Phylogenetik. Vorlesung Einführung in die Angewandte Bioinformatik Prof. Dr. Sven Rahmann. Webseite zur Vorlesung

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1 Phylogenetik Vorlesung Einführung in die Angewandte Bioinformatik Prof. Dr. Sven Rahmann Webseite zur Vorlesung Sprechstunde Mo in OH14, R214 Sven.Rahmann -at- tu-dortmund.de 1

2 Phylogenetik Phylum = Stamm Phylogenetik: befasst sich mit der Rekonstruktion von evolutionären Stammbäumen (= phylogenetische Bäume, Phylogenien) aus unterscheidbaren Merkmalen, heutzutage insbesondere aus DNA- / Proteinsequenzen, - sowohl von Spezies [species trees] - als auch von einzelnen Gen- / Protein-Familien [gene trees] Tree Of Life Ein langfristiges Ziel: Stammbaum aller existierenden (und ausgestorbenen) Arten Tree Of Life Web Project: 2

3 Tree Of Life Ein langfristiges Ziel: Stammbaum aller existierenden (und ausgestorbenen) Arten Tree Of Life Web Project: Kontroverse über Verzweigungen nahe der Wurzel Tree Of Life Web Project 3

4 Ein Graph besteht aus: - Knoten (vertices V, nodes) und - Kanten (edges E), die zwischen den Knoten verlaufen. Grundlagen: Graphen Graphen können gerichtet oder ungerichtet sein (Kanten haben eine Richtung oder nicht). Der Grad eines Knoten ist die Anzahl seiner Nachbarn. 4

5 Grundlagen: Ungewurzelte Bäume Als (ungewurzelter) Baum (unrooted tree) T = (V,E) wird ein Graph bezeichnet, der - zusammenhängend (:= jeder Knoten wird von jedem anderen erreicht) - kreisfrei (:= es gibt nur einen Weg zwischen je zwei Knoten) ist. In einem Baum unterscheidet man zwischen - inneren Knoten (inner nodes N), und - Blättern = äußeren Knoten (leaves L). Kante Ein Baum heißt Binärbaum, wenn alle inneren Knoten Grad 3 und Blätter Grad 1 haben. Ungewurzelte binäre Bäume erfüllen E = 2 L - 3 und N = L - 2. Innerer Knoten Blatt 5

6 Grundlagen: Gewurzelte Bäume Ein ungewurzelter Baum kann gewurzelt werden, indem man eine Kante auswählt, in deren Mitte einen Knoten (die Wurzel) einfügt, und den Baum daran äufhängt. Die Wurzel hat Grad 2. Die Kanten werden von der Wurzel weg gerichtet. In der Informatik wird die Wurzel eines Baums stets oben, die Blätter werden unten gezeichnet. Kanten verlaufen von oben nach unten. 6

7 Anzahl an Binärbäumen Ungewurzelte Binärbäume: 3 Blätter: 1 Baum mit 3 Kanten 4 Blätter: 3 verschiedene Bäume, je 5 Kanten 5 Blätter: 3*5 = 15 Bäume, je 7 Kanten 6 Blätter: 15*7 = 105 Bäume... A B 3 Blätter: 1 ungewurzelter Baum Gewurzelte Binärbäume: Man kann die Wurzel wie ein weiteres Blatt bei ungewurzelten Bäumen behandeln: 3 Blätter: 3 Bäume (siehe rechts, 5 Kanten) 4 Blätter: 3*5 = 15 5 Blätter: 15*7 = 105 A B A B B A Beobachtung: Anzahl der binären Bäume wächst super-exponentiell in der Anzahl der Blätter n (schneller als c n für jede Konstante c) 3 Blätter: 3 gewurzelte Bäume mit veschiedenen Nachbarschaftsverhältnissen 7

8 Die drei Quartette A A B A B B D D D AB D A BD AD B 8

9 Aufgaben der Phylogenetik Eine wichtige Aufgabe der Phylogenetik ist die Bestimmung der Verwandtschaftsverhältnisse zwischen Arten (Spezies) und der Ereignisse, die bei verschiedenen Arten seit der Speziation stattfanden. Gorillas Humans himpanzees Bonobos Orangutans Bonobos Gorillas Humans MYA 0 14 MYA 0 Klassische Sichtweise, basierend auf äußeren Merkmalen Moderne Sichtweise, basierend auf DNA-Vergleich 9

10 Evolutionäre Verwandtschaft zwischen Genen Erinnerung: Ein multiples Alignment ist nur zwischen Sequenzen sinnvoll, die global ähnlich sind, d.h. zwischen denen eine evolutionäre Verwandtschaft besteht. Diese wird durch einen phylogenetischen Baum ausgedrückt. Beispiel: Serpin-Familie in der pfam-datenbank Dies ist ein Gen-Baum (gene tree), kein Arten-Baum (species tree): An den Blättern (rechts) stehen einzelne Gene/Proteine/Sequenzen, keine Spezies. Evolutionäre Ereignisse (innere Knoten): - Genduplikation - Speziation 10

11 Grad der Auflösung des Verzweigungsmusters Stern -Baum, nicht aufgelöst Teilweise aufgelöst Vollständig aufgelöst A A A B E E D B B E D D Polytomie, Multifurkation Bifurkation 11

12 Darstellungsarten in der Phylogenetik Kladogramm Phylogramm Ultrametrischer Baum (cladogram) (phylogram) (ultrametric tree) Taxon B Taxon Taxon Taxon B Taxon B Taxon Taxon A 1 Taxon A Taxon A Taxon D 5 Taxon D Taxon D Achse hat keine Bedeutung Maß für den genetischen Unterschied (z.b. PAM-Einheiten) Realzeit: gleicher Abstand aller Blätter zur Wurzel Alle Darstellungsformen zeigen die gleichen evolutionären Beziehungen (Baumtopologien, Verzweigungen, zwischen den Taxa). Taxa im selben Unterbaum bilden eine monophyletische Gruppe (clade). Darstellung durch geschachtelte Klammern: (((B,),A),D) 12

13 Gewurzelt oder ungewurzelt? Das Problem der Molekularen Uhr Phylogenetische Bäume werden (heutzutage vor allem) aus Biosequenzen gewonnen. Um über die Verwandtschafts-Verhältnisse zu entscheiden, benötigt man Algorithmen zum Sequenzvergleich, ein mathematisches Modell der Evolutionsprozesse auf Sequenzen. Hieraus lassen sich Distanzen zwischen Sequenzen berechnen. Beispiel: 139 beobachtete Unterschiede auf zwei Sequenzen der Länge 854. Wie vielen PAM-Einheiten entspricht das? Dies kann als einfaches Distanzmaß genommen werden. Problem: Distanz ist nicht Realzeit! Evolutionsgeschwindigkeit variiert zeitlich, genspezifisch, Gattungs-spezifisch,... Hieraus berechnete Bäume repräsentieren keine realen zeitlichen Abstände. Auch die Wurzel kann nicht zuverlässig positioniert werden. Man berechnet ungewurzelte Phylogramme. In Ausnahmefällen treten diese Probleme nicht auf. Man sagt dann: Es gilt die Hypothese der molekularen Uhr. Man erhält einen gewurzelten ultrametrischen Baum. 13

14 Wurzeln eines ungewurzelten Baums Zwei Methoden: (1) Mit Hilfe einer outgroup : Spezies die bekanntermaßen außerhalb der betrachteten Gruppe liegt (erfordert Vorwissen, relativ zuverlässig) outgroup (2) Als Mittelpunkt der am weitesten voneinander entfernten Taxa (einfach, relativ unsicher) A 10 Größter Abstand: d (A,D) = = 18 Mittelpunkt bei 18 / 2 = B 2 5 D 14

15 Ähnlichkeit / Distanz: beobachtbar, messbar Ähnlichkeit ist nicht Verwandtschaft Verwandtschaft: historische Tatsache, kann heute nicht mehr beobachtet werden A D 6 B ist ähnlicher zu A (d = 3) als zu B (d = 7), aber und B sind am nächsten verwandt. Das heißt, und B hatten einen späteren gemeinsamen Vorfahren als oder B mit A. 15

16 Gründe für beobachtete Ähnlichkeiten (1) Evolutionäre Verwandtschaft - gemeinsame Stamm-Merkmale () - gemeinsame abgeleitete Merkmale (G) (2) parallele unabhängige Entwicklung von Merkmalen (Homoplasie) G G G T G G G G G konvergente Mutation zu G parallele Mutation zu G Rückmutation zu (3) geringe Evolutionsraten (hoher negativer selektiver Druck) 16

17 Phylogenetische Methoden Es gibt unterschiedliche Methoden zum Erstellen phylogenetischer Bäume. Sie unterscheiden sich vor allem in zwei Dingen: - Auf welcher Art von Daten arbeiten sie (Distanze oder Merkmale)? - Welche Prinzipien liegen dem Algorithmus zu Grunde? ALGORITHMUS BASIERT AUF einem Optimalitätskriterium lusteringverfahren ART DER DATEN Merkmale Distanzen PARSIMONY (Sparsamkeit) MAXIMUM LIKELIHOOD MINIMUM EVOLUTION LEAST SQUARES (kleinste Quadrate) UPGMA NEIGHBOR-JOINING 17

18 Distanz- vs. Merkmals-basierte Methoden Merkmals-basierte Methoden Merkmale sind Objekte, die einen von mehreren Zuständen annehmen können, z.b. jeweils eine Spalte in einem multiplen Alignment von DNA-Sequenzen. In jedem Taxon liegt eine bestimmte Merkmalsausprägung vor. Die Merkmale (Alignments) werden direkt zur Baumkonstruktion verwendet. Taxa Merkmale Species A ATGGTATTTTATAGTAG Species B ATGTAGTTTATATTAA Species TTATAGATGTGGTA Species D TTGAAGATGTGGTG Species E TTGAAGTTTTAGTTG Distanz-basierte Methoden Die Merkmale werden durch ein mathematisches Modell in paarweise Distanzen zwischen den Taxa umgerechnet. Nur die Distanz-Werte werden zur Baumkonstruktion verwendet. Zwei berechnete Distanzmatrizen rechts: Anteil Unterschiede, links: PAM-Schätzung / 100 A B D E Species A Species B Species Species D Species E

19 Optimierungs- vs. lustering-methoden Auf einem Optimalitätskriterium basierende Methoden Es wird ein Kriterium (eine Eigenschaft des zu berechnenden Baumes) definiert, das es zu optimieren gilt. Beispiele dafür: - Möglichst wenig Mutationen insgesamt im Baum - Möglichst wenig Diskrepanz zwischen gegebenen Distanzen und den Distanzen, die die Baumtopologie impliziert Die Aufgabe eines Algorithmus' ist nun, den Baum zu finden, der dieses Kriterium optimiert. Man muss wieder zwischen exakten Algorithmen und Heuristiken unterscheiden. Man kann die Ausgaben verschiedener Algorithmen miteinander vergleichen. lustering-methoden Es werden Regeln definiert, nach denen Taxa zu (2er-)Bäumen zusammenzufassen sind, diese Bäume wiederum zu grösseren Bäumen, etc. Diese Methoden liefern immer einen einzigen Baum zurück; dieser kann nicht gegenüber Alternativen bewertet werden. Es gibt kein Optimalitätskriterium. Achtung: Keines der Prinzipien verspricht den biologisch korrekten Baum! 19

20 Ausgewählte Methoden im Überblick ALGORITHMUS BASIERT AUF einem Optimalitätskriterium lusteringverfahren ART DER DATEN Merkmale Distanzen PARSIMONY (Sparsamkeit) MAXIMUM LIKELIHOOD MINIMUM EVOLUTION LEAST SQUARES (kleinste Quadrate) UPGMA NEIGHBOR-JOINING Merkmalsbasierte Methoden: + können auf molekulare oder auf morphologische Merkmale angewendet werden + liefern Schätzungen der Ahnen-Sequenzen + können die evolutionären Ereignisketten bestimmen führen auf NP-schwere Probleme, auch Heuristiken sehr rechenaufwändig 20

