Bericht an die Stiftung des Landesnaturschutzverbandes. zum Schwerpunktthema Das Wasser und sein Lauf. Thema des Forschungsvorhabens:

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1 Bericht an die Stiftung des Landesnaturschutzverbandes zum Schwerpunktthema Das Wasser und sein Lauf Thema des Forschungsvorhabens: Biomarkerstudien mit Fischen und Invertebraten als Werkzeuge zur Charakterisierung des Gesundheitszustandes des Neckars bei Tübingen Antragstellerin: Krisztina Vincze Betreuer: Prof. Dr. Rita Triebskorn Dr. Volker Scheil Die Promotionsarbeit wird ausgeführt an der: Universität Tübingen Abteilung Physiologische Ökologie der Tiere Konrad- Adenauer Str. 20, Tübingen März 2014

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Hintergrund- das Neckarprojekt Aktives Monitoring Ziele des aktiven Monitorings Methoden Probenahme Mikrokern-Test Stressproteinanalyse Histologie Chemische Analyse der Fischgewebe Statistische Auswertung Ergebnisse Gentoxische Untersuchungen - der Mikrokern Test Analyse des Stressproteins Hsp70 bei Bachforellen Histologie Chemische Analyse von akkumulierenden Umweltschadstoffe Diskussion Fazit Ausblick Literatur

3 1. Einleitung 1.1. Hintergrund- das Neckarprojekt Der 367 km lange Neckar fließt durch den zentralen Teil Baden-Württembergs, in seinem Einzugsgebiet leben etwa 5 Millionen Menschen. Die vielfältige Nutzung als Brauchwasserressource und Wasserstraße sowie die Wasserkraftgewinnung und die zahlreichen Kläranlagen bedeuten erhebliche Eingriffe in die ökologische Balance des Neckars (Ikone, 2003). Aufgrund diverser anthropogener Einflüsse eignet sich der Neckar als Modellsystem für ökotoxikologische Untersuchungen. Das Ziel des Projekts Biomarkerstudien mit Fischen und Invertebraten als Werkzeuge zur Charakterisierung des, das 2010 startete, ist die Charakterisierung des ökologischen Zustandes des Neckars bei Tübingen mit Hilfe des Einsatzes einer Biomarkerpalette bei aquatischen Organismen im aktiven und passiven Biomonitoring. In der Ökotoxikologie sind Biomarker definiert als biologische Veränderungen von Lebewesen (von der molekularen über die zelluläre und physiologische Ebene bis zu Verhaltensänderungen), die durch Exposition gegenüber Umweltchemikalien verursacht wurden und durch diverse Messmethoden qualifiziert oder quantifiziert werden können (Peakall, 1994). Im Rahmen des Neckarprojekts wurden im Jahr 2011 Döbeln (Leuciscus cephalus) und Flohkrebsen (Gammarus sp.) im passiven Monitoring untersucht. Das heißt, dass an mehreren Probestellen (zwischen Tübingen-Lustnau und Hirschau) Freilandtiere entnommen und mit Hilfe von diversen mikroskopischen und molekularbiologischen Biomarkermethoden hinsichtlich ihres Gesundheitszustandes charakterisiert wurden. Auf diese Weise konnten Gentoxizität, Gewebeschädigungen und allgemeine Stressreaktionen der beprobten Organismen erfasst werden. Um die Toxizität des Gewässers zu beurteilen, wurden zusätzlich limnologische Parameter (Sauerstoffgehalt, ph, Leitfähigkeit, Temperatur, Härte, Nährstoffe) bestimmt, sowie Wasser- und Sedimentproben entnommen, deren Toxizität im Labor mit einem Entwicklungstest mit Zebrabärblingen (Danio rerio) untersucht wurde. Die Ergebnisse der oben genannten Studien wurden bereits in den ersten zwei Berichten für die LNV-Stiftung präsentiert, aus diesen Gründen fokussiert der vorliegende Bericht hauptsächlich auf die Resultate des aktiven Monitorings Aktives Monitoring Während der Elektrobefischung von Döbeln im Jahr 2011 ergaben sich überraschend geringe Fangzahlen unterhalb der Tübinger Kläranlage (KA), obwohl die Strömung- und Strukturbedingungen für Weißfische geeignet waren. Die Tübinger Kläranlage weist ein konventionelles Abwasserreinigungssystem auf, ohne zusätzliche Ausbaustufen wie Ozonierung oder Aktivkohlefilter, aus diesem Grund kann man eine unvollständige Eliminierung von Umweltschadstoffen und dadurch negative Einflüsse auf der Fischgesundheit vermuten. Um mehr Informationen über eine mögliche Belastung des Neckars durch die Kläranlage zu erhalten, wurde im Jahr 2012 vom passiven Monitoring zu 3

4 einem aktiven Monitoring gewechselt. Bei dem aktiven Monitoring werden unbelastete Testorganismen in eine bestimmte Umgebung eingesetzt (in Käfigen, Bypass-Aquarien usw.) und über einen definierten Zeitraum vor Ort exponiert. Auf diese Weise kann man ungewollte Stressfaktoren, wie Nahrungsmangel, Fressfeinde oder auch Resistenzen ausschließen und Informationen über die toxische Verhältnisse/Belastungsquellen bekommen. Im Rahmen des aktives Monitorings wurden jeweils 30 junge (18 Monate alt, Fischzucht Lohmühle, Alpirsbach) Bachforellen (Salmo trutta fario) in durchströmbaren Edelstahl Schwimmkäfigen (Abb. 1). unterhalb (PS1) und oberhalb (PS2) der Kläranlage Tübingen exponiert (Abb. 2). Abbildung 1: Durchströmbarer Edelstahl-Schwimmkäfig des aktiven Monitorings. Die Expositionskäfige wurden von der Abteilung Physiologische Ökologie der Tiere der Universität Tübingen entworfen und in der Universitätswerkstatt gebaut. PS1 PS2 Abbildung 2: Probestellen des aktiven Monitorings am Neckar bei Tübingen. P1- unterhalb der Kläranlage, P2- oberhalb der Kläranlage. 4

