Identifizierung und Bioverfügbarkeit gesundheitsfördernder Lebensmittelinhaltsstoffe

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1 Identifizierung und Bioverfügbarkeit gesundheitsfördernder Lebensmittelinhaltsstoffe Univ. Prof. Dr. Doris Marko Institut für Lebensmittelchemie und Toxikologie Universität Wien

2 Anthocyane Vorkommen wichtigste Gruppe wasserlöslicher Farbpigmente in Pflanzen charakteristische Rot- bis Blaufärbung von vielen Früchten, Gemüse und Blüten Lebensmittel Anthocyangehalt [mg/100 g] Cranberry Himbeere Holunderbeere Johannisbeere Kulturheidelbeere Rotkraut Rotwein 67 5 Wildheidelbeere Prior et al., 2001; 2 Wu et al., 2006; 3 Wu et al., 2004; 4 Latti et al., 2008; 5 Nymann et al., 2001

3 Anthocyane Struktur Gruppe strukturell eng verwandter Substanzen, Untergruppe der Flavanoide Grundstruktur ist das Anthocyanidin Unterschiede im Substitutionsmuster des B-Rings Konjugation mit Zuckerresten Anthocyane Anthocyanidin Anthocyanidin -R 1 -R 2 Pelargonidin -H -H Cyanidin -OH -H Delphinidin -OH -OH Petunidin -OCH 3 -OH Peonidin -OCH 3 -H Malvidin -OCH 3 -OCH 3 Cyanidin-3-Glucosid

4 Anthocyane Assoziiert mit einer Reihe biologischer Wirkungen Antioxidative Wirkung Antiinflammativ Chemopräventiv in Modellen der Kolonkanzerogenese

5 Kanzerogenese Langsamer Prozess, oft über Jahre 3 Stufen: Initierung (DNA-Mutation) Promotion (fördernde Effekte) 3-Stufenmodel am kolorektalen Adenokarzinom Progression (Anhäufung weiterer Mutationen) modifiziert nach Shiff und Rigas, 1999

6 Chemoprävention Anzahl der Adenome P=0,09 * P=0,04 Kontrolle 0,03% 0,1% 0,3% P=0,12 ** P<0,001 Fütterungsstudie im Apc Min -Mausmodell mit anthocyanreichem Extrakt Mirtoselect und Cy- 3-glc in jeweils unterschiedlichen Konzentrationen nach 12 Wochen Tötung der Tiere (n=16 pro Gruppe) und Bestimmung der Anzahl an GIT- Adenomen Dosisabhängige Reduktion der Adenome weist auf chemopräventives Potential von Anthocyanidinen/Anthocyanen hin 10 0 Mirtoselect Cy-3-glc modifiziert nach Cooke et al., 2006

7 MAPK*-Signalweg EGFR: Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor Signalweg in Tumoren häufig entartet Target in Tumortherapie EGFR wird durch Flavonoide gehemmt Ermittlung der Proteinmenge von EGFR und pegfr mittels SDS-PAGE und anschließendem Western-Blot mit Immunodetektion Zellwachstum Apoptose Tumorgenese Metastasierung * MAPK: Mitogenaktivierte Proteinkinase

8 Anthocyanidine Western Blot HT29 Cyanidin 1 µm Tyrphostin, 45 min Inkubation, 0% FKS, 100 U/ml Katalase, 15 min EGF-Stimulation n= 4 rel. Proteinkonzentration T/C [%] EGFR pegfr *** *** *** *** *** DMSO 1 µm Cy 10 µm Cy 50 µm Cy 100 µm Cy Konzentration [µg/ml] 200 µm Cy 1 µm Tyr Anthocyanidine mit vicinalen Hydroxygruppen am B-Ring stellen Hemmstoffe von Rezeptortyrosinkinasen dar Meiers, S., et al., J Agric Food Chem, (2): p

9 Anthocyane Western Blot HT29 Cyanidin-3-glucosid 1 µm Tyrphostin, 45 min Inkubation, 0% FKS, 100 U/ml Katalase, 15 min EGF-Stimulation n= 5 rel. Proteinkonzentration T/C [%] ** EGFR pegfr * ** 0 *** DMSO 10 Cy-3-glc 50 Cy-3-glc 100 Cy-3-glc 200 Cy-3-glc 1 µm Tyr Konzentration [µg/ml] Anthocyane sind als intakte Verbindung am EGFR inaktiv Teller, N., et al., Mol Nutr Food Res, (9): p

