Allgemeine Aufgabenstellung. Ziele

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1 Allgemeine Aufgabenstellung Sie (s)wollen die Phylogenie der Vertebraten mit Hilfe molekulare Daten ergründen. Insbesondere interessiert Sie die Verwandtschaft der Primaten; aber auch tiefere Verzweigungen sollten aufgelöst werden. Aufgrund Ihrer umfangreichen Vorkenntnisse durch die Vorlesung wissen Sie, dass verschiedene Methoden zur Rekonstruktion molekularer Stammbäume existieren und nur bestimmte Proteine oder DNA-Fragmente für derartige Untersuchungen geeignet sind. Der Übersichtsartikel von Whelan et al. (2001) zeigt hierzu anschaulich, dass z.b. die richtige Auswahl eines Evolutionsmodells essentiell wichtig ist, aber auch, dass die Analyse von Evolutionsraten und die Frage ob DNA- oder Protein-Daten für eine derartige Fragestellung verwendet werden sollten äußerst wichtig sind. Deshalb starten sie Ihre Untersuchungen zunächst mit nahezu ubiquitär vorkommenden Proteinen. Sollte es zu Problemen bei bestimmten Knotenpunkten kommen, ziehen sie einen neuen Datensatz hinzu. Sie wollen herausfinden welcher dieser Datensätze eher geeignet ist die Phylogenie der Vertebraten zu analysieren um die Evolutionsgeschichte gut unterstützt zu rekonstruieren. Ziele Datengewinnung Erstellen und Editieren von multiplen Sequenzalignments Evaluation und Anwendung von Evolutionsmodellen Rekonstruktion molekularer Stammbäume o Distanz- und o Charakter-orientierte Methoden Evaluation molekularer Stammbäume Tipps und Links Dokumentieren Sie Ihre Vorgehensweise und Ihre Ergebnisse durchgehend mit geeigneten Screenshots oder durch direktes Einfügen in Ihrem Protokoll parallel zu Ihrer Arbeit. Ordnung im Dateiwust von Anfang an bewahren! Erstellen Sie sich einige Ordner mit aussagekräftigen Namen, wie z.b. Alignments, NJ-, MP-, ML-trees, Sequence data und speichern Sie die output files mit geeigneten Benennungen (z.b. align HbA_blosum_default.aln oder NJtree_JTT_invgamma.dnd) and many many moooooore. Programme A suite of web-tools Alignment Play with alignments Sequence Conversion Interface Model test Model test Graphical interface 4 Paup Tree visualisation

2 1. Datenerhebung Zum Aufwärmen Sie erhalten eine Datei mit Proteinsequenzen (Proteine.seq) bestimmter Spezies (download dieser Datei unter: Um welche Proteine handelt es sich hierbei? Ergänzen sie die wissenschaftlichen Namen der Tierarten und die dazugehörige accession number der jeweiligen Sequenz. Weshalb können Sie mit diesem Datensatz die Phylogenie der Primaten nicht analysieren? Für die Untersuchungen an Primaten erhalten Sie eine weitere Datei. Diese enthält eine DNA- Sequenz (DNA1.seq, download dieser Datei ebenfalls unter: Um was handelt es sich bei dieser Sequenz? Suchen Sie nach den orthologen Sequenzen vom Gorilla, Schimpansen, Gibbon und dem Orang Utan, und speichern Sie diese kompletten Genome im FASTA-Format (DNA_mt.seq). 2. Mehrfach-Sequenzalignments Um zu phylogenetischen Aussagen zu kommen, müssen Sie geeignete Vergleichssequenzen auswählen. Dies haben Sie bereits erledigt und können nun zur Analyse der Daten fortschreiten. Zunächst müssen die gewonnenen Daten alignt werden und gegebenenfalls manuell optimiert werden. Dies erfolgt mit dem Programm CLUSTALX. Öffnen Sie das Programm CLUSTALX und laden die Datei Proteine.seq (Menü File Load Sequences ). Nun "alignen" Sie die Sequenzen. D.h., das Programm versucht die Sequenzen so aneinanderzulegen, dass sie optimal übereinstimmen. Dafür müssen in einige Sequenzen Lücken bzw. Insertionen eingefügt werden. Sie können hierfür die Standardeinstellungen von CLUSTALX verwenden: Menü: "Alignment" - "Do Complete Alignment". Nach Bestätigung der Dialogbox ("OK") nimmt der Sequenzvergleich einige Sekunden in Anspruch. Was erkennen Sie an diesem Alignment? Was hat das Programm mit den Sequenzen, im Vergleich zu den Ausgangsdaten, gemacht? Muss dieses Alignment modifiziert werden? Speichern Sie das Alignment in PHYLIP-Format unter dem Namen Proteine.phy. 3. Evolutionsmodelle Sie haben ein Alignment erstellt und sollten nun das beste Evolutionsmodell für Ihren Datensatz ermitteln. Dies erfolgt mit dem Programm PROTTEST: Selection of best-fit models of protein evolution (