5 Die Fische wurden alle zwei Tage ad libitum mit Forellenpellets gefüttert. Im Zuge der Fütterung wurde auch die Mortalität regelmäßig kontrolliert. Die Beprobung der Fische erfolgte nach 10 und 30 Tagen, auf diese Weise war es möglich, die Reaktion der Tiere auf eine kurz- und mittelfristige Belastung zu vergleichen. Als Negativkontrolle wurden zusätzlich 15 unbelastete Bachforellen von der Fischzucht Lohmühle untersucht. Um den Gesundheitszustand der Forellen erfassen zu können, wurde eine Reihe von Biomarkertests verwendet. Durch histopathologische Untersuchungen an Leber, Kieme, Niere und Geschlechtsorganen (Gonade) konnten spezifische Gewebeschädigungen beurteilt werden. An den gleichen Organen wurde auch der Level des Stressproteins Hsp70 gemessen, um generelle Stressreaktionen auf der sub-zellulären Ebene zu erfassen. Um Informationen über genotoxische Wirkungen zu bekommen, wurde an Blutzellen der Forellen der sogenannte Mikrokern-Test durchgeführt. Zusätzlich wurden durch eine chemische Analyse akkumulierende Umweltschadstoffe im Fischgewebe gemessen, um die biologischen Resultate besser interpretieren zu können. Eine einfache Übersicht zu den Tests zeigt Tabelle 1. Anmerkung: die Ergebnisse der Stressproteinanalyse und des Mikrokern-Tests wurden bereits im Rahmen des zweiten Berichts vorgestellt. Diese Resultate werden jedoch in dem vorliegenden Bericht erneut gezeigt und diskutiert, um ein Gesamtbild über die physiologischen Aspekte der Reaktionen von Fischen auf toxische Belastung zu erhalten und die möglichen Wirkungen der Einträge der Kläranlage Tübingen zu beurteilen. Tabelle 1: Liste der an Bachforellen im aktiven Monitoring durchgeführten Analysen. In der Tabelle wird der Zweck der Untersuchungen und der die Resultate enthaltende Bericht dargestellt. Aktives Monitoring mit Bachforellen Bericht Test Zweck Stressproteine Detektieren von proteotoxischen Wirkungen Bericht II Mikrokerne Detektieren von Zellteilungsfehlern Bericht III Histologie Chemische Analysen Identifizieren von Gewebeschädigungen Messung von akkumulierenden Schadstoffen 5

6 1.3. Ziele des aktiven Monitorings Das Ziel des vorliegenden Projektteils ist zum einen die Beurteilung der ökotoxikologischen Effekte der Tübinger Kläranlage durch Untersuchungen von im Fluss exponierten Fischen, zum anderen die Evaluierung sowie der Vergleich der in der Studie angewandten Biomarkerund Monitoringmethoden hinsichtlich deren Sensitivität und Eignung für eine umfassende Gewässercharakterisierung. Durch die vorliegende Studie sollen die folgenden Fragen beantwortet werden: Wie stark ist der Einfluss des Klärwassers der Kläranlage Tübingen auf den Gesundheitszustand von Fischen? Kann man erklären, weshalb im Neckar unterhalb der Kläranlage nur noch sehr wenige Fische leben? Wie starke Unterschiede gibt es zwischen einer kurz- und einer mittelfristigen Exposition? Welche zusätzlichen Informationen zu biologischen Daten erbringen chemische Analysen von akkumulierenden Schadstoffe? Können durch die Präsenz/Akkumulation von bestimmten Chemikalien die physiologischen Reaktionen der Fische erklärt werden? Wie eignen sich die angewandten Biomarker- und Monitoringmethoden zur Charakterisierung von Wirkungen des kommunalen Abwassers? Sind diese Techniken leicht einsetzbar? Wie relevant sind die Resultate in ökologischer Hinsicht? 2. Methoden 2.1. Probenahme Während der Expositionsstudie wurden zwei Probenahmen (nach 10 und 30 Tage) durchgeführt. Die Bachforellen wurden mit Tricaine-Methansulfonat betäubt und getötet. Für die gentoxische Untersuchung (Mikrokern Test) an Erythrozyten wurde Blut entnommen. Parallel dazu wurden Gewebeproben für histologische Untersuchungen und für die Stressproteinanalyse aus Kieme, Leber, Niere und Geschlechtsorganen entnommen und zunächst in Glutardialdehyd fixiert (histologische Studien) bzw. in flüssigem Stickstoff eingefroren (Stressproteinanalysen). Um eine chemische Analyse der Fischgewebe zu ermöglichen, wurden die restlichen Gewebe der Bachforellen eingefroren und im Labor bei - 80 C gelagert. 6

7 2.2. Mikrokern-Test Mit Hilfe des Mikrokern-Tests können gentoxische Einwirkungen identifiziert werden. Wird das genetische Material im Zellkern durch Strahlung oder Chemikalien beschädigt, entstehen während der Zellteilung durch Fehlfunktionen DNA- Fragmente, die nicht in die Tochterzellen transportiert werden, sondern im Cytoplasma bleiben. Diese DNA-Fragmente sind die sogenannten Mikrokerne (Al-Sabti & Metcalfe, 1995) (Abb. 3). Die zellkernhaltigen Erythrozyten von Fischen können aufgrund ihrer großen Anzahl sowie ihrer guten Anfärbbarkeit auch in kleinen Blutvolumina für ökotoxikologische Abbildung 3: Mikrokern in Döbelerythrocyten, gefärbt mit Giemsa-Lösung. Untersuchungen verwendet werden (Schnurstein, 2001). Dafür wird den Fischen nach der Betäubung Blut entnommen und auf einem Objektträger aufgetragen. Die Blutausstriche werden vor Ort in Methanol fixiert. Im Labor erfolgt die Färbung mit Giemsa Lösung, dadurch werden die Erythrocyten blau gefärbt und der Kern wird wesentlich stärker hervorgehoben als das umgebende Cytoplasma. So sind Mikrokerne im Cytoplasma neben dem normalen Kern relativ einfach zu erkennen. Die Auswertung des Mikrokerntests erfolgt unter dem Lichtmikroskop. Ein erhöhtes Auftreten von Zellen mit Mikronukleus weist darauf hin, dass die Umweltproben Fehlfunktionen bei der Zellteilung hervorrufen können (Böttcher & Hollert, 2005) Stressproteinanalyse Hitzeschockproteine haben eine hohe Bedeutung für das Überleben von Zellen und Organismen (Edington et al., 1989), da sie bei der korrekten Faltung anderer Proteine helfen und sie vor Denaturierung schützen. Die Hitzeschockproteine werden nach Molekulargewicht in Familien eingeteilt. Eine wichtige Familie ist die Hsp70-Familie. Die meisten Stressproteine in dieser Familie werden kontinuierlich synthetisiert, ihre Konzentration kann jedoch bei Belastung oder unter extremen Bedingungen zunehmen, dadurch ist es möglich, Stressreaktionen von Lebewesen nachzuweisen. Bei dieser Methode werden die Proteine nach Homogenisierung der Gewebeproben durch eine Gelelektrophorese nach Molekülgewicht getrennt. Die Proteine werden zunächst auf Nitrozellulose aufgetragen und mit spezifischen, an Hsp70 bindenden Antikörpern markiert und gefärbt. Nach Messung der Farbintensität ist es möglich, den Stressproteingehalt und damit die toxische Einwirkung und Schädigungen in den Geweben zu quantifizieren. 7

8 2.4. Histologie Durch eine histologische Untersuchung ausgewählter Organe ist es möglich, die von der Belastung verursachten strukturellen und funktionellen Veränderungen auf der Organebene bzw. auf zellulärer Ebene zu erforschen. Als erster Schritt werden die Proben in Glutardialdehyd fixiert. Die Fixierung dient vor allem der strukturellen Konservierung des natürlichen Gewebszustandes und verhindert die Autolyse. Nach vollzogener Fixierung folgt bei Kieme und Niere der Fische ein Entkalkungsschritt, danach werden die Proben in Paraffin eingebettet. Es werden zunächst mit dem Mikrotom Schnitte von 3-5 µm Dicke angefertigt und auf Objektträger aufgezogen. Die Proben werden im folgenden Schritt mit Hämatoxilyn- Eosin oder PAS (Periodic Acid Shiff) und Alcianblau angefärbt. So wird es möglich, eine optimale Darstellung zu erhalten und die zellulären Bestandteile zu differenzieren (Lammer, 2005). Nach der Färbung werden die Schnitte in Rothihistol eingedeckt. Die Bewertung der Gewebeschnitte erfolgt unter dem Lichtmikroskop durch eine mehrstufige Skala, wobei zelluläre Veränderungen wie auch entzündliche Veränderungen, Nekrosen, Zustand der Kapillaren, quantitative Verhältnis der im Organ vorkommenden Zelltypen, Vakuolen im Cytoplasma, Ablösung von Epithelien usw. betrachtet werden können. Auch Veränderungen der Gonaden, die Rückschlüsse auf endokrine Potentiale geben können, werden mit dieser Methode beurteilt Chemische Analyse der Fischgewebe Die Analyse von akkumulierenden Umweltschadstoffen in Lebewesen bietet eine Möglichkeit, Rückschlüsse auf die Art der toxischen Belastung zu geben, zusätzlich können auch biologische Daten ggf. leichter interpretiert werden. In den Geweben der exponierten Bachforellen wurde eine Reihe von relevanten chemischen Substanzen (Tab. 2) wie polyzyklische aromatische Kohlenhydrate (PAK), synthetische Duftstoffe, Desinfektionsmittelreste usw. quantifiziert. Die Messungen wurden im Auftrag an der Universität Stuttgart, Institut für Siedlungswasserbau, Wassergüte- und Abfallwirtschaft, Arbeitsgruppe Biologie und Organische Spurenanalytik durchgeführt. Tabelle 2: Vorkommen und Wirkung der analysierten Umweltschadstoffe. Stoff/Stoffgruppe Vorkommen Wirkung Polyzyklische aromatische Kohlenhydrate (PAKs) Galaxolide (HHCB) Tonalid (AHTN) Methyltriclosan (MTCS) Dichlordiphenyldichlorethen (DDE) Farbstoffe, Insektizide, Stabilisatoren, Weichmacher synthetische Duftstoffe Abbauprodukt des Desinfektionsmittels Triclosan Abbauprodukt des Pestizids DDT (nicht mehr im Einsatz, jedoch in der Umwelt persistent) 8 kanzerogen, erbschädigend kanzerogen Biozid, zytotoxisch kanzerogen, neurotoxisch, erbschädigend

9 2.6. Statistische Auswertung Die statistische Analyse wurde in SAS JMP 9.0 ausgeführt. Alle Daten wurden zuerst mittels Shapiro-Wilk Tests auf Normalverteilung untersucht. Im Fall einer Normalverteilung konnten parametrischen Tests wie der Tukey-Kramer Test verwendet werden. Bei nicht normal verteilten Werten wurden die Daten mittels Steel Dwass Methode (nichtparametrisch) analysiert. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Expositionen galten bei p<0,05 () als signifikant, bei p<0,01 als hochsignifikant () und bei p<0,001 () als höchstsignifikant. Die Graphen wurden in Sigma Plot 10.0 erstellt, signifikante Unterschiede wurden immer mit Sternen markiert. 3. Ergebnisse Es trat bereits nach eine 10 Tägige Exposition am Neckar eine deutlich erhöhte Mortalität bei den Bachforellen, die unterhalb des Kläranlagenablaufs exponiert waren, auf. Dies weist darauf hin, dass unterhalb der Kläranlage deutliche biologische Effekte zu erwarten sind Gentoxische Untersuchungen - der Mikrokern Test Für die Evaluierung der Blutausstriche wurden unter dem Mikroskop pro Fisch jeweils 1000 Zellen ausgewertet. Bei den exponierten Bachforellen ergab sich ein durchschnittlicher Mikrokernanateil von 0,3 bis 0,6% (Abb. 4). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Probestellen und der Kontrolle. Die Expositionszeit hatte ebenfalls keinen Einfluss auf das Entstehen von Mikrokernen. Alle Werte befanden sich im Kontrollbereich (vgl. Al-Sabti & Metcalfe, 1995). Im Gegensatz dazu wurden während der Studie im Jahr 2011 leichte gentoxische Potenziale bei Döbeln Anzahl von Mikrokerne (%) 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Abbildung 4: Anzahl der Mikrokerne in Blutzellen von Bachforellen des aktives Monitorings. aus dem Neckar gefunden (siehe vorheriger Abschlussbericht). Die bisherigen Ergebnisse weisen darauf hin, dass es gut möglich ist, dass gentoxische Effekte erst nach einer Langzeitbelastung, wie sie im Neckar lebende Fische erfahren, nachzuweisen sind. Plot 1 Negativkontrolle Oberhalb KA 10 Tage Oberhalb KA 30 Tage Unterhalb KA 10 Tage Unterhalb KA 30 Tage Exposition 9

10 3.2. Analyse des Stressproteins Hsp70 bei Bachforellen Es wurde der Stressproteingehalt in der Kieme, Niere, Leber und Gonade der Forellen untersucht, um proteotoxische Wirkungen zu identifizieren. Es wurde in den Kiemen (Abb. 5A) an beiden Probestellen schon nach 10 Tagen ein signifikanter Stressprotein-Anstieg im Vergleich zur Kontrolle detektiert. Dabei wurde unterhalb der Kläranlage eine stärkere Hsp70 Induktion nachgewiesen. Die Expositionszeit hatte ebenfalls einen Einfluss auf die Stressreaktion der Forellen: nach einem Anfangsanstieg nahm der Stressproteingehalt in der Kieme wieder ab. Die Niere (Abb. 5B) und Leber (Abb. 5C) der Fische zeigte eine ähnliche Reaktion auf Belastung. In den ersten 10 Tagen wurde keine, bzw. nur eine leichte (Leber) Stressproteininduktion nachgewiesen. Nach 30 Tagen ergab sich ein signifikant erhöhtes Hsp70-Level sowohl bei Tieren von ersten als auch der zweiten Probestelle. Unterhalb der Kläranlage wurde aber immer eine stärkere Antwort detektiert als oberhalb. Bei der Gonade (Abb. 5D) ergaben sich nur wenige Unterschiede zwischen den Expositionen. Die oberhalb der Kläranlage exponierten Tiere wiesen im Vergleich zur Kontrolle nach 10 Tage ein erhöhtes Stressprotein-Level auf. A Relativer Hsp70 Wert Kieme B 7 6 Relativer Hsp70 Wert Niere 1 1 C Relativer Hsp70 Wert Negativkontrolle Oberhalb KA 10 Tage Oberhalb KA 30 Tage Unterhalb KA 10 Tage Unterhalb KA 30 Tage Exposition Leber D Relativer Hsp70 Wert 0 Negativkontrolle Oberhalb KA 10 Tage Oberhalb KA 30 Tage Unterhalb KA 10 Tage Unterhalb KA 30 Tage Exposition Gonade 0 Negativkontrolle Oberhalb KA 10 Tage Oberhalb KA 30 Tage Unterhalb KA 10 Tage Unterhalb KA 30 Tage Exposition Negativkontrolle Oberhalb KA 10 Tage Oberhalb KA 30 Tage Unterhalb KA 10 Tage Unterhalb KA 30 Tage Exposition Abbildung 5: Relativer Stressprotein (Hsp70) - Level in der Kieme (A), Niere (B), Leber (C) und Gonade von Bachforellen des aktives Monitorings. 10 0

11 3.3. Histologie Der Zustand von Kieme, Niere und Leber wurde durch eine fünfstufige Skala bewertet, wobei die Bewertung 1 dem Kontrollzustand, 2-4 einem Reaktionszustand und 5 einem Destruktionszustand entsprach. Der Kieme der Fische ist ein besonders empfindliches Monitororgan. Es wird von Primär- und Sekundärlamellen aufgebaut, die Sekundärlamelle besteht aus Pflaster- (Epithel-), Pfeiler-, Chlorid- und Schleimzellen (Amin et al., 1992). Die im Neckar exponierte Bachforellen weisen vielfältige Effekte in den Kiemen auf: es wurden Fusionen von Sekundärlamellen, Hyperplasie (vermehrte Anzahl) von Pflasterzellen, Epithel-Lifting (Ablösung von Epithelzellen), Hypertrophie (Vergrößerung) und Hyperplasie von Schleimzellen und teilweise Nekrose (Zelltod) von Abbildung 6: Bewertung der Kieme von Bachforellen des aktives Monitorings. Chloridzellen beobachtet (Abb. 7). Sowohl unterhalb als auch oberhalb der Kläranlage befanden sich die Fische in einem Reaktionsstadium. Es ergaben sich signifikante Unterschiede zwischen den für 30 Tage unterhalb der Kläranlage exponierten Forellen und der Kontrolle (Abb. 6). Kontrolle Unterhalb der KA 10 Tage S A F Abbildung 7: Kieme einer Kontrolle (links) und einer unterhalb der Kläranlage 30 Tage lang exponierten Bachforelle. Die Pfeile zeigen Gewebeschädigungen wie Fusion (F), Schleim (S) und Ablösungen (A). 11

12 Die Fischniere besteht aus zwei Gewebetypen: das sogenannte hämatopoetische Gewebe ist für die Bildung von Blutzellen verantwortlich, während das aus den Nephronen aufgebaute Gewebe für die Ausscheidung sorgt. Die Nephrone sind aus zwei Hauptteilen aufgebaut: In der Bowmann-Kapsel wird das Blutplasma filtriert, im Tubulus (proximal und distal) werden Ionen und Flüssigkeit wieder rückresorbiert bzw. sezerniert (Takashima & Hibiya, 1995). Bei der Niere der exponierten Bachforellen wurden Entzündungen, starke Abbildung 8: Bewertung der Niere von Bachforellen des aktives Monitorings. Vakuolisierungen (Bildung von mit Membran umschlossene Räume in der Zelle), Nekrosen in den Tubuli, und Dilatierungen (Erweiterung) der Bowmann-Kapsel beobachtet (Abb. 9). Ähnlich wie bei der Kieme befanden sich die Neckar-Forellen in der Reaktionsphase, es wurden im Fall der 30-tägigen Exposition sowohl unter- als auch oberhalb der Kläranlage signifikante Unterschiede zur Kontrolle detektiert (8). Kontrolle Unterhalb der KA 30 Tage V GL NEK Abbildung 9: Histologische Schnitte von Niere einer Kontrolle (links) und einer unterhalb der Kläranlage 30 Tage lang exponierter Bachforelle. Die Pfeile zeigen Gewebeschädigungen wie Vakuolisierung (V), Nekrose (NEK) und dilatierte Glomeruli (GL). 12

13 Die Bausteine der Leber sind die Hepatozyten, die konzentrisch um die Blutkapillaren herum angeordnet sind. Die Hepatozyten haben eine wichtige Funktion in der Entgiftung, dem Protein-, Lipid- und Kohlenhydrat- Metabolismus, Speichern von Energiereserven (Fett und Glykogen) und in der Bildung von Galle (Takashima und Hibiya, 1995). Bei Stresseinflüssen können in der Leber diverse Veränderungen auftreten. Die im Neckar exponierten Forellen zeigten deutliche Schädigungen: es wurden Entzündungsherde, Abbildung 10: Bewertung der Leber von Bachforellen des aktives Monitorings. Veränderungen des Zellkerns, Nekrosen, dilatierte Kapillaren und verminderte Energiereserven beobachtet (11). Der Großteil der Tiere befand sich im Reaktionsstadium, die stärksten Veränderungen wurden jedoch bei den für 30 Tage unterhalb der Tübinger Kläranlage exponierten Fischen detektiert (Abb. 10). Kontrolle V Unterhalb der KA 30 Tage DK Z Abbildung 11: Leber einer Kontrolle (links) und einer unterhalb der Kläranlage 30 Tage lang exponierter Bachforelle. Die Pfeile zeigen Gewebeschädigungen wie Vakuolisierung (V), irreguläre Zellkerne (Z) und dilatierte Kapillare (DK). Die Evaluierung der Geschlechtsorgane erfolgte durch eine dreistufige Skala, wobei die Bewertung 1 unreifen, 2 intermediären und 3 reifen Gonaden entsprach. Der Hoden der Fische weist eine tubuläre Struktur auf. Es besteht hauptsächlich aus Bindegewebe, germinativem Epithel, Spermatogonien und Spermatocyten die Spermatiden und schließlich Spermien bilden (Abb. 12) (Takashima & Hibiya, 1995). 13

14 Das Ovar der Fische weist eine paarige Struktur auf und besteht aus Bindegewebe, germinativem Epithel, Oogonien und Oocyten (Eizellen). Die Oogonien bilden primären Oocyten, zunächst wird durch Reifung in die Oocyten Vitellogenin, Fett und Dotter eingelagert, auf diese Weise entstehen sekundäre Oocyten (Abb. 12). Die nicht abgelegten reifen Eierzellen werden abgebaut, schließlich werden die Nährstoffe von dem Körper wieder aufgenommen (Takashima & Hibiya, 1995). Eine Belastung durch Hormon-ähnliche Substanzen kann zu Mischgonaden (Abb. 12) (Spermien in der Eierstöcke oder Eierzellen in der spermatogene Gewebe) oder auch zu fortgeschrittener Reifestadien führen (Leino et al., 2005). Männliche Gonade Weibliche Gonade Mischgonade SG OG SC SP POC Abbildung 12: Unbeschädigte Männliche Gonade (links) mit Spermatogonien (SG) und Spermatocyten (SC), unbeschädigte weibliche Gonade (Mitte) mit Oogonium (OG) und primärem Oocyt (POC), Mischgonade (rechts) mit Spermien (SP) im Ovar. Die untersuchten Gonaden der Forellen zeigen keine Schädigungen oder Veränderungen, die Geschlechtsorgane waren kompakt. Im Falle der Hoden wiesen sowohl die oberhalb der Kläranlage exponierten (10 und 30 Tage) Tiere, als auch die Fische unterhalb der Kläranlageeinlauf (30 Tage) reifere Gewebe auf als die Negativkontrolle (Abb. 13A). Die Neckar-Forellen sind zwar 10, bzw. 30 Tage älter als die Fische, die als Negativkontrollen beprobt wurden, es ist aber nicht auszuschließen, dass die Reife-Unterschiede der Geschlechtsorgane durch androgene oder anti-östrogene Einflüsse entstanden sind. Die Eierstöcke wurden im Großteil mit unreif klassifiziert, es ergaben sich nur nach einer 30- tägigen Exposition oberhalb der Kläranlage Unterschiede zur Kontrolle (Abb. 13B). Bei dieser Gruppe wurde ein Individuum mit Mischgonade gefunden. Da alle andere Fische dieser Probestelle über unbeschädigte Geschlechtsorgane verfügten, kann dieses Phänomen eher durch Zufall erklärt werden. 14

15 Bewertung (%) A Unreif Intermediär Reif Bewertung (%) B Unreif Intermediär Reif Negativkontrolle Oberhalb KA. 10 Tage Oberhalb KA. 30 Tage Unterhalb KA. 10 Tage Unterhalb KA. 30 Tage Exposition 0 Negativkontrolle Oberhalb KA. 10 Tage Oberhalb KA. 30 Tage Unterhalb KA. 10 Tage Unterhalb KA. 30 Tage Exposition Abbildung 13: Histologische Bewertung der weiblichen (A) und männlichen (B) Geschlechtsorgane Chemische Analyse von akkumulierenden Umweltschadstoffe Die Gewebe der im Neckar exponierten Bachforellen wurden auf Umweltschadstoffe wie PAKs, Methyl-Triclosan, Tolanid, Galaxolide und Dichlordiphenyldichlorethen untersucht. Polyzyklische Aromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs) sind eine vielfältige Stoffgruppe aromatischer Verbindungen, die aus zwei bis sieben Kohlenwasserstoffringen aufgebaut sind. PAKs entstehen als Nebenprodukte bei der unvollständigen Verbrennung oder starkem Erhitzen von organischen Materialien. Diese Substanzen können in Koks, Teer, Benzinen, Wachsen oder Ölen und durch deren weitere Bearbeitung in Weichmachern, Gummi und Kunststoffen vorkommen. PAKs sind persistent in der Umwelt, lösen sich gut in Fett und können sich dadurch gut in Organismen anreichern. Ein Großteil der PAKs verfügen über krebserregende, mutagene und/oder erbschädigende Eigenschaften (UBA, 2012). Die im Neckar exponierten Bachforellen wurden auf die folgenden 16 PAKs hin untersucht: Napthalin (NAP) Benz[a]anthracen (BA) Acenaphthen (ACE) Chrysen (CHR) Acenaphthylen (ACY) Benzo[b]fluoranthen (BBF) Fluoren (FL) Benzo[k]fluoranthen (BKF) Phenanthren (PHE) BAP: Benzo[a]pyren (BAP) Anthracen (ANT) Indeno[123-cd]pyren (IND) Fluoranthen (FLU) Benzo[ghi]perylen (GHI) Pyren (PYR) Dibenzo[ah]anthracen (DBA) 15

16 In Geweben der Fische (Restkörper nach Entnahme der Proben für Biomarkerstudien: Kopf, Muskulatur, innere Organe) wurden PAKs im µg/kg-bereich (bezogen auf Trockengewicht) detektiert (Abb. 14). Bei dem Großteil der Substanzen wurde nach 30 Tagen eine höhere Konzentration gemessen, als nach 10 Tagen. Unterhalb der Kläranlage wurden signifikant höhere Konzentrationen von Anthracen (10 Tage), Pyren (30 Tage), Benz[a]anthracen (10 und 30 Tage) und Chrysen (10 und 30 Tage) nachgewiesen als oberhalb. Zwölf von sechszehn PAKs zeigten ähnliche Akkumulationsraten an den zwei Probestellen. Log Konzentration (µg/kg Trockengeweicht) ,1 0,01 NAP ACE ACY FL PHE ANT FLU PYR BA CHR BBF BKF BAP IND GHI DBA Polyzyklische Aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) Oberhalb der KA 10 Tage Oberhalb der KA 30 Tage Unterhalb der KA 10 Tage Unterhalb der KA 30 Tage Abbildung 14: Konzentration (logarithmierte Skala) von 16 polyzyklischen aromatischen Kohlenhydraten in den Geweben von im Neckar exponierten Bachforellen. Außer PAKs wurden die Forellengewebe auf zwei synthetische Duftstoffe, Galaxolide (HHCB) und Tolanid (AHTN), untersucht. Diese Chemikalien gehören zur polyzyklischen Moschusverbindungen und werden zum Beispiel in Seife, Shampoo, Kosmetika, Wasch- und Reinigungsmitteln verwendet. Aufgrund der umfangreichen Anwendung im Haushaltsbereich gelangen diese Stoffe ins kommunale Abwasser und dadurch in Oberflächengewässer. Diese Substanzen sind biologisch schlecht abbaubar und weisen eine hohe Anreicherung in Lebewesen auf (IKSR, 2009). Erwartungsgemäß traten HHCB und AHTN bei der unterhalb der Kläranlage exponierten Fischen mit wesentlich erhöhten Konzentrationen auf (Abb. 15). Interessanterweise wurde schon nach 10 Tagen ein deutlicher Unterschied bezüglich der Akkumulierung dieser Stoffe festgestellt. 16

17 Log Konzentration (µg/kg Trockengewicht) HHCB AHTN MTCS DDE Substanz Oberhalb der KA 10 Tage Oberhalb der KA 30 Tage Unterhalb der KA 10 Tage Unterhalb der KA 30 Tage Abbildung 15: Bioakkumulation von Galaxolide (HHCB) und Tolanid (AHTN), Methyltriclosan (MTCS) und Dichlordiphenyldichlorethen (DDE) in Geweben der im Neckar exponierten Bachforellen. Methyltriclosan (MTCS), ein Abbauprodukt des Desinfektionsmittels Triclosan, ist eine weitere persistente Verbindung, die durch kommunales Abwasser in die Umwelt gelangt und in Lebewesen akkumuliert. Bisherige ökotoxikologische Studien deuten auf eine zytotoxische Wirkung hin, jedoch fehlen Informationen bezüglich der chronischen Effekte dieser Substanz (UBA, 2004). Die im Neckar exponierten Forellen wiesen in ihren Geweben einen MTCS Gehalt von 6-21 µg/kg auf. Unterhalb der Kläranlage wurde bereits nach 10 Tagen ein bis zu 3 fach erhöhte MTCS-Level detektiert (Abb. 15). Im Gegensatz zu MTCS wurden bei Dichlordiphenyldichlorethen (DDE) keine Unterschiede zwischen unterhalb und oberhalb der Kläranlage festgestellt (Abb. 15). Diese Substanz ist ein Derivat von Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT), ein Insektizid, das seit Anfang der 1940er- Jahre als Kontakt- und Fraßgift eingesetzt wurde. Aufgrund seiner hohen mutagenen, erbschädigenden und krebserregenden Eigenschaften wurde DDT in der 70-er Jahren in den meisten Ländern verboten. Da dieser Substanz sehr schwer abbaubar und gut fettlöslich ist, werden DDT und seine Abbauprodukte, wie DDE, bis heute in der Umwelt und in Geweben von Organismen ubiquitär detektiert (US EPA, 2011). 17

18 4. Diskussion Im vorliegenden Forschungsvorhaben wurden Biomarkeruntersuchungen im Rahmen eines aktiven Monitorings am Neckar mit chemischen Analysen von Spurenstoffen kombiniert, um umweltrelevante Aussagen über den Einfluss der Tübinger Kläranlage auf die Fischgesundheit treffen zu können, und eine Erklärung zu finden, warum unterhalb der Kläranlage nur noch wenige Fische vorkommen. Die Ergebnisse der Effektstudien lieferten detaillierte Informationen über physiologische Reaktionen der im Neckar exponierten Bachforellen. Generell konnten an beiden Probestellen toxische Wirkungen erfasst werden, es wurden jedoch bei den unterhalb der Kläranlage exponierten Fischen immer stärkere Gesundheitsschäden detektiert, was einen eindeutigen Hinweis auf negative Auswirkungen des Kläranlageeinlaufs auf die Gesundheit der Fische liefert. Es wurde in der Kieme, Leber und Niere der Fische als ein Zeichen von Proteotoxizität ein verändertes Stressprotein-Level nachgewiesen. Bei diesen Organen wurden durch histopathologische Methoden ebenfalls Schädigungen auf Zell- und Gewebe-Ebene erfasst; die untersuchten Tiere befanden sich im Reaktionszustand. In den Geschlechtsorganen dagegen konnten keine Stressreaktionen oder Veränderungen nachgewiesen werden. Die im Vergleich zur Negativkontrolle weiter entwickelte Gonaden der männlichen Fische können entweder durch den Altersunterschied der Tiere erklärt oder auch als Reaktion auf hormonähnlich wirkende Stoffe interpretiert werden. Die verschiedenen Monitororgane der Bachforellen wiesen eine unterschiedliche Reaktionszeit in der Antwort auf Belastung auf. Die Kieme der Fische reagiert meistens sehr schnell auf der Präsenz von Umweltchemikalien aufgrund ihrem direkte Kontakt mit der äußeren Umgebung (Yoo & Janz, 2003), während die Leber und Niere meistens eine verzögerte Antwort auf Stress zeigen. Während des aktiven Monitorings konnten in der Regel nach einer 30-Tägigen Exposition deutlichere Effekte nachgewiesen werden als nach 10 Tage. Parallel zu den biologischen Daten wurde in der Gewebe der Forellen eine Reihe von persistenten Stoffen im µg/kg Bereich nachgewiesen. Die Resultate der chemischen Analyse spiegeln die Ergebnisse der Biomarkertests wieder: die aquatischen Organismen sind sowohl ober- als auch unterhalb der Tübinger Kläranlage einer Belastung durch Umweltchemikalien ausgesetzt, jedoch stellt die Kläranlage eine zusätzliche toxische Eintragsquelle dar. Es wurden 4 (ANT, PYR, BA, CHR) von 16 PAKs, HHCB, AHTN und MTCS mit erhöhten Konzentrationen bei den Forellen unterhalb der Kläranlage detektiert. Es ist bekannt, dass die oben genannten Chemikalien bei Lebewesen vielfältige Schädigungen hervorrufen können: PAKs sind seit lange als akkumulierende und gesundheitsschädliche Substanzen bekannt. Ökotoxikologische Studien haben zum Beispiel gezeigt, dass durch eine Langzeitbelastung im unteren µg/l Konzentrationsbereich mutagene, kanzerogene und erbschädigende Wirkungen bei Fischen auftreten können (LUBW, 1997). Für die zwei synthetischen Duftstoffe wurden in einem 35-tägigen Entwicklungstest mit Dickkopfelritzen bei einer Konzentration von 35 µg/l (AHTN) und 68 µg/l (HHCB) teratogene Effekte detektiert (Balk & Ford, 1999). Im Fall von Methyltriclosan sind ab einer Konzentration von 38,4 µg/l akute Effekte bei Fischen zu 18

19 erwarten (UBA, 2004). Von daher spielen diese Stoffe mit großer Wahrscheinlichkeit eine Rolle für den schlechteren Gesundheitszustand der unterhalb der Kläranlage exponierten Tiere. In Geweben von Freilandfischen (Döbel und Schneider) des relativ unbelastetes Bodenseezuflusses Argen wurden PAKs wie Anthracen, Pyren und Fluoranthen mit eine Konzentration von 5 µg/kg detektiert. Bei Döbeln und Schneidern aus der Schussen, einem weiteren Zufluss des Bodensees, kamen oberhalb der örtlichen Kläranlage die drei zuvor genannten PAKs in Konzentrationen von 5-10 µg/kg vor, während unterhalb der Kläranlage PAKs in Konzentrationen von 5-13 µg/kg im Fischgewebe nachgewiesen wurden. Bei den 30 Tage lang exponierten Neckarforellen lagen die Werte für diese Chemikalien zwischen 5 und 10 µg/kg. Im Fall von DDE konnten bei den Fischen aus Neckar und Argen ähnliche Konzentrationen gemessen werden (untere µg/kg Bereich), als Vergleich, bei der Tiere der Schussen lagen die DDE-Werte zwischen 10 und 64 µg/kg (nicht publizierte Daten des Projekts Schussen Aktivplus). Synthetische Duftstoffe wurden zum Beispiel bei Forellen aus einem Gewässer mit 50%igem Kläranlagen-Abwasseranteil in Konzentrationen von µg/kg (Trockengewicht) gemessen (IKSR, 2009), bei den Neckarforellen, die unterhalb der Kläranlage für 30 Tage exponiert waren, lagen die Werte für HHCB zwischen 1800 und 2300 µg/kg, für AHTN zwischen 190 und 280 µg/kg. Eine Zusammenfassung der während dem aktiven Monitoring angewandten Methoden und ihre Resultate stellt die Tabelle 3 dar. Tabelle 3: In der Expositionsstudie angewandten Methoden und ihre Aussagen über die Belastungsverhältnisse ober- und unterhalb der Kläranlage Tübingen. Methode Aussage Mortalität Erhöhte Mortalität unterhalb der KA bereits nach eine 10 Tägige Exposition Mikrokern Test Kein Hinweis für Genotoxizitat Stressproteinanalyse Histopathologie Chemische Analyse Evidenz für proteotoxischen Wirkungen an beiden Stellen bereits nach 10 Tage, stärkere Reaktionen unterhalb der KA Schädigungen in der Leber, Kieme und Niere der exponierten Forellen, unterhalb der KA mehr prominent Persistente akkumulierende Schadstoffe an beiden Stellen anwesend, teilweise erhöht unterhalb der KA Mit Hilfe der Erkenntnisse über im Neckar vorkommende Umweltchemikalien können die durch Biomarker detektierten Reaktionen der Organismen plausibler interpretiert werden. Direkte kausale Zusammenhänge sind jedoch nicht zu erstellen, da durch die Analytik zum einen nur ein Bruchteil der im Neckar vorhandenen Substanzen untersucht werden konnte, und außerdem keinerlei Informationen über die Mischtoxizitätswirkungen der vorkommenden Schadstoffe vorliegen. 19

20 5. Fazit Durch die vorliegende Studie wurden die folgenden Fragen beantwortet: Wie stark ist die Einfluss des Klärwassers der Kläranlage Tübingen auf den Gesundheitszustand der Fische? Kann man erklären, weshalb im Neckar unterhalb der Kläranlage nur noch sehr wenige Fische leben? Durch das aktive Monitoring mit Bachforellen konnte gezeigt werden, dass eine Exposition unterhalb der Kläranlage vielfältige toxische Effekte und eine erhöhte Mortalität bei Fischen hervorrufen kann. Es ist plausibel, dass der Eintrag von Umweltchemikalien an dieser Stelle einen zusätzlichen Stressfaktor für die Freilandfische darstellt und zu einem verringertem Vorkommen führt. Wie starke Unterschiede gibt es zwischen eine kurz- und eine mittelfristige Exposition? Unsere Studie hat gezeigt, dass bereits eine 10- tägige Exposition am Neckar erhöhte Mortalität, proteotoxische und zahlreiche histopathologisch messbare Wirkungen bei Fischen verursachen kann. Eine 30- tägige Exposition lieferte jedoch genauere und mehr ausgeprägte Informationen über die Belastungsbedingungen. Aus diesem Grund wird für aktives Monitoring eher eine mittelfristige Testdauer empfohlen. Welche zusätzlichen Informationen zur biologischen Daten erbringen chemische Analysen von akkumulierenden Schadstoffe? Können durch die Präsenz/Akkumulation von bestimmten Chemikalien die physiologischen Reaktionen der Fische erklärt werden? Es wurde durch die Bioakkumulationsuntersuchungen gezeigt, dass im Neckar bei Tübingen diverse Umweltchemikalien nachzuweisen sind, die sich auf die Fischgesundheit negativ auswirken können. Es ist zwar nicht möglich, die physiologische Reaktionen der Tiere durch die Präsenz von einzelnen Chemikalien direkt zu erklären, man kann aber davon ausgehen, dass diese Stoffe diverse Störungen wie zum Beispiel Kieme-, Leber-, und Nierenschäden oder ein erhöhtes Stressprotein-Level bei Fischen hervorrufen können. 20

21 Wie eignen sich die angewandten Biomarker- und Monitoringmethoden zur Charakterisierung von Effekten des kommunalen Abwassers. Sind diese Techniken leicht einsetzbar? Wie relevant sind die Resultate in der ökologischen Hinsicht? Die in der vorliegenden Arbeit angewandten Methoden erwiesen sich als äußerst effektive Werkzeuge um den Gesundheitszustand von Fischen zu charakterisieren. Durch die eingesetzte Biomarkerpalette in Kombination mit chemisch-analytischen nachweisen von Spurenstoffen war es möglich, Aussagen über die ökologische Konsequenzen des Eintrages toxischer Stoffe über kommunales Abwasser zu treffen. Die vorliegende Untersuchung kann als Modellstudie betrachtet werden; der Einsatz des aktiven Monitorings in Kombination mit einem passiven Monitoring ist für die Charakterisierung aquatischer Lebensräume und die Identifizierung von Eintragsquellen auf jedem Fall empfehlenswert. 6. Ausblick Das aktive Monitoring bot die Gelegenheit, der Frage der unterhalb der Tübinger Kläranlage teilweise geringen Fanganzahlen auf den Grund zu gehen. Es ist zu betonen, dass ähnliche Monitoringprojekte im Freiland eher selten durchgeführt werden. Aus diesem Grunde kommt der vorliegenden Arbeit auch eine hohe wissenschaftliche Bedeutung mit Praxisrelevanz zu. Im Jahr 2014 endet das Neckarprojekt. Seine Ergebnisse lassen die Frage aufkommen, wie man die Wasserqualität am Neckar bei Tübingen verbessern könnte. Es wäre auf jedem Fall empfehlenswert, die lokalen Kläranlagen mit zusätzlichen Reinigungsstufen auszustatten und die direkten Einträge von urbanen Regen- und Abwasser durch die Regenüberlaufbecken in diese Region zu minimieren. 21

22 7. Literatur Al-Sabti, K. & Metcalfe, C.D. (1995): Fish micronuclei for assessing genotoxicity in water. Mutation Research 343: Amin, A. B., Mortensen, L., Poppe, T. (1992): Histology Atlas. Normal structure of Salmonids. Offset Nord AS, First Edition Balk, F., Ford, R.A. (1999): Environmental risk assessment for the polycyclic musks, AHTN and HHCB. II. Effect assessment and risk characterisation. Toxicology Letters 111:81-94 Böttcher, M., Hollert, H. (2005): Mikrotucleus-Test mit RTL-W1-Zellen und Fischerytrocyten. SOP Aquatische Ökologie und Toxikologie, Institut für Zoologie, Universität Heidelberg Edington, B.V., Whelan, S.A., Hightower, L.E. (1989): Inhibition of heat shock (stress) protein induction by deuterium oxide and glycerol: additional support for the abnormal protein hypothesis of induction. Journal of Cell Physiology 139: IKONE, (Integrierende Konzeption Neckar-Einzugsgebiet) (2003): Gütezustand der Fließgewässer im Neckar-Einzugsgebiet, Gewässerdirektion Neckar IKSR, (Internationale Kommission zum Schutz des Rheins) (2009): Auswertungsbericht Duftstoffe Lammer, E. (2005): Histologie: Erstellung von Paraffinschnitte. SOP, Aquatische Ökologie und Toxikologie, Institut für Zoologie, Universität Heidelberg LUBW (Landesanstalt für Umweltschutz Baden-Württemberg) (1997): Stoffverhalten von glaswerkspezifischen PAK, Peakall, D.W. (1994): Biomarkers, the way forward in environmental assessment. Toxicology and Ecotoxicology News 1:55-60 Schnurstein, A. (2001): Untersuchungen zur Genotoxizität in Fischen und Fischzellen mit der Einzelzell-Gelelektrophorese (Comet Assay) - Möglichkeiten und Grenzen im Umweltmonitoring. Dissertation an der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät, Heidelberg 22

23 UBA (Umwelt Bundes Amt) (2012): Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe- Umweltschädlich! Giftig! Unvermeidbar? UBA (Umwelt Bundes Amt) (2004): Retrospektives Monitoring von Triclosan und Methyl- Triclosan in Brassenmuskulaturproben der Umweltprobenbank US EPA (U.S. Environmental Protection Agency) (2011): DDT Takashima, F., & Hibiya, T. (1995): An Atlas of Fish Histology, Normal and Pathological Features. Kodansha Ltd. Second Edition Yoo, J. L., Janz, D. M. (2003): Tissue-Specific HSP70 Levels and Reproductive Physiological Responses in Fishes Inhabiting a Metal-Contaminated Creek Archives of Environmental Contamination and Toxicology