplementären Strangs. Der Zyklus aus Erhitzen zur Trennung der Doppelstrang-DNA, Abkühlen für das Primer- Annealing und Erwärmen auf 72 C wird in PCR-Maschinen nach vorgegebener Programmierung mal wiederholt. Ob und wie gut das gewünschte DNA-Fragment amplifiziert wird hängt von verschiedenen Faktoren ab. Neben der Basenzusammensetzung und Länge der Primer, der Länge und Kopienzahl des Templates beeinflussen auch die Annealing-Temperatur und die Pufferzusammensetzung die Spezifität und Effizienz einer PCR-Reaktion. Daher müssen PCR- Reaktionen oftmals optimiert werden. Im Praktikum werden Sie zwei Parameter variieren, um die optimalen Bedingungen einer PCR- Reaktion zu finden. Zum einen werden Sie die PCR bei verschiedenen Primer Annealing- Temperaturen durchführen. Dazu werden wir eine Gradienten-PCR-Maschine verwenden, in der verschiedene Annealingtemperaturen gleichzeitig getestet werden können. Außerdem werden Sie die PCR-Reaktion mit zwei verschiedenen Mg 2+ -Ionen Konzentrationen durchführen. Mg 2+ -Ionen schirmen die negativen Ladungen im Phophat-Rückrat der DNA ab und fördern dadurch die Ausbildung doppelsträngiger DNA. Sie werden somit testen bei welcher Annealing-Temperatur und welcher Mg 2+ -Ionen Konzentration Spezifität und Effizienz der PCR-Reaktion optimal sind. Als zweites PCR-Experiment werden Sie ein spezifisches Fragment von Ihrer Hefe-DNA, die Sie selbst isoliert haben, amplifizieren. Hier werden in verschiedenen Kontroll-Ansätzen einzelne Komponenten der PCR weggelassen, um so Ihre Wichtigkeit zu testen. Bitte auch Theorieteil zur DNA-Analytik lesen! 26