10 Heidelbeerextrakt Untersuchung des Einfluss auf den EGFR in der intakten Zelle 140 EGFR pegfr T/C [%] * *** pegfr EGFR a-tubulin Mirtocyan [µg/ml] T K K T K T T Mirtocyan [µg/ml] Setzt man einen komplexen Heidelbeerextrakt ein, wird in Zellkultur die Phosphorylierung des Rezeptors gehemmt Teller, N., et al., J Agric Food Chem, (8): p

11 Wirkung in vivo Tierstudie mit Heidelbeerextrakt und isoliertem Aglykon Cyanidin Mirtocyan (0,3 %) und Cyanidin (0,1 %) im Apc Min -Mausmodell, 4 Wochen Modell der humanen Kolonkanzerogenese Untersuchung von chemopräventiven Effekten Nachgeschaltete Signalelemente innerhalb der MAPK-Kaskade ERK und perk 140 Dünndarm-Adenome ERK perk Signifikante Verringerung von perk durch T/C [%] * Mirtocyan Schwächere Hemmung durch Cyanidin 40 *** 20 0 Kontrolle Mirtocyan Cyanidin Cai, H., et al., Eur J Cancer, (4): p

12 Bioaktive Verbindung? Aglykon Potent Kaum im nativen Lebensmittel vorhanden Stabilität abhängig von ph Anthocyanreiche Beerenextrakte Hemmen in Zellkultur tumorrelevante Signalkaskaden Kaum Aktivität in der Anthocyanfraktion Vorgänge im Verdauungstrakt??

13 Anthocyane Bioverfügbarkeit Für die Bioaktivität eines Stoffes in vivo ist Bioverfügbarkeit von entscheidender Bedeutung Polyphenol muss nach oraler Aufnahme in entsprechendem Maße resorbiert werden und systemisch, beziehungsweise am Wirkort, vorliegen Anthocyan-Bioverfügbarkeit in Humanstudien meist unter 0,1 % [Netzel et al., 2001; Wu et al., 2002; Manach et al., 2005; McGhie und Walton, 2007]

14 In vivo Applikation von Delphinidin Verabreichung von Del im Rattenmodell (MT450) für 21 Tage Problem: Verabreicht man Delphinidin als Reinsubstanz an tumortragende Ratten nimmt das Tumorwachstum/-volumen zu Dieser Effekt wird nicht bei Gabe von Gallussäure, dem zu erwartenden Abbauprodukt, beobachtet. Der tumorwachstumsfördernde Effekt ist bereits bei oraler Gabe zu sehen, ist jedoch ausgeprägter bei peritumoraler Verabreichung Mechanismus bislang ungeklärt Thiele et al., Carcinogenesis, 2013 epub ahead of print

15 Antioxidative Wirkung von Anthocyanen?

16 Nrf2/ARE-Signalweg 26S- Proteasom proteasomaler Abbau Schutzsystem vor zellulärem oxidativen Stress Induziert Expression von Phase II- Metabolismusenzymen Reagiert auf ROS (Reaktive Sauerstoffspezies) oder spezifische Aktivatoren (exo- und endogen) Modifiziert nach Kansanen et al., 2012

17 Humanstudie* Studiendesign zwei Kollektive: Kontroll- und Ileostomie-Probanden (jeweils 5 Frauen) 48 h Washout -Phase orale Aufnahme von 10 g Heidelbeerextrakt (HBE) (ca. 3 g Anthocyane) Entnahme von Blutproben nach 0, 1, 2, 4 und 8 h Isolierung von PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) aus Blutproben Bestimmung der Transkription Nrf2/ARE-regulierter Gene in PBMCs mittels qpcr *in Kooperation mit AG Richling, Technische Universität Kaiserslautern und AG Mäder, Universitätsklinikum Würzburg