3 Überlegen Sie welche Schritte das Programm durchführt und welche Einstellungen Sie vornehmen müssen. Überprüfen Sie den work progress. Während der Analyse können Sie einen Blick in das ProtTest manual werfen, es lohnt sich ( Insbesondere der Punkt ProtTest s output. A guided example: the ribosomal L5 protein family. ist sehr hilfreich. Welches Modell wählen Sie? Wie stellt sich der gamma shape parameter dar? Weshalb könnte ausgerechnet dieses Modell ideal für Ihre Berechnungen sein? 4. Berechnung von Distanz-orientierten Stammbäumen Wir werden nun zwei verschiedene Methoden ausprobieren, um aus diesem Alignment einen Stammbaum zu erstellen. Beide Methoden beruhen jeweils auf einer von Ihnen erstellten Distanzmatrix. Diese wird auf der Basis Ihres Alignments (Proteine.phy) erstellt werden. Erstellung einer Distanzmatrix Da es sich um ein Aminosäure-Alignment handelt, verwenden wir zunächst das Programm PROTDIST. Laden Sie das Alignment nach der Aufforderung: "<Please enter new file name>". Wählen Sie das geeignete Evolutionsmodell (Option "P"). Die Distanzmatrix ist nach dem Ende der Berechnung in einer Datei Namens OUTFILE enthalten. Benennen Sie diese in Protein_day.dst um, und schauen Sie sich die Datei mit einem Texteditor bzw. Word an. Waren alle Einstellungen korrekt? Was ist noch zu beachten? Modifizieren Sie verschiedene Einstellung und testen Sie verschiedene Evolutionsmodelle. Vergleichen Sie die Datenmatrices Was verändert sich und weshalb? Rekonstruktion von Stammbäumen Als Erstes erstellen Sie einen Stammbaum anhand der UPGMA-Methode. Dafür wird das Programm NEIGHBOR verwendet. Starten Sie dieses Programm und geben Sie die Matrixdatei ein: "<Please enter new file name>" Wählen Sie unter Settings die Option N aus, und wählen Sie dann die Methode UPGMA aus. Drücken Sie dann "y" (für "YES"). Die Analyse befindet sich im OUTFILE, der Stammbaum in OUTTREE. Benennen Sie beide Dateien um: OUTFILE Proteine_day_UPGMA.out OUTTREE Proteine_day_UPGMA.tre Schauen Sie sich diese mit dem Editor an. Zur Darstellung des Stammbaumes starten Sie nun TREEVIEW und MEGA. Laden Sie die Datei Proteine_day_UPGMA.tre. Welche Aussagen über die Phylogenie der verwendeten Proteine bzw. Organismen lassen sich anhand dieses Stammbaumes treffen? Was fällt Ihnen auf? Können Sie diesen Baum radial darstellen?

