Selektivität in der GLC. Trennung bei unterschiedlicher Löslichkeit in der stationären Phase

Transkript

1 Selektivität in der GLC Trennung bei unterschiedlicher Löslichkeit in der stationären Phase a K2 k' 2 = = = K k' 1 1 t' t' R( 2) R( 1) Da K ~ 1 / (p f) mit K Verteilungskonstante p Dampfdruck f Aktivitätskoeffizient ergibt sich für das Retentionsverhältnis zweier Verbindungen 1 und 2 : t log log ' R( 2) p1 α = = log + t' p R( 1) ( HERINGTONsche Trennformel) 2 log f f 1 2 Stationäre Phase unpolar polar Trennung nach Dampfdruck (Siedepunkt) Polarität und Dampfdruck ( gleichsinnige oder gegenläufige Überlagerung)

2 Trennung in der Gaschromatographie unpolare stationäre Phase z.b. Poly(dimethyl)siloxan Trennung nach dem Dampfdruck (Siedepunkt) t R ~ 1/p polare stationäre Phasen z.b. Polyethylenglycol (Carbowax) HOCH CH [ O CH CH ] OH n Trennung nach Polarität und Dampfdruck t R ~ 1/ (p f) geometrieselektive stationäre Phasen z.b. Benton 34, GTCB, Cyclodextrine Trennung nach der Molekülgeometrie

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4 Struktur der "-, $- und (-Cyclodextrine

5 Säulenpolarität und Elutionsreihenfolge Trennung von Benzol und Cyclohexan Kp 80,1 C 80,6 C Stationäre Phase Polysiloxan PEG 100% Methyl 5% Phenyl 7%Ph/ 7% CP OV-1 SB-5 OV-1701 CW20M

6 Säulenpolarität und Elutionsreihenfolge Unpolare stationäre Phase: - Squalan - Methylsilicon ( OV-1) Polare stationäre Phase: - Polysiloxan mit 7 % Phenyl und 7% Cyanopropyl (OV 1701) - Polyethylenglykol (PEG, Wax) Substanz Kp//C unpol. SP pol. SP Benzol Cyclohexan C 6 H 6 80,1 C 6 H 12 80,6 1. Peak 2. Peak* 2 1 Ethanol 2,2 Dimethylpentan Benzol C 2 H 5 OH C 7 H 16 C 6 H 6 78,5 79,0 80, Chloroform Tetrachlormethan CHCl 3 61,2 CCl 4 76, Methanol Essigsäuremethylester Diethylether CH 3 OH CH 3 COOCH 3 C 2 H 5 OC 2 H *) mit unpolarer SP ist hohe Trennstufenzahl erforderlich

7 Flüssige stationäre Phase (SP) Anforderungen hochsiedende Flüssigkeit gute Benetzung der Oberfläche uniformer, stabiler Film chemisch inert, thermisch stabil unterschiedliches Lösevermögen für trennende Stoffe unpolare stationäre Phase gute Löslichkeit für unpolare Verbindungen K hohe Retention und Probekapazität Trennung nach Dampfdruck (Siedepunkten) Geringe Löslichkeit für polare Verbindungen K geringe Retention, Fronting steigende Polarität der stationären Phase K sinkt Retention von unpolaren Verbindungen K steigt Retention von polaren Verbindungen über 80% der Trennungen lassen sich an wenigen Standardphasen realisieren K Vielzahl unterschiedlicher Handelsnamen für weitgehend identische Materialien K Phasen mit speziellen (maßgeschneiderten) Selektivitäten für bestimmte Trennaufgaben ( PCB s, Dioxine usw.) aber ohne Angabe der chemischen Zusammensetzung

8 Flüssige stationäre Phase Polysiloxan-Gerüst * * &O&Si&O&Si&O& * * Anteil an Bezeichnung 2) Methyl Phenyl CP 1) TFP 2) ;100; ,50, ; ; 275 1) CP Cyanopropyl 2) TFP Trifluoropropyl In den modernern Polysiloxanphasen sind die funktionellen Gruppen symmetrisch an ein Siliziumatom gebunden (z.b. Diphenyl, Biscyanopropyl) 3.) In Verbindung mit der betreffenden Firmenbezeichnung (z.b. OV-1, DB-5)

9 Firmenbezeichnung für stationäre Phasen Hersteller von stat. Phasen oder Kapillarsäulen Siloxane Kodierung PEG Agilent Technologies 1. Hewlett Packard 2. J&W HP DB Ultra DB-XLB HP- 20 M InnoWax DB-Wax Alltech AT, Heliflex AT-Wax General Elektric Macherey-Nagel SE,XE MN, Optima Permabond CW 20M Nordion NB NB-20M Ohio Valley OV Carbowax 20M Phenomenex ZB (Zebron) ZB-Wax Quadrex CW Restek Rtx MXT Stabilwax SGE BP,BPX, HT BP 20 Supelco SPB Meridian (MDN) Supelcowax Omegawax Varian (Chrompack) CP SIL CB CP Wax CB

10 Fettsäuremethylester (FAME)

11 Qualitative Analyse Identifizierung der getrennten Komponenten Ziele der Identifizierung Wiedererkennung ( Wiederfindung, recognition) von Verbindungen zielgerichtete Suche nach ausgewählten Verbindungen in der Probe (target analysis) Prüfung auf An-/Abwesenheit, Grenzwertkontrolle Vergleich der Retentionswerte mit Referenzverbindungen Strukturaufklärung unbekannter Verbindungen Strukturaufklärung der Inhaltsstoffe in unbekannten Proben (non-target analysis) Kopplung mit spektroskopischen Methoden Feststellung der Identität oder Ähnlichkeit komplexer Gemische Vergleich der Peakmuster (Position und Intensität der Peaks) ohne Identifizierung der Einzelverbindungen ( Fingerprint-Analyse ) Erkennung der biologischen Aktivität Einbeziehung von Wirkungstests z.b. Enzymreaktionen

12 Identifizierung einzelner Komponenten mittels GC Vergleich von Retentionswerten Addition von Vergleichssubstanzen bzw. Retentionszeitvergleich Vergleich der gemessenen mit tabellierten Retentionswerten Relative Retention Retentionsindices (isotherm, temperaturprogrammiert) Struktur-Retentions-Beziehungen Ableitung von Retentionsinkrementen Vorhersage der Elutionsreihenfolge Abschätzung von Retentionswerten Selektive Detektion Elementspezifische Detektoren Reaktionen vor bzw. nach der Säule Derivatisierung (pre-column, post-column) selektive Abbaureaktionen Kopplungstechniken Direkte Kopplung der GC ( on-line coupling ) mit spektroskopischen Methoden Fouriertransform-Infrarotspektroskopie (GC-FTIR) Atomemissionsspektroskopie (GC-AES) Massenspektrometrie (GC-MS)