18 Modulation der Transkription in vivo rel. Transkriptmenge [%] HO-1 NQO1 Nrf2 HBE - Kontrollprobanden *** * *** * *** *** * *** * ** ** rel. Transkriptmenge [%] HO-1 NQO1 Nrf2 HBE - Ileostomie-Probanden *** * * Zeit nach Intervention [h] Zeit nach Intervention [h] Heidelbeerextrakt; signifikante Modulationen der Gentranskription Suppression der HO-1- sowie Induktion der NQO1-Transkription in Kontrollgruppe Keine Modulation dieser Gene in Ileostomie-Probanden Kolon scheint eine Rolle bei der Aufnahme zu spielen Verlust der Bioaktivität im untersuchten Zeitfenster durch Verkapselung Suppression der Nrf2-Transkription in beiden Gruppen Kropat, C., et al., Mol Nutr Food Res 57,

19 Nrf2-Aktivierung in vitro Luciferase-Reportergenassay schnelle Bestimmung der Nrf2-Aktivität in vitro in transfizierten CHO-Zellen Aktivator

20 Nrf2-Aktivierung in vitro Luciferase-Reportergenassay CDDO-Imidazolid CDDO-Imidazolid potenter Nrf2-Induktor Positivkontrolle HBE besitzt keinen aktivierenden Effekt auf Nrf2 Einzelsubstanzen Cy-3-glc (Anthocyan) und Cyanidin (Aglycon) ebenfalls kein Effekt PCA (Protocatechusäure), GA (Gallussäure), SA (Syringasäure) (in vitro- sowie intestinale Abbauprodukte) ineffektiv PGA (gebildet nur durch intestinalen Anthocyanabbau) aktiviert Nrf2 Kropat, C., et al., Mol Nutr Food Res 57, PCA PGA Nrf2-Luciferase-Reportergenassay CHO-Zellen (Hamster-Ovarienzellen) 10 % FKS 100 U/ml Katalase 20 h Inkubation n = 3-4

21 Kropat, C., et al., Mol Nutr Food Res 57, Modulation der Transkription in vitro Transkription Nrf2/ARE-regulierter Gene in HT29 tbhq Bestimmung der Gen-Transkription für HO-1, NQO1 und Nrf2 in HT29-Zellen nach Inkubation ausgewählter HBE-Inhaltsstoffe und -Abbauprodukte gleiches Muster wie in Nrf2-Reportergenassay potente Induktion von HO-1 und Nrf2 durch PGA. Andere Inhaltsstoffe und Abbauprodukte sind inaktiv PGA ist reaktiv und könnte mit Sulfhydrylgruppen von Keap1 interagieren qpcr-transkriptions-analyse HT29-Zellen (Kolonkarzinom) 10 % FKS 100 U/ml Katalase 20 h Inkubation n = 2-4

22 Zusammenfassung Nrf2 für die Induktion Nrf2/ARE-abhängiger Gene scheint der Kolon eine wichtige Rolle zu spielen, während dieser für die Unterdrückung der Nrf2-Transkription nicht relevant zu sein scheint Anthocyanidinabbau zu PGA durch intestinale Mikroflora im Kolon PGA ist reaktionsfreudig und könnte durch Reaktion mit Sulfhydryl-Gruppen die Bindung von Keap1 und Nrf2 beeinflussen Nach Verkapselung des HBE Verlust der Bioaktivität vergleichbar mit in vitro- Untersuchungen offene Frage: Verlauf der Genmodulation bei längerer Gabe

23 Take home Bioaktivität anthocyanreicher Extrakte Vielzahl von Daten für Einzelverbindungen in vitro Ungeklärte Stimulation des Tumorwachstums durch Delphinidingabe im Tierversuch erfordert weitere Studien Wesentlicher Beitrag des Kolons zur Wirkung auf Nrf2- abhängige chemopräventive Enzymsysteme Langzeiteffekte nicht bekannt

24 Thanks Universität Wien Dr. Gudrun Pahlke Dr. Ute Hassmann Dr. Nicole Teller Christopher Kropat Christine Tiessen Simone Bächler Volker Blust Helge Gehrke Joanna Pelka Nadine Volz Swantje Winkler University of Leicester Andreas Gescher TU Kaiserslautern Prof. Dr. Elke Richling Dr. Melanie Esselen Dr. Michael Habermeyer Universität Mannheim Prof. Dr. Jonathan Sleeman KIT Dr. Wilko Thiele 25

25 Dank