21 Sehr einfaches Beispiel Gegeben sind 5 Sequenzen: A, A, G, G, G Zwei mögliche Baumtopologien: Welche Sequenzen stehen an den inneren Knoten? Bei Maximum-Likelihood spielt die Länge der Kanten dabei eine Rolle.???????? A G G A G G G G A A 21

22 Parsimony (Sparsamkeit) Gesucht / Ausgabe: Baumtopologie, Ahnen-Sequenzen in den inneren Knoten & Wurzel Optimalitätskriterium: Der sparsamste Baum ( most parsimonious tree) ist derjenige, der über alle Kanten summiert am wenigsten Änderungen benötigt. Vorteile Einfach, intuitiv, motiviert durch Occam's Razor: die einfachste, kürzeste Erklärung ist die beste. Nachteile: Unterschätzt die wahre Anzahl von evolutionären Ereignissen bei entfernt verwandten Sequenzen (z.b. wegen Homoplasien) liefert falsche Ergebnisse bei weit entfernten Sequenzen und stark unterschiedlichen Raten 22

23 Maximum Likelihood (maximale Plausibilität) Gesucht / Ausgabe: Baumtopologie, Kantenlängen (in PAM-Einheiten o.ä.) Optimalitätskriterium: Sind ein statistisches Evolutionsmodell und eine Baumtopologie & Kantenlängen gegeben, kann man die Wahrscheinlichkeit ausrechnen, dass genau die beobachteten Sequenzen zusammen auftreten. Gesucht ist der Baum & Kantenlängen, der diese Wahrscheinlichkeit maximiert. Vorteile Modellbasiert: Alle Annahmen werden explizit gemacht Mehrfach- und Rücksubstitutionen sind im Modell berücksichtigt Konsistente Schätzung evolutionärer Distanzen (Kantenlängen) Nachteile: Ergebnisse sehr modell-abhängig; falsches Modell führt zu beliebigen Ergebnissen schwierig zu verstehen 23

24 Ausgewählte Methoden im Überblick ALGORITHMUS BASIERT AUF einem Optimalitätskriterium lusteringverfahren ART DER DATEN Merkmale Distanzen PARSIMONY (Sparsamkeit) MAXIMUM LIKELIHOOD MINIMUM EVOLUTION LEAST SQUARES (kleinste Quadrate) Programme fitch, kitsch UPGMA NEIGHBOR-JOINING Distanzbasierte Optimierungs-Methoden: + Distanzen können auf unterschiedliche Arten gewonnen werden + flexibler Einsatz, auch außerhalb der Phylogenetik Merkmale gehen nur indirekt ein; Ergebnisse von Distanzberechnung abhängig Keine Aussage über Ahnen-Merkmale möglich 24

25 Minimum Evolution / Least Squares Gesucht / Ausgabe: Baumtopologie, Kantenlängen Optimalitätskriterium: Zu jeder Baumtopologie werden die Kantenlängen so bestimmt, dass die die gegebenen Distanzen von Blatt zu Blatt möglichst gut approximieren (im Sinne kleinster Quadrate). Optimal ist die Baumtopologie - mit kleinstem quadratischen Fehler (bei least squares) - mit kleinster Gesamtlänge (bei minimum evolution) Vorteile optimalitäts-basiert ( Lösungen können vergleichend evaluiert werden) schneller als merkmals-basierte Methoden Nachteile: langsamer als lustering-methoden NJ und UPGMA 25

26 Ausgewählte Methoden im Überblick ALGORITHMUS BASIERT AUF einem Optimalitätskriterium lusteringverfahren ART DER DATEN Merkmale Distanzen PARSIMONY (Sparsamkeit) MAXIMUM LIKELIHOOD MINIMUM EVOLUTION LEAST SQUARES (kleinste Quadrate) UPGMA NEIGHBOR-JOINING lustering-methoden: + Distanzen können auf unterschiedliche Arten gewonnen werden + die schnellsten Baumrekonstruktionsmethoden + universell einsetzbar (auch außerhalb der Phylogenetik) + wenn die Distanzen es zulassen (ultrametrisch oder additiv sind), liefern die Algorithmen den richtigen Baum, sonst einen gut passenden 26