13 Retentionsdaten zur Identifizierung Retentionszeiten t R Aufenthaltszeit in der stationären Phase K Systemeigenschaft (Verteilungsgleichgewicht) Struktur der Substanz Struktur der stationären Phase Säulentemperatur K Hängt auch von Säulenparametern und Messbedingungen ab K Eignet sich zur Charakterisierung der Substanz nur wenn folgende Parameter konstant gehalten werden: Art und Menge der stationären Phase Säulentemperatur Länge und ID der Säule Filmdicke Art (Viskosität) des Trägergases Vordruck und Gasfluss K Vergleich der Analysenergebnisse sehr schwierig

14 Absolute Retentionswerte Eliminierung verschiedener Einflussgrößen Bezug auf standardisierte Bedingungen Spezifisches Retentionsvolumen V g T bei Säulentemperatur T V ( t t ) j F w T g = R M c L [ml/g] (isotherme GC) j Kompressibilitäts-Korrekturfaktor (abhängig von p i /p 0 ) p i, p 0 Säuleneingangs- und Säulenausgangsdruck (absolut) F Gasfluss am Säulenausgang bei Säulentemperatur T Masse der (wirksamen) stationären Phase in der Säule w L GSC: absolutes Retentionsvolumen V s V s = V g /s s: spezifische Oberfläche Relative Retentionswerte Bezug der Retention auf Standardsubstanzen (identische chromatographische Bedigungen) r = t t R( i) R( St ) Relative Retentionswerte lassen sich einfacher und reproduzierbarer bestimmen als absolute Retentionswerte Unterschiedliche Referenzsubstanzen möglich z.b. Retentionsindexkonzept nach Kovats

15 Quantitative Analyse Hängt von der Art des Chromatogramms ab 1. Inneres Chromatogramm Dünnschicht- und Papierchromatographie Auswertung: photometrisch, fluorimetrisch, radiometrisch auf der Trennstrecke oder nach der Elution der Substanz A. Vergleichsmethode Fleckengröße ermitteln halbquantitative Bestimmungsmethode lineare Beziehung: F = a log M + b F: Fleckenfläche M: aufgetragene Substanzmenge a,b individuelle Konstanten (abhängig vom chromat. System) < Vergleich bzw. Interpolation mit Werten bekannter Substanzmengen B. Optische und radiometrische Methoden kontinuierliche Messung der Absorption, Fluoreszenz oder Radioaktivität in Abhängigkeit vom Ort z.b. Platte an einer Photozelle vorbeiführen höchste Konzentration im Flecken-Mittelpunkt, am Rand die geringste innere Chromatogramme werden dadurch wie äußere Chromatogramme mit Verteilungsbanden dargestellt

16 Photometrische Messungen Transmissionsmessungen: entspricht einer photometrischen Messung in Lösung aber: Sorbensschicht streut Messlicht daher: Lambert-Beersches Gesetz nicht gültig K Eichkurve erstellen Remissionsmessungen: Veränderung der diffusen Lichtstreuung (Remission) auf dem Plattengrund durch Substanzflecken durch Absorption Erfasst werden können: gefärbte Substanzen Substanzen, die die Untergrundfluoreszenz des Trägermaterials schwächen Substanzen mit Eigenfluoreszenz Substanzen die mit geeigneten Reagenzien in gefärbte oder fluoreszierende Derivate überführt werden können radioaktiv-markierte Verbindungen C. Bestimmung nach der Elution Substanzen mit UV-Licht detektiert Spot auskratzen und Probe herauslösen Quantitative Analyse mit beliebigen Methoden möglich sehr genaue Ergebnisse

17 Äußeres Chromatogramm Peakfläche ~ Menge einer Komponente Ermittlung der Peakfläche Umrechnung der Peakfläche in eine Konzentration Vermeidung bzw. Minimierung der Fehlerquellen in allen Arbeitsschritten einer Analyse: Probenahme, Probenvorbereitung, Dosierung, Trennung, Auswertung Ermittlung der Peakfläche Fläche unter der Gauss-Kurve kann durch Integration der berechnet werden: F = h 2π σ mit w h = σ 2 2ln2 1. Näherungsmethode Höhe mal Breite in halber Höhe Grundlage: näherungsweise Ausmessung der Gauss-Kurve durch ein Dreieck Berechnete Fläche.6% kleiner als die korrekte Fläche F = h w h 1, 0632

18 2. Näherungsmethode: Höhe mal Gesamtretentionszeit t R Grundlage: Zwischen der Gesamtretentionszeit t R und und der Peakbreite in halber Höhe wh besteht ein fast linearer Zusammenhang t R = a b 0,5 Konstante a nimmt mit zunehmender RT zu gut geeignet für dicht nebeneinander liegende Peaks ungenügend getrennte Peaks 3. Methode nach Condal-Bosch Zur Auswertung unsymmetrischer Peaks und bei starkem Tailing FII = h ( w0, 15 + w0, 85) 2 Gauss: F I =h w h Beispiel h = 60 mm w h = 21 mm w 0,15 = 41 mm w 0,85 = 10 mm F I = 1260 mm²; F II = 1530 mm² 90er Jahre: heute: Integrator Computer

19 Reproduzierbarkeit der Auswertung Chromatographie relative Standardabweichung Gas-Chromatographie 0,1% Dünnschicht-Chromatographie a) Elution 2-5% b) photometrisch: Absorption 1-3% Fluoreszenz 1-2% Säulen-Chromatographie (HPLC) 0,2-0,5 %

20 Standardsubstanzen Externer Standard Herstellung von Kalibrierlösung mit der zu bestimmenden Substanz Chromatographie der zu bestimmenden Substanz in verschiedenen Mengen Ermittlung eines Kalibrierfaktors bzw. einer Kalibriergerade Analyse der Probe unter gleichen experimentellen Bedingungen Interner Standard Definierte Zugabe eines internen Standards zur Probe- und Kalibrierlösung Standardsubstanz darf nicht in der Probe enthalten sein Chromatographie von Standard und Probe Vergleich von Signalverhältnis und Mengenverhältnis Standardaddition Chromatographie der Probe Definierte Zugabe einer bekannten Menge der zu bestimmenden Substanz der Probe Analyse und Vergleich der Peakfläche mit der Substanzmenge Abhängigkeit des Detektorsignals von Stoffeigenschaften beachten (linearer Messbereich)

21 Getreide-Fettsäuremethylester-Mischung

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23 Kapillar-Säulen 1. Dünnfilm-Kapillare 2. Dünnschicht-Kapillare gepackte Säule Dünnfilm Kapillarsäule innerer Durchmesser 1-10 mm 0,1-1 mm Länge 1-10 m m Länge bei gleichem Druckabfall 1,8 m 120 m Dünnschicht lineare Geschwindigkeit 6,8 cm/s 9,1 cm/s 13,5 cm/s Vergleich der k-werte Auflösung* 1,53 6,70 3,92 Analysenzeit* 30,2 min 29,1 min 15,5 min Trennstufenzahl < Trennstufenhöhe* 0,71 mm 0,46 mm 0,55 mm Belastbarkeit < 10 :l 1 nl nl * für das Stoffpaar Methyloleat/Methylstearat

