Jahrbuch 2008/2009 Dirk Görlich; Steffen Frey Logistik auf kleinstem Raum: Transportprozesse zwischen Zellkern und Zytoplasma

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1 Logistik auf kleinstem Raum: Transportprozesse zwischen Zellkern und Zytoplasma Logistics on smallest possible space: Transport processes between cell nucleus and cytoplasm Dirk Görlich; Steffen Frey Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen Korrespondierender Autor Zusammenfassung Der Zellkern verfügt über keine eigene Proteinsynthese, sondern importiert alle benötigten Proteine aus dem Zytosol. Umgekehrt versorgt er das Zytosol mit Ribosomen, mrnas und trnas. Sämtlicher Kern-Zytoplasma- Transport wird durch die Permeabilitätsbarriere der Kernporen kontrolliert. Diese Permeabilitätsbarriere ist ein intelligentes Hydrogel mit erstaunlichen Materialeigenschaften. Es unterdrückt den Durchtritt von inerten Makromolekülen, erlaubt aber einen bis zu fach schnelleren Einstrom derselben Moleküle, wenn diese an einen passenden Kern-Transport-Rezeptor gebunden sind. Summary The cell nucleus is enclosed by the nuclear envelope, lacks protein synthesis and therefore imports each and every protein from the cytosol. Conversely, the nucleus supplies the cytoplasm with nuclear products, such as ribosomes, trnas and mrnas. The permeability barrier of nuclear pore complexes controls all this exchange. This permeability barrier is an "intelligent" hydrogel with truly remarkable properties. It excludes inert macromolecules, but permits an up to fold faster entry of cargoes, when these are bound to appropriate nuclear transport receptors. Kompartimentierung Die uns bekannten Lebewesen lassen sich in zwei Kategorien unterteilen: Prokaryoten, das heißt Bakterien oder Archaebakterien, sowie Eukaryoten, zu denen alle mit bloßem Auge sichtbaren Organismen wie Pflanzen, Tiere und Pilze, aber auch eine Reihe von Einzellern wie Hefen oder Amöben gehören. Das charakteristische Merkmal eukaryotischer Zellen ist deren Aufteilung in verschiedene Reaktionsräume, die Kompartimente genannt werden und Ausdruck einer strikt arbeitsteiligen Organisation sind. So enthält eine menschliche Zelle hunderte Mitochondrien, in denen die Zellatmung abläuft, und die für die Energieversorgung der Zelle zuständig sind. Sie besitzt zudem ein sekretorisches System, mit dessen Hilfe zum Beispiel Hormone produziert und aus der Zelle ausgeschleust werden. Und natürlich enthält sie den Zellkern, in dem die genetische Information aufbewahrt, verwaltet und abgerufen wird, und der gewissermaßen die Leitzentrale 2009 Max-Planck-Gesellschaft 1/8

2 der Zelle darstellt. Die eben genannten Zellbestandteile schwimmen in einer Grundsubstanz, die Zytosol genannt wird und ein ebenso eigenständiges Kompartiment darstellt. Tierische oder pflanzliche Zellen haben also eine extrem komplizierte innere Struktur, deren Vorteile sich wahrscheinlich am eindrucksvollsten anhand der Tatsache zusammenfassen lassen, dass nur eukaryotische Organismen den Sprung zur Entwicklung komplexer, vielzelliger Lebewesen geschafft haben. Die Verwaltung des Genoms in einem dafür spezialisierten Kompartiment, nämlich dem Zellkern, hat sicher ganz entscheidend zu dieser Entwicklung beigetragen und erlaubt es Eukaryoten, eine rund 1.000fach größere Menge an genetischer Information zu handhaben als Bakterien. Sie können damit den Bauplan eines hochkomplexen vielzelligen Organismus von Generation zu Generation weitergeben. Kern-Zytoplasma-Transport ist essentiell für eukaryotisches Leben Wie alles im Leben hat auch die ausgeklügelte strukturelle Organisation eukaryotischer Zellen ihren Preis und kann nur mit erheblichem Aufwand aufrechterhalten werden. Dieser Aufwand liegt nicht zuletzt in der Versorgung der einzelnen Kompartimente mit bestimmten Makromolekülen wie Enzymen, strukturellen Proteinen oder Ribonukleinsäuren. So werden Proteine fast ausschließlich im Zytosol synthetisiert und von dort auf Mitochondrien, den Zellkern oder andere Zellorganellen verteilt. Diese Verteilung erfolgt nicht zufällig; vielmehr wird beispielsweise ein Enzym, das der Zellkern benötigt, in aller Regel ausschließlich in den Kern importiert und eben nicht in die Mitochondrien. Umgekehrt erfolgt auch ein massiver Export aus dem Kern. Wie bereits erwähnt, werden Proteine im Zytosol produziert. Die Baupläne für jedes einzelne Protein sind jedoch im Genom niedergeschrieben, das im Zellkern aufbewahrt wird und diesen auch nicht verlässt. Diese Information muss aber trotzdem aus dem Kern ins Zytoplasma gelangen. Die Lösung des Problems ist, dass Kopien einzelner Gene erstellt und aus dem Zellkern exportiert werden. Im Zytosol werden diese Kopien von den Ribosomen gelesen, die wiederum einzelne Aminosäuren, entsprechend der genetischen Vorschrift, zu Proteinen zusammenfügen. Auch Ribosomen werden im Zellkern produziert und müssen erst in das Zytoplasma exportiert werden. Diese Import- und Exportprozesse zwischen Kern und Zytoplasma sind keineswegs seltene Ereignisse. Vielmehr erfordert jede einzelne enzymatische Reaktion im Kern, sei es das Kopieren von Genen oder die Reparatur von Schadstellen im Genom, Proteine, die zuvor im Zytoplasma produziert und in den Kern importiert wurden. Umgekehrt könnte kein einziges eukaryotisches Gen in ein Protein umgesetzt werden, ohne dass zuvor Ribosomen und Genkopien aus dem Kern exportiert worden wären. Ein Blick in die Transportmaschinerie Der Zellkern ist von zwei Membranen umgeben, die für Proteine und andere Makromoleküle völlig undurchlässig sind. Der stoffliche Austausch kann daher nicht direkt durch diese Membranen erfolgen. Stattdessen sind in die Kernhülle so genannte Kernporen eingebettet, die man sich als hochselektive Tore vorstellen kann und die Teil einer ganzen Transportmaschinerie sind. Diese Transportmaschinerie ist das zentrale Forschungsthema der Abteilung zelluläre Logistik am MPI für biophysikalische Chemie. Importine und Exportine [1] bilden den mobilen Teil des Transportsystems ( Abb. 1). Während die Kernporen für die meisten Makromoleküle ab einem bestimmten Größenlimit dicht verschlossen erscheinen, haben Importine und Exportine das Privileg, die Permeabilitätsbarriere der Kernporen nahezu ungehindert passieren zu können. Das Entscheidende dabei ist, dass sie bei ihrem Porendurchtritt auch Fracht oder Passagiere 2009 Max-Planck-Gesellschaft 2/8

3 zu können. Das Entscheidende dabei ist, dass sie bei ihrem Porendurchtritt auch Fracht oder Passagiere mitnehmen können. Nun darf nicht jeder Passagier an Bord, sondern Importine erkennen mit molekularer Präzision, welche Proteine in den Kern importiert werden sollen und welche nicht. Ein weiteres Problem ist, dass ein Importin nicht nur seine Passagiere erkennen, sondern auch sicherstellen muss, dass die Fracht im Zytosol aufgenommen und im Kern entlassen wird. Um seine Fracht sicher an den Bestimmungsort bringen zu können, muss ein Importin erkennen, ob es sich innerhalb oder außerhalb des Kerns befindet. Das ist kein triviales Problem, und es stellte sich heraus, dass Importine dazu Instruktionen von einem molekularen Schalter, der Ran genannt wird, erhalten. Dieser Schalter steht nur im Kern auf an (RanGTP), und diese Schalterstellung gibt den Importinen das Zeichen, ihre Ladung zu löschen. Daraufhin kehrt das Importin unbeladen ins Zytosol zurück, um eine weitere Runde Import zu vermitteln. Importin-abhängiger Proteintransport in den Zellkern Zellkern und Zytoplasm a sind durch die Kernhülle voneinander getrennt. Ein stofflicher Austausch zwischen beiden Kom partim enten kann daher nur durch Kernporen erfolgen. Die Perm eabilitätsbarriere der Kernpore (grau) unterdrückt die Passage von norm alen (inerten) Makrom olekülen (A), erlaubt jedoch eine praktisch ungehinderte Passage von Im portinen und anderen Kerntransportrezeptoren (B). Im portine binden ihre Fracht im Zytoplasm a und entlassen sie, sobald sie auf RanGTP im Zellkern treffen. Der Im portin- RanGTP-Kom plex passiert die Perm eabilitätsbarriere dann in entgegengesetzter Richtung, im Zytosol wird GTP hydrolysiert, Ran entlassen und das Im portin kann erneut Fracht laden. Das Zusam m enspiel m it dem RanGTPase-System m acht das Im portin zu einer Proteinpum pe. Die eigentliche Passage durch die Perm eabilitätsbarriere ist jedoch ein reversibler und energieunabhängiger Prozess. Max-Planck-Institut für biophysikalische Chem ie/ Frey und Görlich Im Gegensatz zu Importinen sind Exportine für den Transport von Ribonukleinsäuren und bestimmten Proteinen aus dem Zellkern zuständig. Sie funktionieren ganz analog zu den Importinen, nur interpretieren sie die Zeichen des molekularen Schalters Ran genau entgegengesetzt: Sie laden Fracht im Kern auf und entladen 2009 Max-Planck-Gesellschaft 3/8

4 sie in das Zytosol. Die eben beschriebenen Transportprozesse laufen in sämtlichen menschlichen Zellen ab, die typischerweise einen Durchmesser von einem hundertstel Millimeter haben. Sie sind damit ein Beispiel dafür, wie Logistik auf kleinstem Raum organisiert werden kann. Offensichtlich spielen die Kernporen eine Schlüsselrolle in diesen Austauschprozessen. Sie repräsentieren eine Kategorie biologischer Objekte, die auch als molekulare Maschinen bezeichnet werden. Im Gegensatz zu Enzymen katalysieren diese nicht einfach nur chemische Reaktionen. Vielmehr bewerkstelligen molekulare Maschinen komplexere Aufgaben, wie beispielsweise das gezielte Bewegen von Objekten innerhalb einer Zelle oder eben das Sortieren von Proteinen in solche, die in den Kern gehören und solche, die im Zytoplasma verbleiben sollen. Gemessen an der täglichen Erfahrung sind diese molekularen Maschinen winzig, und selbst mit den besten Lichtmikroskopen erscheint eine Kernpore nur als punktförmiges Objekt. In molekularem Maßstab sind Kernporen jedoch gigantisch: Sie setzen sich aus etwa 700 einzelnen Polypeptidketten bzw. 20 Millionen Einzelatomen zusammen. Entsprechend ihrer Größe sind Kernporen auch äußerst effektive Sortiermaschinen. Auf der einen Seite verhindern sie ein Vermischen der im Kern bzw. Zytosol gelösten Inhaltsstoffe und blockieren den Durchtritt vieler Makromoleküle. Gleichzeitig kann eine einzige Kernpore pro Sekunde aber bis zu Importin-Moleküle mit gebundener Fracht selektiv passieren lassen, ohne dass die Präzision dieses Sortierprozesses darunter leidet [2]. Diese Transportkapazität ist aber auch unbedingt erforderlich, denn überschlägig gerechnet entspricht der Materialstrom, der täglich durch die rund Kernporen eines Menschen selektiv geleitet wird, in etwa unserem Körpergewicht. Wie funktioniert die Permeabilitätsbarriere der Kernpore? Derzeit beschäftigt uns ganz unmittelbar die Frage, warum Importine und Exportine nahezu ungehindert Kernporen passieren können, aber andere Objekte gleicher Größe mit hoher Präzision ausgefiltert werden. Eine entscheidende Rolle spielen dabei die so genannten Phenylalanin-reichen Repeat-Motive (FG-Repeats) [3], die Teil von Kernporenproteinen sind und in insgesamt 10 4 Kopien pro Kernpore vorkommen. Importine und Exportine binden FG-Repeats, und diese Interaktionen sind Voraussetzung für die erleichterte Translokation durch die Kernporen [4]. Wie aber derartige Interaktionen eine Beschleunigung der Kernporenpassage bewirken, ist keine triviale Frage, da eine bloße Bindung eines Importins oder Exportins an die FG-Repeats die Kernporenpassage lediglich verzögern sollte. Zur Lösung dieses Paradoxons haben wir vorgeschlagen, dass die Bildung der Barriere und die erleichterte Kernporenpassage unmittelbar verknüpfte Phänomene darstellen [2; 5]. Da FG-Repeats für die erleichterte Translokation benötigt werden, sollten sie auch an der Bildung der Barriere beteiligt sein. FG-Repeats bestehen aus bis zu 50 kurzen Clustern hydrophober Aminosäuren (meist Phenylalanin, F), zwischen denen jeweils sehr hydrophile Abschnitte liegen. Durch hydrophobe Interaktion zwischen den hydrophoben Clustern sollte sich aus den zunächst linearen FG-Repeats ein dreidimensionales Netzwerk (d. h. ein reversibles Hydrogel) bilden (Abb. 2), das den Durchtritt solcher Objekte verhindert, deren Dimensionen die Maschenweite übersteigt (Abb. 2C) Max-Planck-Gesellschaft 4/8

5 Die Permeabilitätsbarriere der Kernpore ein hochselektives Hydrogel Die so genannten FG-Repeat-Dom änen von Kernporenproteinen bestim m en die Perm eabilitätseigenschaften von Kernporen. Ihre lokale Konzentration innerhalb der Kernpore ist m it geschätzten m g/m l extrem hoch. Löst m an die FG-Repeat-Dom äne des Kernporenproteins Nsp1p zu einer so hohen Konzentration, so bildet sie ein transparentes, elastisches FG- Hydrogel, dessen m echanische Eigenschaften an Gum m ibärchen (ein Gelatine-Hydrogel) erinnern. Ein solches FG-Hydrogel wurde in A auf eine gem usterte Unterlage platziert und photographiert. FG-Repeats sind hydrophile, lineare Polym ere, die in regelm äßigen Abständen hydrophobe Flecken (FG-Motive) enthalten. Die Hydrogel-Bildung beruht auf einer Quervernetzung zwischen einzelnen FG-Repeat- Dom änen, die u. a. durch hydrophobe Interaktionen zwischen den FG-Motiven (blaue Punkte) verm ittelt werden (siehe B). Das FG-Hydrogel kann daher als dreidim ensionales Sieb betrachtet werden, das kleine Moleküle ungehindert passieren lässt, aber den Durchtritt von inerten Makrom olekülen (ocker) unterdrückt (siehe C). Dabei bestim m t die Maschenweite die Ausschlussgrenze ( 5 nm Durchm esser). Max-Planck-Institut für biophysikalische Chem ie/ Frey und 2009 Max-Planck-Gesellschaft 5/8

6 Görlich Importine und Exportine können jedoch direkt in das Netzwerk eingebettet werden, da sie selbst die hydrophoben Cluster der FG-Repeats binden und dadurch Inter-Repeat-Interaktionen lokal unterdrücken (Abb. 3). Gewissermaßen können sie sich also in der Permeabilitätsbarriere lösen und sie somit durchqueren. Kernporen sind extrem komplex aufgebaut. Um ihre Funktionsprinzipien wirklich begreifen zu können, muss das experimentelle System zunächst auf das Wesentliche reduziert werden. Wir konnten jetzt die Permeabilitätsbarriere im Reagenzglas aus einer einzigen FG-Repeat-Domäne eines Kernporenproteins nachbilden [6; 7]. Sie erwies sich in der Tat als ein Hydrogel; vergleichbar mit Götterspeise oder dem Glaskörper des Auges, die auch ein Hydrogel darstellen. Das Hydrogel-Modell der Kernporenfunktion Die Perm eabilitätsbarriere der Kernporen verhindert nicht nur ein unkontrolliertes Verm ischen von Zytosol und Kerninhalt, sondern erlaubt auch sehr großen Objekten (bis zu einem Durchm esser von m ehr als 25 nm ), die Kernporen m ithilfe eines Kern-Transportrezeptors (z.b. Im portin) zu passieren. Die Größe solcher Transportkom plexe übersteigt die Maschenweite des FG-Hydrogels; sie m üssen deshalb für ihren Durchtritt die im Wege liegenden Maschen des FG-Hydrogels kurzzeitig aufbrechen. Die Schem ata A -D illustrieren diesen Prozess. Eine Masche wird durch Interaktion zwischen FG- Motiven (blau) gebildet und stabilisiert. Im portine binden diese Motive, öffnen dadurch eine Masche und können das Hindernis sam t ihrer Fracht passieren. Schem ata E-F zeigen eine Kernpore m it FG-Hydrogel-Barriere. Im portine (Im p) können Maschen lokal öffnen und sich im Hydrogel lösen. Sie werden dann gewisserm aßen von der Perm eabilitätsbarriere um flossen. Das stellt sicher, dass die Barriere intakt bleibt, selbst während große Objekte durch die Pore geschleust werden. Der im Gel gelöste Transportrezeptor kann die Barriere auf der anderen Seite wieder verlassen. Max-Planck-Institut für biophysikalische Chem ie/ Frey und Görlich Im Gegensatz zu gewöhnlichen Hydrogelen hat unser Hydrogel jedoch die phantastische Eigenschaft, "normalen" Makromolekülen ein Eindringen in das Gel zu verwehren (Abb. 4). Wird ein solches normales Makromolekül jedoch mit einem Kern-Import-Signal versehen und an ein Importin gebunden, dann erhöht sich die Einströmgeschwindigkeit in das Gel bis zu fach, und das, obwohl die Bindung des Importins die Größe des diffundierenden Objektes auf ein Vielfaches erhöht. Wir möchten jetzt verstehen, wie diese Prozesse im Detail ablaufen, das heißt welche Atomgruppen wie und wann mit anderen interagieren müssen, damit die Permeabilitätsbarriere die Selektivität erlangt, die Kernporen auszeichnet. Darüber hinaus möchten wir verstehen, wie Importine und Exportine ihre Fracht so zielsicher inmitten tausender anderer Proteinmoleküle erkennen und wie Kernporen aus ihren Vorstufen 2009 Max-Planck-Gesellschaft 6/8

7 zielsicher inmitten tausender anderer Proteinmoleküle erkennen und wie Kernporen aus ihren Vorstufen zusammengebaut und in die Kernhülle eingelassen werden. Analyse der Permeabilitätseigenschaften des FG-Hydrogels. A ) Schem a des Messansatzes. Ein FG-Hydrogel wird so auf dem Objekttisch eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops so positioniert, dass die Puffer/Gel-Grenze in der konfokalen Bildebene abgebildet wird. Der Einstrom zugegebener fluoreszenter Proteine in das Gel wird in Echtzeit m ikroskopisch verfolgt. B) Aufnahm e eines FG-Hydrogels, das m it einem inerten rot-fluoreszierenden Protein und einem grün-fluoreszierenden Im portin-fracht-kom plex inkubiert wurde. Das inerte Protein blieb ausgeschlossen, während der Im portin-kom plex tief in das Gel eindrang. C)Durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wurden das far-red m arkierte FG- Hydrogel ( Gel ) sowie der Einstrom eines rot-fluoreszierenden inerten Moleküls in dieses Gel visualisiert. Dieser Einstrom war sehr ineffizient, d.h. das Gel erwies sich als eine sehr effektive Barriere. D) Gleichzeitig wurde der Einstrom eines grün-fluoreszierenden Im portin-fracht-kom plexes verfolgt. Dieser Einstrom war so effizient, dass die Diffusion an die Gelgrenze zum geschwindigkeitsbestim m enden Schritt wurde. Der Kom plex reicherte sich sehr stark im Gel an (Partitionskoeffizient > 100); die Aufnahm en sind daher im Gelbereich überexponiert. Entscheidend ist, dass der Im portin-fracht-kom plex nicht an der Puffer-Gel-Grenze stecken bleibt, sondern sich m it einer Geschwindigkeit in das Gel bewegt, die eine Kernporenpassage innerhalb von 10 Millisekunden gestatten würde. E) und F) Quantifizierungen der experim entellen Prim ärdaten von C und D. Dabei sind die Konzentrationsprofile der diffundierenden Moleküle zu verschiedenen Zeitpunkten ihres Einstrom s in das FG-Hydrogel dargestellt. Max-Planck-Institut für biophysikalische Chem ie/s. Frey und D. Görlich Originalveröffentlichungen 2009 Max-Planck-Gesellschaft 7/8

8 Nach Erweiterungen suchenbilderweiterungchanneltickerdateilistehtml- ErweiterungJobtickerKalendererweiterungLinkerweiterungMPG.PuRe-ReferenzMitarbeiter (Employee Editor)PersonenerweiterungPublikationserweiterungTeaser mit BildTextblockerweiterungVeranstaltungstickererweiterungVideoerweiterungVideolistenerweiterungYouTube- Erweiterung [1] D. Görlich, U. Kutay: Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. Annual Review of Cell and Developmental Biology 15, (1999). [2] K. Ribbeck, D. Görlich: Kinetic analysis of translocation through nuclear pore com plexes. EMBO Journal 20, (2001). [3] M. Rout, S. Wente: Pores for thought: nuclear pore com plex proteins. Trends in Cell Biology 4, (1994). [4] R. Bayliss, K. Ribbeck, D. Akin, H. M. Kent, C. M. Feldherr, D. Görlich, M. Stewart: Interaction between NTF2 and xfxfg- containing nucleoporins is required to m ediate nuclear im port of RanGDP. Journal of Molecular Biology 293, (1999). [5] K. Ribbeck, D. Görlich: The perm eability barrier of nuclear pore com plexes appears to operate via hydrophobic exclusion. EMBO Journal 21, (2002). [6] S. Frey, D. Görlich: A saturated FG- Repeat hydrogel can reproduce the perm eability properties of nuclear pore com plexes. Cell 130, (2007). [7] S. Frey, R. P. Richter, D. Görlich: FG- rich Repeats of nuclear pore proteins form a three- dim ensional m eshwork with hydrogel- like properties. Science 314, (2006) Max-Planck-Gesellschaft 8/8