27 Ausgewählte Methoden im Überblick ALGORITHMUS BASIERT AUF einem Optimalitätskriterium lusteringverfahren ART DER DATEN Merkmale Distanzen PARSIMONY (Sparsamkeit) MAXIMUM LIKELIHOOD MINIMUM EVOLUTION LEAST SQUARES (kleinste Quadrate) UPGMA NEIGHBOR-JOINING lustering-methoden: liefern immer genau einen Baum, auch bei unsinnigen Distanz-Daten verschiedene Lösungen können nicht anhand eines Kriteriums verglichen werden Problem, dass eine unsinnige Lösung berechnet wurde, wird möglicherweise gar nicht erkannt 27

28 UPGMA: Unweighted Pair Group Method using Averaging Gesucht / Ausgabe: Baumtopologie, Kantenlängen Verfahren: Solange mehr als ein Objekt vorhanden ist: Finde das Paar (x,y) von Objekten mit kleinster Distanz Erzetze sie durch ein einziges Objekt {x,y} Berechne Distanzen von {x,y} zu den anderen Objekten a,..., mittels Durchschnittbildung zwischen d(x,a) und d(y,a) Der Baum ergibt sich aus der Hierarchie der zusammengefassten Objekte. Vorteile einfach zu verstehen, einfach durchzuführen liefert korrektes Resultat bei ultrametrischen Distanzen, d.h. wenn es einen ultrametrischen Baum gibt, der die gegebenen Distanzen als Distanzen zwischen den Blätten aufweist, wird dieser (schnell) gefunden. Nachteile: Ergebnisse schlecht interpretierbar bei nicht ultrametrischen Eingabe-Distanzen 28

29 NJ: Neighbor Joining Gesucht / Ausgabe: Baumtopologie, Kantenlängen Verfahren: Ähnlich wie bei UPGMA, aber die Wahl des zu aggregierenden Objektpaars ist sorgfältiger: Es werden alle Distanzen berücksichtigt, nicht nur die kleinste. Der Baum ergibt sich aus der Hierarchie der zusammengefassten Objekte. Vorteile liefert korrektes Resultat bei additiven Distanzen, d.h. wenn es einen (ungewurzelten) Baum gibt, der die gegebenen Distanzen als Distanzen zwischen den Blätten aufweist, wird dieser (schnell) gefunden. erlaubt viele Varianten mit unterschiedlichen Eigenschaften Nachteile: Ergebnisse schlecht interpretierbar bei nicht additiven Eingabe-Distanzen 29

30 Persönliche Empfehlung: Welche Methode soll ich benutzen? Distanzbasierte Methoden sind schnell und funktionieren meist gut, wenn das richtige Distanz-Modell verwendet wurde. Es empfiehlt sich, eine NJ-Variante zu benutzen, nicht UPGMA. Probabilistische Methoden (ML, Bayes'sche Methoden) sind langsam (auch diese Problemformulierung ist NP-schwer), aber können bei richtiger Wahl des Evolutionsmodells bessere Ergebnisse liefern. Sie berechnen außerdem Alternativen und relative Konfidenzwerte. Parsimony-Methoden unterschätzen den wahren evolutionären Abstand, denn sie suchen nach der sparsamsten Erklärung für Unterschiede. Nur in Ordnung bei sehr nah verwandten Sequenzen. Man bekommt keine Zeitschätzungen. Parsimony ist NP-schwer und benötigt viel Zeit für exakte Lösungen. 30

31 Software-Sammlung Phylogenetik Umfangreiche Sammlung phylogenetischer Software: Phylip: das am häufigsten benutzte Paket zum Erstellen von Phylogenien, enthält zahlreiche Einzelprogramme für verschiedene Aufgaben Projekt-Homepage: Web-Interface zu einer Teilmenge von Phylip + mehr: 31

32 Ende 32

33 Vertiefungsthemen Details zu den einzelnen Algorithmen Distanzberechnung im Jukes-antor und Kimura-Modell Robustheit geschätzter Bäume: Bootstrap 33