24 Retentionsindex I Retentionsindex (nach Kovats) tra log try I = 100 ( y x) + 100x try log t Rx x und y: C-Zahlen von n-alkanen mit kürzerer und längerer Retentionszeit als die Substanz A Für den Retentionsindex nach Kovats gelten vier Regeln 1. Retentionsindices setzen sich für beliebige Moleküle additiv aus den Inkrementen für funktionelle Gruppen und für die Art der Bindung zusammen (je CH 2 -Gruppe: Zunahme um 100). 2. Bei Unterschieden in den Siedepunkten zweier Isomerer ist der Unterschied zwischen ihren Retentionsindices an einer apolaren stationären Phase fünfmal der Siedepunktsdifferenz. 3. Retentionsindex einer apolaren Verbindung bleibt für beliebige stationäre Phasen nahezu konstant. 4. Funktionelle Gruppen und andere Bindungen als Einfachbindungen gehen in Form von Indexinkrementen in den Retentionsindex ein. Erlaubt keine Angaben über die Trennbarkeit von Substanzen

25 Voraussage der Trennmöglichkeit Für die Selektivität sind folgende vier Kräfte von Bedeutung: 1. London-Kräfte zwischenmolekulare Kräfte zwischen zwei nicht polaren Stoffen 2. Kesson-Kräfte Orientierungskräfte aus dem Zusammenwirken permanenter Dipole (z.b. H-Brückenbindung) 3. Debye-Kräfte induzierte Dipole 4. Chemische Bindungskräfte z.b. charge-transfer-komplexbindungen Mit zunehmender Summe aller dieser Kräfte nimmt auch die Retentionszeit eines Stoffes zu Berücksichtigung dieser Kräfte liegt den Rohrschneider- Konstanten zugrunde: zur Charakterisierung gas-chromatographischer Trennflüssigkeiten zur Vorausberechnung von Retentionsdaten beliebiger Stoffe auf beliebigen Trennflüssigkeiten

26 Verfahren nach Rohrschneider erlaubt die Charakterisierung von Trennflüssigkeiten ermöglicht die Berechnung von Retentionsdaten beliebiger Stoffe auf beliebigen Trennflüssigkeiten Grundlagen Additivität zwischenmolekularer Kräfte Angabe der Retentionswerte in Form von Retentionsindex- Differenzen Beziehung aller Werte auf eine unpolare Standardsäule Standardsubstanzen Benzol, Ethanol, Butanon, Nitromethan und Pyridin Betrachtet wird die Retentionsindexdifferenz )I (Bezug auf unpolare Trennflüssigkeit) substanzspezifische Konstanten a (Benzol), b (Ethanol), c (Butanon), d (Nitromethan) und e (Pyridin) jede Substanz und jede Trennflüssigkeit durch 5 Konstanten charakterisiert )I RX = a RX x p + b RX y p + c RX z p + d RX u p + e RX s p x,y,z,u,s Rohrschneider-Konstanten, säulen(trennflüssigkeits)-spezifische Faktoren Definition Die jeweiligen Konstanten der Standardsubstanzen werden für jede stationäre Flüssigkeit gleich 100 gesetzt (z.b. )I für Benzol für jede gleich 100 x p )

27 Rohrschneider-Konstanten: Praktisches Beispiel Problem: Trennung von 1- und 2-Propanol Welches ist die beste Trennflüssigkeit? Stoffspezifische Konstanten Konstanten a b c d e 1-Propanol -9,42 106,26 0,25 6,63-7,49 2-Propanol -18,15 95,89 15,76-6,53 2,09 Rohrschneider-Konstanten x y z u s 1. Polyphenylether a 1,75 2,27 2,34 3,26 2,84 2. Quadrol b 2,00 5,62 3,47 4,94 4,15 3. O-(2-Cyanethyl)-sucrose 5,40 8,71 7,34 10,4 8 8,69 4. Silicon XE-60 2,08 3,85 3,62 5,13 3,45 a Bis(4-phenoxyphenoxy)benzol, b N,N,N,N -Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylendiamin Trennflüssigkeiten Propanol 207,4 533,7 852,4 362,2 1-Propanol 223,4 575,3 872,4 394,7 Differenz 16,0 41,6 19,6 32,5 K Optimale Trennung mit Quadrol

28 Gas-Fest-Chromatographie (GSC) (gas-solid-chromatography; Adsorptions-GC) Adsorbentien Kohlenstoffadsorbentien < Graphitierte Ruße < Kohlenstoff-Molekularsiebe Aluminiumoxid Zeolithe Poröse organische Poymere < Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymere Oberflächenmodifizierte Adsorbentien (GLSC) Säulen gepackte Säulen Dünnschicht-Kapillarsäulen (PLOT-Säulen, porous layer open tubular) Besonderheiten geringe Substanzbelastbarkeit T Säule > Siedepunkt Anwendungen Analyse von Gasen, leichtflüchtigen und niedermolekularen Verbindungen Isomerentrennung Spurenanalyse

29 Typische GC-Kapillarsäulen WCOT wall-coated open tubular (column) dünner Film auf der Innenwand SCOT support-coated open tubular (column) inertes Trägermaterial das mit stationärer Phase imprägniert ist höherer Anteil an stationärer Phase daher höhere Probenkapazität aber niedrigere Effizienz as WCOT und höhere Effizienz als gepackte Säule FSOT Fused silica open tubular (column) Quarzkapillare Außenwand mit Polyimid-Beschichtung sehr flexibel, können als Spule eingesetzt werden typischer ID von 320 oder 200 :m

30 Stationäre Phase PLOT-Säulen Dünne Schicht eines feinkörnigen Adsorbens an der Innenwand Molekularsieb 4,5, 10 oder 13 Å (Ionenaustauscher) Aluminiumoxid (nach Desaktivierung mit KCI oder Na 2 SO 4 ) Kohlenstoff-Molekularsieb Poröse Polymere, z.b. Copolymere aus Styrol - Divinylbenzol (DVB) DVB - Vinylpyridin DVB - Ethylenglycol - Dimethacrylat Dimensionen Länge 5 bis 50 m Innendurchmesser 530, 320 oder 250 :m Schichtdicke 5 bis 50 :m Partikeldurchmesser < 1:m Material Fused Silica (FS) oder Metall Anwendungen Permanentgase, anorganische und organische Gase Leichtflüchtige Kohlenwasserstoffe ( C 1 -C 10 ) Leichtflüchtige polare organische Verbindungen (Alkohole, Glykole, Alkylamine) Besonderheiten Trennung an Al 2 O 3 wird stark durch Feuchtigkeit beeinflusst (Retentionszeitverschiebungen) Überladung zeigt sich durch Tailing (WCOT: Fronting) Partikelfalle zur Vermeidung von Detektor-Störungen (Verstopfungen, Spikes) infolge abgelöster Partikel: kurze Nachsäule mit niedrigviskoser flüssiger Polymerphase