4 Können Sie eine Außengruppe auswählen? Machen Sie sich eigenständig mit dem Programm zur Darstellung von Bäumen vertraut. Welches Programm entspricht der Theorie besser? Wiederholen Sie diese Vorgehensweise und benutzen Sie zur Erstellung eines Stammbaumes den Algorithmus Neighbor-Joining (option "P"). Achten Sie hierbei auf die Umbenennung der Dateien: OUTFILE Proteine_day_NJ.out OUTTREE Proteine_day_NJ.tre Bestimmen Sie die geeignete Außengruppe (outgroup). Welches Kriterium können Sie hier für die Wahl der Außengruppe verwenden? Die Details dieses Programms werden im Kurs besprochen. Beachten Sie insbesondere die Astlängen. Verwenden Sie nun andere Distanzmatrices, wiederholen Sie die Stammbaumrekonstruktion und vergleichen Sie Ihre Ergebnisse. 5. Statistische Auswertung mit Bootstrap -Verfahren Stellen Sie aus Ihrem Alignment (Proteine.phy) 100 "Pseudosamples" her (Programm SEQBOOT). Denken Sie daran, das OUTFILE der SEQBOOT-Analyse umzubenennen (OUTFILE Proteine_seqboot.txt). Öffnen Sie diese Datei mit einem Editor. Was beinhaltet diese Datei? Laden Sie diese Datei Proteine_seqboot.txt in PROTDIST. Wählen Sie wiederum die relevanten Einstellungen, und zusätzlich geben Sie ein, dass Sie mehrere Datensätze analysieren wollen (Option "m", 100 Datensätze, random number seed=1, diese Berechnung kann einige Zeit in Anspruch nehmen). Das OUTFILE benennen Sie nun wieder um. Was enthält diese Datei? OUTFILE Proteine_seqboot_protdist.txt Diese Datei benutzen Sie nun für Ihre Stammbaumerstellung mit dem Programm NEIGHBOR. Berechnen Sie Stammbäume nach dem UPGMA- und dem NJ-Algorithmus. Beachten Sie bitte, dass Sie wiederum mehrere Datensätze analysieren (Option "m", 100 Datensätze, random number seed=1). Die entstandenen OUTTREE-Dateien benennen Sie wiederum um. OUTFILE-Dateien können Sie überschreiben. OUTTREE OUTTREE Proteine_seqboot_protdist_UPGMA.tre Proteine_seqboot_protdist_NJ.tre Schauen Sie sich die Ergebnisse mit TREEVIEW. Was enthalten diese Dateien? Den Konsensusstammbaum erhalten Sie mit dem Programm CONSENSE indem Sie die jeweilige Datei einladen und die Analyse starten. Beachten Sie dabei die Möglichkeiten des Consensus Typus. Benennen Sie die entsprechenden OUTTREE-Dateien um.

5 OUTTREE OUTTREE Proteine_seqboot_ protdist_upgma_con.tre Proteine_seqboot_ protdist_nj_con.tre Schauen Sie sich die Ergebnisse mit TREEVIEW an. Integrieren Sie diese Werte in Ihrem Protokoll in die entsprechenden Stammbäume, welche die errechneten Distanzen beinhalten. Welche Gruppen werden gut unterstützt, welche schlecht? An welchen Stellen sind die Bootstrap-Werte besonders niedrig und wie erklären Sie sich dies? Können Sie auf diese Art und Weise die Phylogenie der Vertebraten rekonstuieren? 6. Berechnung von Charakter-orientierten Stammbäumen Als nächstes wenden wir die Parsimony und die Maximum likelihood-methode an. Dafür stehen die Programme PROTPARS und PROTML aus dem PHYLIP Softwarepaket zur Verfügung. Welche Datei müssen Sie einladen? Auf welchen Parameter müssen Sie hier besonders achten? OUTFILE und OUTTREE benennen Sie um, und schauen Sie sich diese mit dem Editor bzw. TREEVIEW an. Vergleichen Sie ML- und MP-trees. Was fällt Ihnen bei der Darstellung der Astlängen auf? OUTFILE Proteine_MP.out bzw. Proteine_ML.out OUTTREE Proteine_MP.tre bzw. Proteine_ML.out Führen Sie nun eine Bootstrap-Analyse für diesen Datensatz durch. Vergleichen Sie das Ergebnis mit den anderen Stammbäumen. Können Sie nun mit diesen Analysen die Phylogenie der Vertebraten rekonstruieren? Falls nicht, was können Sie tun? 7. DNA-Datenerhebung Bereits am 1. Tag haben Sie sich einen zweiten Datensatz für DNA-Analysen beschafft (DNA1_mt.seq). 8. DNA-Mehrfach-Sequenzalignments Erstellen Sie ein Alignment mit diesem zweiten Datensatz mit CLUSTALX. Speichern Sie das Alignment im PHYLIP-Format unter dem Namen DNA1_mt.phy und als DNA1_mt.msf. Muss dieses Alignment modifiziert werden und wenn ja, weshalb? Modifikation des DNA-Alignments. Öffnen Sie die Datei DNA1_mt.msf mit Hilfe des Programms GENEDOC.