31 Molekularsiebe Beispiel: 2 m lange mit 5 Å-Material gepackte Säule Gemisch aus Helium, Sauerstoff, Stickstoff, Methan und Kohlenmonoxid wird in dieser Reihenfolge getrennt Moleküle, die kleiner sind dringen in das Innere der Partikel ein, wo dann die Adsorption stattfindet Typische GC-Trennungen an festen Phasen a: 1,5 m lang, ID = 0,3 cm, Molekularsieb b: 30 m lang, ID = 0,53 mm

32 Säulentemperatur und Retention Temperaturabhängigkeit des Retentionsfaktors k HV a ln k = + C' lnβ = ln β + C' RT T c )H V Molare Verdampfungswärme T C Säulentemperatur R Gaskonstante $ Phasenverhältnis C,a Konstanten c Anwendung der Trouton schen Regel H T b V = const. = E t T b Siedetemperatur der Substanz (in K) E t Trouton sche Konstante (Molare Verdampfungsentropie: J/mol) Welche Temperaturerhöhung ist zur Halbierung von k erforderlich? T TR = ln2 E t )T K Eine Erhöhung der Säulentemperatur um /C bewirkt eine Halbierung von k

33 Isotherm (T C = const.) Säulentemperatur T C für Gemische mit nicht zu großem Siedebereich ()K P <100 K) GLC: T C < K P der Komponenten Ausnahme: Säulen mit sehr dicken Filme In t R ~ 1/T C K Optimierung zw. Analysezeit und Auflösung GSC: T C > K P der Komponenten Temperaturprogrammierte GC (TPGC) für Gemische mit großem Siedebereich ()K p > 100 K) ist isotherme GC nicht zur Trennung aller Komponenten geeignet: Entweder nur Trennung der niedrigsiedenden oder der hochsiedenden Komponenten K Dosierung der Probe bei niedriger Säulentemperatur T 0 ( gute Auflösung der niedrigsiedenden Komponenten) K anschließend Erhöhung der Säulentemperatur meist lineares Temperaturprogramm Retentions- oder Elutionstemperatur T t T t = T 0 + r t r t Heizrate Aufheizzeit

34 Säulentemperatur in der GC Isotherme GC (konstante Säulentemperatur) Geeignet für Gemische mit nicht zu großem Siedebereich ()Kp < 100 K) Gemische mit großem Siedebereich Trennung aller Komponenten mit Isothermer GC nicht möglich Niedrige Säulentemperatur gute Trennung der niedrigsiedenden Komponenten aber hohe Retentionszeiten und breite Peaks für höhersiedende Komponenten

35 Hohe Säulentemperatur akzeptable Trennung und Peakform der höhersiedenden Komponenten aber zu geringe Retention und Trennung der niedriger siedenden Komponenten Temperaturprogrammierte GC (TPGC) Injektion der Probe bei niedriger Säulentemperatur Erhöhung der Säulentemperatur während der Trennung

36 Bedingungen der TPGC Anfangstemperatur T gute Auflösung der niedrigsiedenden Komponenten und Abtrennung vom Lösungsmittel-Peak gegebenenfalls isotherme Vorlaufzeit günstig spezielle Forderungen bei splitless-, on-column-dosierung und Thermodesorption zur Refokussierung der Substanzzonen am Säulenanfang Heizrate r und Aufheizzeit t Lineares Temperaturprogramm: T t =T 0 +r t T Retentions- oder Elutionstemperatur K Optimum (Kompromiss) zwischen Analysenzeit, Peakform und Auflösung finden K Faustregel: r # 12 K/t M (Giddings) Je länger die Säule, umso geringer die Heizrate K Mehrstufige und nicht-lineare Temperaturprogramme möglich Endtemperatur T E K Akzeptable Elution und Auflösung der hochsiedenden Komponenten K Gegebenenfalls isotherme mit Endtemperatur (isotherme Nachlaufzeit) Theorie der TPGC nicht sehr kompliziert, aber wenig praktikabel optimale Trennbedingungen werden experimentell in Testläufen ermittelt (Optimierungsprogramme)

37 Kopplungstechniken Direkte Kombination zweier (verschiedener) Analysenmethoden on-line Kopplung (direkte Verbindung) off-line Kopplung (Transfer) Beispiele Gaschromatographie mit Gaschromatographie GC-GC on-line Massenspektrometrie GC-MS on-line Infrarotspektroskopie GC-IR on-line Kernresonanzspektroskopie GC-NMR off-line Dünnschichtchromatographie GC-DC on-line Flüssigkeitschromatographie mit Flüssigkeitschromatographie LC-LC Massenspektrometrie LC-MS on-line, off-line Infrarotspektroskopie LC-IR on-line Kernresonanzspektroskopie LC-NMR off-line Dünnschichtchromatographie LC-DC on-line Atomabsorptionsspektroskopie LC-AAS on-line

38 Georg Schwedt, Chromatographische Trennmethoden

39 Georg Schwedt, Chromatographische Trennmethoden

40 Georg Schwedt, Chromatographische Trennmethoden Kopplung von GC und DC zur Trennung von Steroiden: kontinuierliche lineare Bewegung der DC-Platte vom vom Start in Richtung GC. 1. GC (b) und 2. DC (a)

41 GC-MS-Kopplung MS= Massenspektrometrie (Massenspektrometer) MS als universeller oder massenselektiver Detektor Kopplung Eluat der GC wird kontinuierlich in die Ionenquelle des MS eingeleitet Kapillar-GC wegen geringem Gasfluss (Hochvakuum im MS) oder Flusssplit vor MS-Quelle MS Erzeugung und Trennung von Ionen in der Gasphase nach dem Verhältnis Masse/Ladung (m/z) Ionisierung: meist durch Elektronenstoß (El) Massenanalysatoren Quadrupol oder Ionenfalle nur Ionen mit bestimmten m/z Verhältnis gelangen auf stabilen Bahnen zum Detektor Massenspektren durch scannen eines m/z-bereichs können auch komplexe oder unbekannte Proben analysiert werden Fragmentierung (Zerfall) der Molekülionen enthält Informationen über seine Struktur

42 MS als universeller Detektor nur ionisierbare Verbindungen können erfasst werden kontinuierliche Masseninformation innerhalb des eingestellten Massenbereichs variable Scanzeit (bis zu 10 Hz) Addition der Intensität aller Signale im aufgenommenen m/z- Bereich ergibt ein Totalionenstrom-Chromatogramm (TIC) Identifizierung einer Verbindung über m/z der Molekülionenen und Fragmentionen (Spektrenbibliotheken) K Strukturaufklärung MS als massenselektiver Detektor Registrierung des Chromatogramms nur für eine oder einige wenige charakteristische Massenzahlen Im Chromatogramm werden nur die Verbindungen registriert, deren Massenspektren die eingestellten m/z-werte aufweisen Single-Ion-Monitoring (SIM-Modus) Suche nach bestimmten Strukturen (target analysis) Vorteile der GC/MS-Kopplung beide Methoden sind kompatibel Gleicher Aggregatzustand, geringer Substanzbedarf, schnelle Registrierung der Massenspektren Hoher Informationsgehalt der Massenspektren Spektrenbibliotheken

43 Trennmechanismen (LC) 1. Wechselwirkungschromatographie Adsorption, Verteilung Basis: zwischenmolekulare Wechselwirkungen (WW) a) Normalphasenchromatographie (NP) normal phase Stationäre Phase (SP) ist polarer als mobile Phase (MP) SP: Kieselgel, Al 2 O 3 (hydrophile Oberfläche) chemisch gebundene polare Phase MP: unpolares LM (z.b. Hexan) Retention: t R ~ polarer Wechselwirkung zwischen Analyt und SP t R ~ 1/Polarität der MP b) Umkehrphasenchromatographie (RP) (Reversed phase) Stationäre Phase unpolarer als mobile Phase SP: oberflächenmodifizierte Kieselgele (hydrophobe Oberfläche, z.b. C 8, C 18 ), Polymere MP: polare LM (z.b. H 2 O, CH 3 OH, CH 3 CN) Retention: t R ~ hydrophobe WW zwischen Analyt undsp t R ~ Polarität der mob. Phase c) Affinitätschromatographie Biospezifische Wechselwirkung selektive (elektrostatische und sterische) WW zwischen immobilisierten Molekülen und Biopolymeren z.b. Ligand, Cofaktor mit Protein Antigen-Antikörper Enzym mit Substrat, Inhibitor Trennung einzelner Substanzen oder Substanzklassen

44 Trennmechanismen (LC) 2. Ionenaustauschchromatographie (IEC) (Ion exchange chromatography) Trennung gleichsinnig geladener Ionen elektrostatische Wechselwirkung entgegengesetzt geladener Ionen SP: Anionen-oder Kationenaustauscher (unlösliche Matrix mit geladenen Gruppen) MP: wässrige Pufferlösung (Eluentionen erforderlich) Zusatz organischer Lösungsmittel Retention t R ~ Ladung und Polarisierbarkeit der Analyten t R ~ Austauschkapazität der SP t R ~ 1/Pufferkonzentration in MP 3. (Sterische) Ausschlusschromatographie (SEC) size exclusion chromatography (Gelchromatographie, Gelpermeationschromatographie) sterischer Ausschluss (Molekülgröße, keine WW) Trennung nach Zugänglichkeit eines Porensystems SP: hochporöse Kieselgele, Polymere, Dextrangele MP: wässriger Eluent: Gelfiltrationschromatographie organischer Eluent: Gelpermeationschromatographie Eluent beeinflusst die Trennung nicht Elution nach abnehmender Molekülgröße

45 Zwischenmolekulare Wechselwirkungen Definition: Anziehungskräfte zwischen valenzmäßig abgesättigten Molekülen (Van der Waalsche Kräfte): von wesentlich geringerer Energie als chemische Bindung (E ww < 25 kj/mol, E CB >400 kj/mol) stark entfernungsabhängig (E WW ~ 1/r 6 mit r = Abstand) Retention wird vorrangig durch die Stärke der (reversiblen) Anziehung zwischen Analyt und stat. Phase bestimmt Struktur und Eigenschaften der Moleküle 1. Polare Moleküle Moleküle mit permanentem elektrischem Dipolmoment : Verbindungen mit Heteroatomen und funktionellen Gruppen (unsymmetrische Ladungsverteilung) z.b. R-CHO R-CN R-OH R-NO 2 R 1 -O-R 2 : 2,5 3,4 1,7 3,5 1,2 (R= Me, Et) 2. Polarisierbare Moleküle unpolare (dipollose Moleküle), in denen durch ein elektrisches Feld (oder benachbarte polare Moleküle) ein Dipolmoment induziert werden kann z.b. Doppelbindungen, aromatische Ringe 3. Unpolare Moleküle kein Dipolmoment induzierbar

46 Zwischenmolekulare Wechselwirkungen Dispersions-WW (Londonkräfte) sehr schwache, ungerichtete (unspezifische) Kräfte zwischen allen Atomen und Molekülen auch wenn kein Dipolmoment vorhanden ist Modell der fluktuierenden Dipole Induktions-WW (Dipol-induzierter Dipol) permanente gerichtete Anziehung zwischen polaren (permanenter Dipol) und polarisierbaren Molekülen Dipol-WW (Dipol-Dipol) gerichtete Anziehung zwischen Molekülen mit permanentem Dipolmoment Wasserstoffbrücke: X HCCCY X Y Protonendonator ( OH, NH) Protonenakzeptor (Elektronendonator)

47 Wechselwirkungschromatographie (Adsorptionschromatographie) Vor der Analyse Säule mit mobiler Phase spülen (konditioniert) Oberfläche der stationären Phase ist vollständig mit Molekülen der mobilen Phase (Solvens S) bedeckt Analyse Dosieren der Probe (eine Substanz X) Ein geringer Teil der Solvensmoleküle wird temporär durch Analytmoleküle X verdrängt K X wird adsorbiert Wenn Analytmolekül diesen Oberflächenplatz verlässt, wird die entstandene Lücke durch nachrückendes Solvens ausgefüllt. Konkurrierende reversible Wechselwirkungen der Analytund Solvensmoleküle mit Oberfläche der stationären Phase S a + X W X a + S (a = adsorbiertes Molekül)

48 Normalphasen-Chromatographie Stationäre Phase: polar Adsorptionsvermögen ergibt sich aus der Art und Anzahl der aktiven Zentren ( Adsorptionsplätze ) SiO 2, Al 2 O 3, SiO 2 -(CH 2 ) n -NH 2, SiO 2 -(CH 2 ) n -CN Mobile Phase: unpolar organisches Lösungsmittel (LM) oder LM-Gemisch Heptan, Hexan, Cyclohexan, Chloroform, Dichlormethan, Dioxan, Methanol Wassergehalt der mobilen Phase: z.b.: Hexan 0% Wassergehalt (Molekularsieb 4 Å) 100% Wassersättigung 0 bis 100% durch Mischung Elutionskraft Fähigkeit zur Verdrängung der Analyten von der stationären Phase strukturabhängig Eluotrope Reihe: Anordnung der Lösungsmittel nach steigender Fließmittelstärke n-pentan<n-hexan<cyclohexan<toluol<chloroform <Aceton<Dioxan<Acetonitril<Methanol Trennung nichtionische unpolare bis mittelpolare Substanzen k Werte nehmen in folgender Reihe zu (gleiches M) gesättigte CH < ungesättigte CH < Aromaten < Ether < Ester < Aldehyde/Ketone < Alkohole < Amine unterschiedliche starke Wechselwirkungen der Analyten mit d e r s t a t i o n ä r e n u n d m o b i l e n P h a s e Wechselwirkungsdreieck

49 Normalphasen-Chromatographie Retention nimmt zu mit steigender Polarität der Analyten abnehmender Polarität der mobilen Phase (Elutionskraft, Fliessmittelstärke) abnehmendem Wassergehalt unpolarer Lösungsmittel Vergrößerung der spezifischen Oberfläche der stat. Phase Nachteile der klassischen NPC energetisch inhomogene Oberfläche º gekrümmte Adsorptionsisotherme º Peaktailing relativ langsame Gleichgewichtseinstellung starke Adsorption polarer Substanzen an aktiven Zentren º lange Konditionierung bei LM-Wechsel erforderlich º Gradientenelution erschwert º Retention wird stark durch polare Zusätze und Verunreinigung der Eluenten beeinflusst Anwendungsbeispiel Stationäre Phase: CN-Phase Mobile Phase: Cyclohexan-Isopropanol (75:25, V/V)

50 Phasensysteme für Wechselwirkungschromatographie Trennung kommt durch unterschiedliche (selektive) Retention der Gemischkomponenten zustande, d.h. durch unterschiedliche Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären und mobilen Phase: Wechselwirkungsdreieck Elution und Auflösung erfordert Balance zwischen Retentionsvermögen der stat. Phase und Fließmittelstärke (solvent strength) der mobilen Phase Stationäre Phase Kieselgele, Aluminiumoxid (hydrophile polare Oberfläche) Kieselgele mit chemisch gebundenen polaren Phasen Kieselgele mit chemisch gebundenen unpolaren (hydrophoben) Phasen: RP-Phasen (reversed phase) vernetzte Polymere (z.b. Polystyrol-Divinylbenzol- Copolymere) Mobile Phase ein oder mehrere Lösungsmittel (binäre, ternäre oder quarternäre Lösungsmittelgemische) isokratische Trennung: konstante Zusammensetzung der mobilen Phase Gradientenelution: Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase während der Trennung (Erhöhung der Fließmittelstärke)

51 Mobile Phase (Elutionsmittel, Fließmittel) Aufgaben (geforderte Eigenschaften) Lösungsmittel für Probekomponenten Einstellung der Verteilungsgleichgewichte der Probekomponenten zwischen beiden Phasen Benetzung der stationären Phase vollständige Elution aller Probekomponenten von der Säule Auswahlkriterien Lösungsvermögen für Probekomponenten Elutionskraft (Fließmittelstärke) K eluotrope Reihe Reinheit: Verunreinigungen, Stabilisatoren, Zersetzungsprodukte, mechanische Partikel unterschiedliche Anforderungen je nach Gradiententechnik, Detektionsprinzip Inert gegenüber Probe und stationär Phase Mischbarkeit von LM-Gemischen (evtl. Volumenkontraktion) Viskosität (bei LM-Gemischen hängt Gesamtviskosität von LM-Zusammensetzung ab) Benetzbarkeit der stat. Phase Toxizität Korrosionsbeständigkeit chlorierte Lösungsmittel (HCI), Puffer, Komplexbildner greifen die Apparatur an

52 Eluotrope Reihe Adsorptionschromatographie: Retention der Analyten hängt von der Stärke der Wechselwirkungen mit der stat. und mob. Phase ab ( Wechselwirkungsdreieck ) Elutionskraft der Lösungsmittel ist unterschiedlich und wird von ihrer Struktur bestimmt. Eluotrope Reihe Anordnung der Lösungsmittel bzw. LM-Gemische nach steigender Elutionskraft (Fließmittelstärke), ausgedrückt durch Parameter,/,/ gilt nur für ein bestimmtes Adsorbens und wird empirisch ermittelt schwächstes Elutionsmittel:,/=0 mit steigendem,/ nimmt Elutionskraft zu (Retention ab) Für Silikagel: Substanz,/ Substanz,/ Hexan 0 Dioxan 0,43 Toluol 0,22 Ethanol 0,68 CH 2 Cl 2 0,3 H 2 O groß < mit wenigen LM bzw. LM-Gemischen lässt sich ein breiter Retentionsbereich erzielen < in NP-Chromatographie ist,/ der LM-Polarität proportional Umrechnung,/ (Al 2 O 3 ). 1,3,/ (SiO 2 ),/ (SiO 2 ). 0,8,/ (Al 2 O 3 )

53 NP-Säulenmaterialien Silicagel (Kieselgel); poröses Siliziumoxid < erste Wahl bei NP-HPLC < Herstellung: < Hydrolyse von Natriumsilikat und weitgehende Entwässerung bis zum Gel < Zermahlen, Korngröße durch Sieben auswählen je nach Behandlung: sauer, neutral oder basisch Struktur Gerüst aus dreidimensional vernetzten Siloxanketten, die endständig mit Hydroxylgruppen abgesättigt sind Belegungsgrad: 7-8 :mol/m² Silanolgruppen Partikel bestehen aus Verbund unporöser Mikroteilchen mit einer Hohlraumstruktur (permanente Porosität) Eigenschaften poröse, harte (druckstabile), hydrophile Materialien quellen nicht in organischen Lösungsmitteln stabil im ph-bereich von 1 bis 8 Kieselgele nehmen leicht Wasser auf Hydroxylgruppen an Oberfläche besitzen unterschiedliche Eigenschaften L freie Silanole: schwach sauer L geminale und assoziierte Silanolgruppen: nicht sauer L Silanole neben Metallkationen: stark sauer

54 Poröse Teilchen als stationäre LC-Phase Porenstruktur K große innere Oberfläche geschlossene Poren und durchgehende Kanäle unterschiedlicher Größe Stagnierende mobile Phase in Poren in Poren befindliche mobile Phase bewegt sich faktisch nicht, sie wird nur langsam mit mobiler Phase im Kornzwischenraum ausgetauscht Probenmoleküle in Poren werden nicht durch mobile Phase transportiert Ortsveränderung erfolgt nur durch Diffusion zur < Phasengrenzfläche < strömenden mobilen Phase K Bandenverbreiterung 1. kurzer Diffusionsweg (~Teilchengröße) K Verwendung kleiner Teilchen in HPLC 2. große Diffusionsgeschwindigkeit K mobile Phase mit geringer Viskosität Ausschlusseffekt begrenzte Zugänglichkeit des Porensystems für große Moleküle K Ausschlusschromatographie

55 Säulenmaterialien Chemisch modifiziertes Silicagel < OH-Gruppen auf der Oberfläche werden umgesetzt < Typische Umsetzungen sind < mit Thionylchlorid zu Chloriden < Umesterung mit Alkohol (extrem wasserempfindlich) < Polymerisation mit gebundenen Siliconölen < mit Silanen zu einer Si-O-Si-C-Bindung Rest R Bezeichnung Eigenschaft Butyl C4 schwach hydrophob Octyl C8, RP-8 hydrophob Octadecyl C18, RP-18 hydrophob Propylcyclohexyl Cyclohexyl schwach polar Phenyl mittelpolar Propylphenyl mittelpolar -(CH 2 ) 3 -CN Nitril, Cyano mittelpolar -(CH 2 ) n -CH(OH)- Diol NP oder RP CH 2 (OH) -(CH 2 ) 3 -NH 2 Amin schwacher Anionenaustauscher -(CH 2 ) 3 -COOH Carboxyl schwacher Kationenaustauscher -(CH 2 ) 3 -SO 2 -OH Sulfonsäure starker Kationenaustauscher -(CH 2 ) 3 -N + (CH 3 ) 2 QAE starker Anionenaustauscher

56 Umkehrphasen-Chromatographie I (RP-Chromatographie) Stationäre Phase unpolar (hydrophob) meist RP-18 (C 18 ) und RP-8 (C 8 ) Aus sterischen Gründen werden nur 50 % der Silanolgruppen aus der Kieselgeloberfläche umgesetzt Verbleibende OH-Gruppen werden weitgehend (aber nicht vollständig!) durch Alkylketten abgeschirmt. Mobile Phase polar meist Gemische H 2 O/org. LM (CH 3 OH, CH 3 CN) H 2 O= hat geringste Elutionskraft (hohe Retention) Trennung vorrangig: Unterschiede in hydrophober Wechselwirkung zusätzlich: sekundäre Wechselwirkungen mit polaren Analyten durch Silanolgruppen und Metallverunreinigungen möglich K Störungen bei Spurenbestimmung basischer Verbindungen Retentionsregeln Retention steigt mit Zunahme der hydrophoben WW zwischen stationärer Phase und Analyt Verringerung der WW zwischen Analyt und mob. Phase < hydrophobem Charakter und C-Zahl der Analyten je unpolarer desto größer ist ihr k-wert < zunehmender C-Zahl der Alkylketten in stat. Phase < zunehmender Polarität (abnehmender Elutionskraft) der mobilen Phase THF < Dioxan < i-propanol < Methanol < Acetronitril steigendem Wassergehalt der mobilen Phase Erhöhung um 10 % führt zur Verdopplung von k

57 Eluotrope Reihe Wasser 0,0 Methanol 5,5 Acetonitril 7,3 Ethanol 7,6 Dimethylformamid 8,0 Tetrahydrofuram 8,4 Eluenten in der RP-HPLC Isokatisch < wässrige Gemische mit 1 oder 2 organischen Lösungsmitteln Gradient < meist lineare Gradienten < von 5% bis maximal 95% organischer Anteil Stärke eines Eluentengemisches F( ) = S V + S V Mischung LM1 LM1 LM 2 LM 2 F S LM V LM Beispiel: Elutionsstärke eluotropes Equivalent Lösemittel Volumenanteil Lösemittel 20% wässriges Methanol Vernünftige RT aber keine gute Trennung F Mischung = F Methanol + F Wasser F Mischung =5,5x0,2 + 0x0,8 = 1,1 für MeCN: 1,1 =Xx7,3 + (1-X)x0 X = 0,151 K 15% CH 3 CN in Wasser

58 Gradienten-Elution Isokratische Elution konstante Zusammensetzung der mobilen Phase während der Trennung (LM-Gemisch) ungünstig für komplexe Proben mit großen Polaritätsunterschieden der Komponenten Gradiententechnik programmierte Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase während der Trennung Zunahme der Elutionskraft durch Erhöhung des Anteils der Komponente mit größerer Elutionskraft Anwendung Trennung von Gemischen mit großen Unterschieden in der Retention der Komponenten Variablen Anzahl der Lösungsmittel: binärer, ternärer Gradient Eluentzusammensetzung zu Beginn der Analyse < gute Auflösung der ersten Peaks (Fließmittel mit geringer Stärke) Form des Gradienten stufenweise, linear oder exponentiell Eluentzusammensetzung am Ende der Analyse zur Elution der stark retardierten Komponenten Steilheit des Gradienten Kompromiss aus Auflösung und Analysenzeit Realisierung Niederdruck-Gradientensystem Hochdruck-Gradientensystem

59 Elektrophorese Definition Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld. Unterschiedliche Ladungen und Größen der Teilchen bewirken eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit Historie Arne Tiselius: 30er Jahre des 20. Jahrhunderts Nobelpreis: 1948 Trennung von menschlichem Serum in 4 Komponenten Albumin, Globuline ", $ und ( Wandernde Grenzschichten-Elektrophorese im U-Rohr nach Tiselius mit Schlieren Optik

60 Weiterentwicklung zur Zonenelektrophorese antikonvektive Träger Papier, Agargele und Kieselgele sehr diffuse Banden wegen Eigenladung Inerte Matrices Stärkegele (1955, Smithies) Trennung von DNA-Fragmenten Celluloseacetatfolien (1957, Kohn) Klinische Routineuntersuchungen Polyacrylamidgele (1959, Raymond und Weintraub) Inert, vollständig transparent, höchstes Auflösungsvermögen für DNA-Fragmente, Proteine und Peptide Agarosegele (1961, Hjertén) Trennung von DNA-Fragmenten, Immunelektrophorese Disk-Elektrophorese, 1964, Ornstein und Davies Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese Grundlage moderner hochauflösender Elektrophoresemethoden in Gelen und Kapillaren Isoelektrische Fokussierung (IEF), 1966 ph-gradient mit Trägerampholyten sehr hoch auflösende Elektrophoresemethode Proteine wandern in einem ph-gradienten bis zu dem ph-wert, der ihrem isoelektrischen Punkt (pi) entspricht seit 1982 immobilisierte ph-gradienten

61 SDS (Natriumdodecylsulfat), 1967, Shapiro, ViÁuela und Maizel Denaturierung von Proteinen Molekulargewichtsbestimmung (SDS-PAGE) Gradientengele, 1967, Margolis und Kenrick Zweidimensionale Elektrophorese (2D-PAGE) (1975 O Farrel und Klose) Erste Dimension: IEF Zweite Dimension: SDS-PAGE seit D-PAGE mit immobilisierten ph-gradienten (Görg) Auflösung mehrerer Tausend Proteine auf 20 cm x 20 cm Blotting-Techniken, 1975, Southern Southern-Blot (DNA-Fragmente aus Agarose-Gelen) Northern-Blot (RNA-Fragmente) Western-Blot (Proteine) Kapillarelektrophorese (ab 1983)

62 Elektrophorese - Grundlagen Drei Verfahren Zonenelektrophorese: homogenes Puffersystem Isotachophorese: diskontinuierliches Puffersystem Isoelektrische Fokussierung: Trennung im ph-gradienten Medien In Lösung: In Matrices: Kapillaren, dünne Pufferschicht (Konvektion) Membran, Gel (Teilchen werden in Matrix retardiert) Polyacrylamidgele Radikalische Polymerisation Acrylamid und N,N -Methylenbisacrylamid

63 Theoretische Grundlagen Definition Die elektrophoretische Beweglichkeit (Mobilität) ist eine substanzspezifische Größe, die die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld bestimmt und damit für die Trennung entscheidend ist. Kraft im elektrischen Feld F e = qce mit q = zce q: Ladung z: Ladungszahl e: Elementarladung in Coulomb Reibungskraft F r = f c Cv v: Wanderungsgeschwindigkeit f c : Reibungskoeffizient Gleichgewicht beider Kräfte: konstante Wanderungsgeschwindigkeit F e = F r qe = f c Cv

64 Mobilität u (Stokessche Gesetz) 0: Viskosität der Lösung r: Radius des hydratisierten Ions nicht-kugelförmige Moleküle empirischer Zusammenhang: M: Molekulargewicht d: 1/3 bis 2/3 Joulesche Wärme c: molare Konzentration des Analyten E: elektrische Feldstärke 8: Äquivalenzleitfähigkeit

65 Molekulargewichtskurve Gel T = 100 ( A + B ) % ( w: V ) V C = 100 B % ( w: V ) A + B SDS-Gradientengel Molekulargewichte in logarithmischer Auftragung Laufstrecke linear auftragen

66 Vertikale Elektrophoreseapparatur Gelgießstand

67 Kapillarelektrophorese capillary electrophoresis (CE) Prinzip Trennung geladener Teilchen durch unterschiedliche Wanderung in einer Kapillarsäule, die eine wässrige Elektrolytlösung enthält. Unter dem Begriff CE werden verschiedene Trenntechniken zusammengefasst; die häufigste Variante ist derzeit die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Apparatur: In die mit Pufferlösung gefüllte Kapillare wird an einem Ende (meist Anodenseite) eine geringe Probenmenge eingebracht und Hochspannung angelegt Ionen wandern unterschiedlich schnell durch Kapillare K Trennung Detektor K Elektropherogramm

68 Bauteile der CE-Apparatur Trennkapillare Länge: cm ID: :m Ungefüllt, beschichtet oder gefüllt Material: Quarz (fused silicia) mit Außenbeschichtung Glas, Polymere Puffergefäße Pufferlösung (ph meist zwischen 2,5 und 8,5) Elektroden: Platinstäbe Hochspannungsgenerator - 30 kv bis + 30 kv (Strom :A) Dosierung Probenaufgabe am anodischen Ende Volumen: 2-20 nl Dosiertechniken Hydrodynamische Injektion (Druck, Vakuum, Gravitation) Elektrokinetische Injektion (Spannungsimpuls) Autosampler Detektor Detektionsvolumen: < 1 nl Optische Detektoren: Detektionsfenster in der Kapillare UV-VIS (feste oder variable Wellenlänge, DAD) Fluoreszenz (evtl. nach Derivatisierung) Leitfähigkeit, elektrochemische Detektion ESI-MS Thermostat Abtransport der Wärme aus der Kapillare Luft oder Kühlflüssigkeit

69 Theoretische Grundlagen der CE Elektrophoretische Wanderung Wanderung der Ionen in einem elektrischen Feld mit konstanter Geschwindigkeit u zur entgegengesetzt geladenen Elektrode: u ep = : ep E = : ep U / L u ep elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit : ep elektrophoretische Beweglichkeit (Mobilität) der Ionen E elektrische Feldstärke (E = U/L) U angelegte Spannung (Trennspannung) L Gesamtlänge der Trennkapillare Wanderungsgeschwindigkeit ergibt sich aus Gleichgewicht zwischen Beschleunigungskraft K B und bremsender Reibungskraft K R : K B = z C F C E F z Faradaykonstante effektive Ionenladung Stockesches Gesetz für sphärische Teilchen: K R = 6BChCrCu h dynamische Viskosität der Lösung r Stockescher Radius der Ionen (einschließlich umgebender Solvathülle) Elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit u ep u ep ~ z Ladung der Spezies ~1/r Größe der Spezies ~ E Feldstärke

70 Theoretische Grundlagen der CE Elektroosmotischer Fluss (EOF) Oberflächenladung der Kapillareninnenwand bewirkt eine Wanderung der ges. Pufferlösung in der Kapillare: In Quarzkapillare verursachen Puffer mit ph-wert > 4 eine negative Aufladung der inneren Oberfläche infolge Dissoziation der Silanolgruppen Ausbildung einer elektrochemischen Doppelschicht mit fest adsorbierten Kationen (starre Grenzschicht) und einer diffusen Grenzschicht mit beweglichen, solvatisierten Kationen Kationenüberschuss im diffusen Teil der Doppelschicht erzeugt einen gleichmäßigen und pfropfenförmigen Fluss der gesamten Lösung in Richtung Kathode (nach Anlegen eines elektrischen Feldes): Elektroosmotischer bzw. elektroendosmotischer Fluss (EOF) u eo = : eo AE : eo = εζ πη 4 η: Viskosität ε: Dielektrizitätskonstante der Doppelschicht ξ: (Zeta-) Potential der Scherebene Zeta-Potential (~ Zahl der Ladungen an Kapillarenwandung) Der EOF ist stark ph-abhängig und im alkalischen deutlich ausgeprägt; kann durch chemische Modifizierung der Kapillarenoberfläche verändert werden.

71 Elektroosmotischer Fluss (EOF) Aufbau (oben) und Potentialverlauf Q (unten) der elektrochemischen Doppelschicht (x = Abstand von der Kapillare) ph-abhängigkeit

72 Elektrophoretische Wanderung und EOF Gesamtmobilität Die elektrophoretische Wandung wird vom EOF überlagert Beobachtete Mobilität setzt sich aus beiden Beiträgen zusammen: : ges = : ep + : eo Beispiel: Analyt (Injektion an Anodenseite) Kationen: : ges = : ep + : eo Anionen: : ges = : ep - : eo Neutralteilchen: : ges = : ep (keine Trennung)