6 Machen Sie sich eigenständig mit dem Programm vertraut. Testen Sie z.b. die Buttons <C, Q, P > oder nehmen sie den Menüpunkt <Project> unter die Lupe. Nun editieren Sie das von Ihnen erstellte DNA-Alignment. Selektieren Sie im Menüpunkt <EDIT> <select columns> und markieren Sie nicht-überlappende Bereiche. Durch die Tastenkombination <strg D> können die markierten Bereiche gelöscht werden. Exportieren Sie nun die modifizierte Datei und speichern Sie diese im Phylip-Format (DNA1_mt_mod.phy). Müssen Sie erneut ein Alignment durchführen? Könnten auch andere Bereiche dieser Genome für Ihre Untersuchungen herangezogen werden? 9. DNA-Evolutionsmodelle Sie haben ein Alignment erstellt und sollten nun das beste Evolutionsmodell für Ihren Datensatz ermitteln. Dies erfolgt mit dem Programm FindModel: ( oder Modeltest: Während der Analyse sollten Sie sich nochmals das Prinzip von ModelTest klar machen und die Zeit nutzen Explanation und links auf der Seite zu durchstöbern. Sie können nun jederzeit eigenständig Baumrekonstruktionen mit Hilfe des PHYLIP PACKAGES durchführen. Zunächst soll aber ein weiteres Programm vorgestellt werden:

7 11. MEGA Starten Sie mit einem Doppelklick das Programm Mega und ziehen Sie das modifizierte alignment DNA1_mt_mod.phy auf das Programm. Um die Phylip formatierte Datei zu Mega zu konvertieren, klicken Sie auf, bestätigen und speichern Sie die konvertierte Datei als DNA1_mt_mod.meg. Öffnen Sie die konvertierte Datei DNA1_mt_mod.meg. Achten Sie auf weitere Informationsfelder! Es erscheint nun ein Icon für das alignment. Öffnen sie das Alignment durch anklicken. Machen Sie sich mit den Eigenschaften des Sequence Data Explorer eigenständig vertraut.

8 variabel oder identisch translate Parsimony conserved Sie können, dürfen und sollen nun eigenständig Modelle und Stammbäume berechnen. Testen Sie die verschiedenen Möglichkeiten und diskutieren sie die Resultate Vergleichen Sie wie sich verschiedene Parameter und Rekonstruktionsmethoden auf die Baumtopologie auswirken.

9 Wie erkären Sie sich diese Unterschiede? Beachten Sie auch die Veröffentlichung von Whelan et al. und vergleichen Sie insbesondere die Verwendung unterschiedlicher Modelle und die Verwendung des shape Parameters zur Rekonstruktion der Bäume: z.b. und Versuchen Sie analoge Bäume mit dem Phylip package zu erstellen. Orientieren Sie sich hierbei an den Hilfe Dateien des Phylip package. Welche Vergleichsmöglichkeiten haben Sie? Wie könnten sie eindeutig feststellen welche Phylogenie RICHTIG ist? [12. Eigenständige molekularphylogenetische Analyse] Freiwillige Aufgabe! Sie erhalten eine weitere cdna-sequenz (Aufgabe8.txt). Welches Protein wird durch diese cdna kodiert und aus welcher Spezies stammt dieses? Suchen Sie alle orthologen Proteine aus geeigneten Datenbanken heraus und erstellen Sie mit diesem Datensatz einen Neighbor-Joining, einen ML- und einen Maximum Parsimony-Baum, inklusive Bootstrapping. Sie können hierzu auch die Programme Mega: Treefinder: RaxML: Robust Phylogenetic Analysis For The Non-Specialist benutzen. Weitere links finden Sie auch unter: