müssten sich per Definition «Reinstwasser» und «Kontamination» gegenseitig ausschliessen.
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- Nadja Brinkerhoff
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1 3 2 CHEMIE PLUS r e i n r a u m / G x P C O N TA M I N A TI O N C O N TR O L Ablagerungen in Reinstwassersystemen Selbst bei gutem Hygienemanagement kann es in Reinraumanlagen zu Kontaminationen kommen. An einer Tagung der Enzler Hygiene AG zum Thema «Contamination Control in der Praxis» erläuterten Experten, wie ein gutes Hygienemanagement aussieht und welche Gesichter eine Kontamination in Wasserleitungssystemen haben können. Lösungen, was im Ernstfall zu tun ist und vor allem wie man die lästigen Kontaminationen wieder eliminieren kann, wurden aufgezeigt. K S O N J A B I C H S E L - K Ä S E R ontaminationen in Reinräumen sind gefürchtet, da sie zu Produktionsunterbrüchen, ausführlichen Ursachenabklärungen und im schlimmsten Fall zu Produktrückrufen führen können. Das Positive daran ist jedoch, dass sie sich durch gutes Hygienemanagement dazu gehören Reinigung, Desinfektion und Hygienemonitoring kontrollieren lassen. An einer Tagung der Enzler Hygiene AG zum Thema «Contamination Control in der Praxis» erläuterten Experten den Teilnehmern, wie ein gutes Hygienemanagement aussieht und welche Gesichter Kontaminationen in Wasserleitungssystemen haben können. In den Fachreferaten erhielten die Besucher einen vertieften Einblick in die Welt der Mikroorganismen und das Phänomen des Rougings an Edelstahl. In zusätzlichen Seminaren in Kleingruppen bot sich die Gelegenheit, mit Experten direkt zu diskutieren und eigene Fragen zu klären. Die Sachverständigen stammten selbst aus Fachbereichen der Enzler Gruppe, dazu gehören Enzler Hygiene AG, Beratherm AG und Enzler Reinigungen AG. Im Falle einer gröberen mikrobiellen Kontamination im Reinraum ist es oft notwendig, einen Profi zu Hilfe zu holen. Neben der Reinigung bietet die Enzler Gruppe z. B. Raumbegasungen mit H 2O 2 an, welche Mikroorganismen zuverlässig eliminieren. Die Methode ist, so Referent Christoph Rockel von der Enzler Hygiene AG, «sehr effektiv und wirksam gegen alle Mikroorganismen und deren Sporen.» Die oxidative Kraft von H 2O 2 ist wohlbekannt und lässt viele Kunden zweifeln, ob denn die Oberflächen im Reinraum von Wasserstoffperoxid nicht angegriffen werden. «Es gibt eine lange Liste mit Materialien, für welche die Verträglichkeit bestätigt ist. Selbst Elektronik wie Computer oder Tablets nehmen keinen Schaden Biofilmbildung findet in 5 Schritten statt: 1. Initiales Anheften, 2. Irreversibles Anheften, 3. Reifestadium I, 4. Reifestadium II, 5. Dispersion. Zu den jeweiligen Stadien sind Mikroskopie-Aufnahmen eines wachsenden Pseudomonas aeruginosa Biofilm abgebildet. (Bild: Wikimedia) bei der fachgerechten Durchführung», so Rockel. Wenn also sämtliche Reinigung und Desinfektion versagt, ist die Begasung mit H 2O 2 eine optimale Lösung zur Oberflächensterilisation, um langfristige Schäden zu verhindern. Überlebenskünstler Die Mikrobiologie spielt in Reinraumsystemen aber noch an anderer Stelle eine wichtige Rolle. Nicht nur Oberflächen und Luft, auch Reinstwassersysteme können von Kontaminationen betroffen sein. Eigentlich müssten sich per Definition «Reinstwasser» und «Kontamination» gegenseitig ausschliessen. Denn Reinstwasser wird aufwendig hergestellt: Methoden wie Ultrafiltration, Ionenaustausch, Sterilfiltration, UV-Entkeimung werden verwendet, um Wasser aufzureinigen und möglichst keimfrei zu machen. Gastreferent Prof. Dr. Hans-Curt Fleming von der Universität Duisburg Essen ernüchtert all jene, die der Technik blind vertrauen: «Mikroorganismen sind über 3 Mio. Jahre alt. Wenn jemand weiss, wie man in lebensunfreundlichem Terrain überlebt, dann sie.» Die einfachste Strategie gegen Filterbarrieren ist die Reduktion der Grösse. Genau das machen die Ultramikrobakterien wie Vibrio- Arten oder Minibacterium massiliensis: Bei Nährstoffmangel schrumpfen sie auf eine Grösse von <0,2 μm, das heisst, sie passen problemlos durch einen gängigen 2 μm Filter, auch als Sterilfilter bekannt. Bei günstigeren Konditionen nehmen sie ihre normale Grösse und Teilungsaktivität wieder auf. Hier wird klar: Auch beste Technik bringt keine hundertprozentige Sicherheit und der Begriff Sterilfiltration sollte nicht zu wörtlich genommen werden.
2 r e i n r a u m / G x P CHEMIE PLUS Rostbildung ausgehend von einer Schweissnaht (Bild Beratherm AG) Beispiele von Rouging und Blacking an Edelstahl. Schweissnähte sind oft Ausgangspunkte von Anlauffarben und anschliessendem Blacking oder Rouging. Die Rougingbeläge lassen sich mit grossem Erfolg beseitigen (E, B). (Bild S. Bichsel, mit freundlicher Genehmigung der Beratherm AG) Mikroorganismen kommen also über Passage durch die Aufbereitung ins Verteilsystem. Weiterhin treten Kontamination von Werkstoffen bei der Produktion, oder bei Montage und Wartung durch Personal auf. Perfiderweise kann eine Kontamination sogar durch Desinfektion entstehen, wenn nämlich das Desinfektionsmittel resistente Keime enthält oder, wenn einfach eine undichte Stelle zu einem nicht-sterilen System besteht. Wie aber überleben Zellen in Reinstwasser? Bereits geringe Konzentrationen von organischem Kohlenstoff von 10 μg/l dienen als Nährstoffquelle. Dabei überleben die meisten Bakterien zwar, vermehren sich aber aufgrund des schlechten Angebots nicht. «Die meisten Bakterien der Welt hungern», scherzt Flemming, «deshalb haben sie besondere Überlebensstrategien entwickelt.» Tatsächlich lebt die Hauptmenge der Mikroorganismen in Reinstwassersystemen in einer Gemeinschaft: dem Biofilm. Eine Schicht aus gelartigen Polysacchariden und Proteinen dient der Anheftung an eine glatte Oberfläche. Darin werden Nährstoff-Spuren durch Sorptionseigenschaften akkumuliert. Zellen, die darin leben, erhalten somit Nahrung und gleichzeitig Schutz vor Bioziden. Weiterer Vorteil: Bei hoher Zelldichte kann horizontaler Gentransfer stattfinden. Dabei können u. a. Resistenzen oder andere Eigenschaften von einer Zelle zur nächsten ohne Zellteilung weitergegeben werden. Für das Hygienemonitoring berücksichtigen muss man, dass Bakterien in der Hungerphase apathogen sein können, später aber in den pathogenen Zustand zurückkehren können. Wer misst, misst Mist Die vermeintlichen Nachweise für Mikroorganismen sind limitiert. Mikrobiologisches Monitoring umfasst in der Regel Kultivierung und anschliessende Auszählung. Goldstandard sind z. B. Abklatschtests. Diese standardisierten Verfahren geben einen Einblick über die Anzahl Zellen, welche zur Teilung befähigt sind. «Das ist sehr eng betrachtet», kritisiert Experte Flemming. Tatsächlich gibt es nicht nur zur Teilung befähigte Zellen, sondern auch Zellen im Ruhestadium (z. B. Sporen), welche erst unter für sie günstigen Bedingungen wieder auswachsen. Daneben ist das Wachstum auf Abklatschplatten meist den Organismen vorbehalten, welche bei der vorgegebenen Inkubationsdauer und -temperatur und auf dem gewählten Medium wachsen. Die Vielzahl anderer Keime wird gar nicht berücksichtigt. Für die mikrobiologische Kontrolle von Wasser ist das Testsystem ähnlich limitiert. Geht es darum, Übeltäter für eine Kontamination aufzuspüren, muss man einfach daran denken, dass nicht nur die in Standard- Verfahren kultivierbaren Mikroorganismen als Kandidaten infrage kommen. Eine besser geeignete Analyse ist gemäss Flemming die Bestimmung der absoluten Anzahl Zellen. Dabei werden auch die Zellen im VBNC Stadium (siehe Kasten) erfasst. Flemmings Methode arbeitet nach einem «Live/Dead-System»: Mit zwei fluoreszierenden Farbstoffen wird die Integrität der Zellmembran getestet. Zellen mit intakter Membran (live) nehmen den grün leuchtenden Farbstoff (Syto 9) aktiv auf. Daneben werden die Zellen mit beschädigter Membran (dead) nur den roten Farbstoff (Propidiumiodid) aufnehmen. Die Farben treten
3 3 4 CHEMIE PLUS r e i n r a u m / G x P Oberflächenveränderungen von nichtrostendem Stahl Passivierung: Unter Passivierung wird in der Oberflächentechnik die spontane Entstehung oder die gezielte Erzeugung eines Schutzfilmes verstanden, welche die Korrosion des metallischen Werkstoffs praktisch verhindert. Erzeugter Passivfilm: Bei vielen Metallen wird die Passivierungsschicht durch ein definiertes Verfahren technisch erzeugt. Dabei wird die Oberfläche behandelt und beschichtet, wie zum Beispiel beim Verzinken von Stahl oder Eloxieren von Aluminium, sowie bei der Dickschichtpassivierung von Zinkschichten. Spontaner Passivfilm: Eine der bekanntesten technischen Bedeutungen dieses Phänomens hat der Einsatz von nichtrostenden CrNi(Mo) Stählen, die überwiegend in Anlagen der Chemie- und Pharmaindustrie verwendet werden. Ursache dieser Passivität ist das Legierungselement Chrom, welches im nichtrostenden Stahl mit einem Massenanteil von mindestens 13 % enthalten sein muss, damit sich auf der Oberfläche ein entsprechender Passivfilm ausbilden kann. Dieser Passivfilm bildet sich in natürlicher Umgebung spontan (deswegen nichtrostende Stähle) und steht mit ihr im thermodynamischen Gleichgewicht. Demzufolge kann ein Passivfilm an Fehlstellen oder in einer entsprechend aggressiven Umgebung soweit abgebaut werden, dass es zu Korrosionserscheinungen kommen kann. Er kann aber andererseits durch eine definierte Behandlung, wie z. B. chemische Reinigung, soweit optimiert werden, dass er wieder den ihm zugedachten wirkungsvollen Korrosionsschutz darstellt. Rouging: Als Rouging bezeichnet man Veränderungen und Schädigungen in der Passivschicht von Edelstahl unter hohen Temperaturen (>60 C), in der Regel unter Verbindung mit Reinstwasser. Rouging macht sich mit einem rotbraunen (oder anders gefärbten) meist abwischbaren Belag auf der Metalloberfläche bemerkbar. Die schützende Passivschicht von Edelstahl steht in einem dynamischen chemischen Gleichgewicht mit der Umgebung. Durch höhere Temperaturen wird dieses Gleichgewicht gestört und führt auf Kosten des Chromoxidanteils zu einer verstärkten Bildung von Eisenoxid. Ungenügende Passivierung, unsachgemässe Schweissnähte und/oder minderwertiges Material bzw. Oberflächenausführung können darüber hinaus die Entstehung von Rouge weiter begünstigen. Blacking: Als Blacking werden sehr stabile schwarze Beläge aus Magnetit (Fe3O4) bezeichnet, die in Reinstdampfsystemen ab 100 C auftreten. Ihre Morphologie ist unterschiedlich. Mit zunehmender Expositionszeit bauen sich kristalline Oberflächen auf, welche teilweise abwischbar sind und permanent Partikel in den Dampfstrom freisetzen können. Lochkorrosion: Früher auch Lochfrasskorrosion oder Lochfrass genant, beschreibt klein erscheinende Korrosionsstellen in der Oberfläche von passivierbaren Metallen. Am bekanntesten ist die durch chloridhaltige Elektrolyte induzierte Lochkorrosion an nichtrostenden CrNi(Mo)- Stählen, welche überwiegend in der Chemie- und Pharmaindustrie eingesetzt werden. Lochkorrosion basiert auf einem elektrochemischen Korrosionsmechanismus und ist gekennzeichnet durch die Ausbildung eines anodischen und eines kathodischen Bereichs. Der anodische Bereich (der Ort, an dem die Korrosion stattfindet), bildet sich an Schwachstellen im Passivfilm, der kathodische Bereich erstreckt sich über die intakte passive Oberfläche. Als treibende Kräfte wirken einmal die Potentialdifferenz zwischen Kathode und Anode («Elektro-Teil»), wobei sich durch ungünstige Flächenverhältnisse ein beschleunigter Ablauf ergeben kann und zum anderen die Überführung von Chloridionen ins bereits gebildete Loch sowie die dortige Hydrolyse von Metallchloriden («Chemie- Teil»). Durch die Aufkonzentration der Chloridionen im Loch und durch den sinkenden ph-wert infolge der Hydrolyse verschiebt sich das anodische Potential zu ungünstigeren Werten, wodurch sich letztendlich ein autokatalytischer Korrosionsprozess stabilisieren kann. jeweils im Fluoreszenzmikroskop in Erscheinung. Die Anzahl rot und grün markierter Zellen wird nach dem Färben mittels Durchflusszytometrie erfasst. Weitere Methoden zur Bestimmung von lebenden Zellen ist die Analyse der Proteinsynthese mittels Färbung der ribosomalen RNA (Fluoreszenz In Situ Hybridisierung FISH) oder die Analyse der intakten polaren Membranlipide mittels HPLC. Bei immer wiederkehrender Kontamination sind häufig wiederbelebte VBNC Organismen die Auslöser. Deshalb ist es wichtig, auch diese Organismen im Auge zu behalten, rät Flemming. Leider gibt es keine Standardmethoden für die Bestimmung von VBNC Zellen, Vitalitätsfaktoren können aber mit Labormethoden bestimmt werden. Das Problem bei kulturunabhängigen Verfahren sind die um ein Vielfaches höheren Befunde, welche erschrecken können. Der Experte rät, neu installierte Anlagenteile wenn möglich mit Chlor zu behandeln. ( mg/l freies Chlor). Bereits etablierte Biofilme lassen sich nur schwer entfernen. Dazu sind mindestens mg/l Chlor notwendig. Allerdings bedeutet Abtötung nicht Reinigung! Zellen sterben zwar, der Film bleibt aber bestehen und darauf Rouging und De-Rouging: Hier am Beispiel einer Zentrifugalpumpe (Bild: Beratherm AG)
4 siedeln sich neue Zellen an. Leitungen müssten daher auch mechanisch gereinigt werden. Die häufig angewendete H 2O 2- Behandlung von Wassersystemen sieht Flemming als wenig wirksam an, selbst in Konzentrationen von 1 %! Biofilme sind sehr resistent und puffern vieles ab. Denn Mikroorganismen verfügen über verschiedene Enzyme, wie z. B. Katalasen, mit denen Sie ungünstige ph-werte oder Oxidationsmittel neutralisieren. Edelstahl im roten Kleid Ein weiteres Phänomen in Reinstwasserleitungen ist weniger biologisch, sondern mehr chemisch-physikalisch begründet. Zwar werden für diese Wasserleitungen bevorzugt hochqualitativer, nichtrostender Stahl eingesetzt. Jedoch findet auch hier die Natur einen Weg, der Technik ein Bein zu stellen: Korrosion und Rouging beschädigen Anlagen und müssen entsprechend behandelt werden. Referent Dr. Ing. Michael Göbel von der Beratherm AG erklärte den Tagungsteilnehmern, wie Rouging entsteht und was dagegen unternommen werden kann. Rouging tritt bevorzugt in heissen Reinstwasser- und Reinstdampfsystemen auf und bezeichnet ein Korrosionsphänomen an nichtrostenden Stählen unter Bildung von rötlichen Belägen aus Eisenoxidhydraten. Mit zunehmender Temperatur kommt es zu einer Absenkung des ph-werts sowie des elektrochemischen Potenzials. Durch Verschiebung des thermodynamischen Gleichgewichts erfolgt eine Schwächung des Passivfilms. Da Rouge eine geringe Bindung zur Metalloberfläche hat, kann es sich davon lösen und als Partikel im System mitgeführt werden. Fazit: Es kommt einerseits zu Ablagerungen in strömungsarmen Bereichen und zu Kontaminationen der Anlagen und schlimmstenfalls der Produkte. So können zum Beispiel Teflondichtungen rötliche Partikel aufweisen, ohne selber zu oxidieren. Vor allem im Pharmabereich und in der biotechnischen Produktion ist dieser mögliche Verlust der definierten Reinheitsverhältnisse absolut untragbar. Deshalb sollten bevorzugt homogene Werkstoffe mit glatter, gleichmässiger inhärenter Oberfläche ohne Einschlüsse, unerwünschte Ausscheidungen oder mechanische Spannungen eingesetzt werden, so Göbel. Um einen solchen Werkstoff zu erzeugen, werden Oberflächenbehandlungsverfahren wie Beizen, Passivieren, Elektropolieren, Anodische Reinigung, Ätzen, Absäuern und viele andere eingesetzt. Bei nichtrostendem Stahl ist - unter idealen Bedingungen - zur Passivierung keine Behandlung erforderlich, da das Material spontan einen Passivfilm von ca. 2 7 nm Dicke ausbildet. Seine Stabilität ist abhängig vom System. Der Film ist also quasistationär, da er sich destabilisieren, aber auch wieder neu bilden kann, ganz anders als ein Lack. Der Passivfilm steht also immer im thermodynamischen Gleichgewicht mit seiner Umgebung. Entsteht eine Destabilisierung, geht der Korrosionsangriff auf das Metall jedoch schnell vorwärts. Begünstigt wird der Oxidationsvorgang durch das Verhältnis von kleiner Anode (Fehlstelle im Film) und grosser Kathode (restliche Oberfläche). Rouging als Korrosionsart in heissen, reinen Wässern kann massive kreidende Beläge bilden. Diese sind teilweise abwischbar und können mit einem Wipe-Test nachgewiesen werden. Im Vergleich zum Rouging sind die Beläge beim Blacking deutlich dicker. Sie bilden sich in Reinstdampfsystemen bei Temperaturen von deutlich über 100 C. Bei diesen Temperaturen bildet Eisen je nach Gasatmosphäre gut haftende, schwarze Magnetitbeläge. Auch elektropolierte Oberflächen werden überdeckt. Der Passivfilm der Legierungen aus rostfreiem Stahl ist dann nicht mehr existent und komplett überwachsen. Auch hier kann es zu Partikelablösungen kommen. Bei Rouging hilft nur De-Rouging Die Beseitigung von Rougingbelägen, das Derouging, kann mit modernen schonenden Lösungen im ph-neutralen Bereich durchgeführt werden. «Für die Auflösung der Eisenoxidprodukte sind drei wichtige Mechanismen bekannt», so Göbel. Es sind: Protonierung (Säurebehandlung), Reduzierung und Komplexierung. Als Säuren werden Salpetersäure, Phosphorsäure und Salzsäure verwendet. Viele gut wirkende Reduktionsmittel haben den Nachteil des schlechten Geruchs, da es sich um Schwefelverbindungen wie Natriumdithionit, Natriumbisulfit und Natriumthioglykolat handelt. Als Komplexbildner kommen Zitronensäure, Oxalsäure oder phosphorige Säure sowie Tannine und ETDA zum Einsatz. Das Derouging findet im phneutralen Bereich statt, womit die Abwasserentsorgung nach der Reinigung problemlos ist. Die eingesetzten Lösungen greifen das Grundmaterial auch bei langen Einwirkungszeiten kaum an. Sie bewirken lediglich eine Reduzierung der Eisenoxide mit nachfolgender Komplexierung der Eisenionen, ohne dass eine N 2-Überlagerung notwendig ist. è
5 3 6 CHEMIE PLUS r e i n r a u m / G x P Mikroorganismen in Reinstwassersystemen Biofilm: Biofilme an Grenzschichten zu Wasser bestehen aus einer Schleimschicht (Film), in der Mikroorganismen eingebettet sind. Die Mikroorganismen bilden den Film selbst, indem sie extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) ausscheiden. Die EPS bestehen aus Biopolymeren, welche im Wasser Hydrogele bilden. Mithilfe dieser gallertartigen, schleimartigen Matrix, in der Nährstoffe und andere Substanzen gelöst sind an und die dem Biofilm eine stabile Form gibt, haften sich die Mikroorganismen an den Grenzschichten zu Wasser an. In der Matrix tummelt sich ein weites Spektrum von Polysacchariden, Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren. In Biofilmen leben normalerweise verschiedene Mikroorganismenarten gemeinsam. Neben den ursprünglichen Biofilm-Bildnern können später auch andere Einzeller integriert werden. Biofilme bilden sich in natürlicher Umgebung und in technischen Wasseranlagen gleichermassen. Ihre Entfernung an unerwünschter Stelle ist aufwendig bis aussichtslos. VBNC: Viable but not culturable. Dabei handelt es sich um einen reversiblen Ruhezustand (Dormancy) bei Bakterien, die bei ungünstigem Milieu keine Sporen bilden können. Die Zellen (aus Proben von Wasseranlagen oder aus natürlichen Habitaten) sind lebensfähig, aber in gängigen Laborsystemen nicht kultivierbar. Ihre metabolische Aktivität ist minimiert, der Zustand kann Jahrzehnte bis Jahrhunderte andauern, bis die Umgebungsbedingungen wieder für Wachstum und Vermehrung geeignet sind. Bei Blacking Belägen kann nur die Entfernung der wenig haftenden obersten Schicht mit neutralen Lösungen vorgenommen werden. Komplette Abreinigungen lassen sich am ehesten mit HCl-basierten Lösungen erreichen. Blacking ist meist wiederkehrend. Bei gut verarbeiteten und gut gereinigten Michael Göbel, Geschäftsführer der Beratherm AG, beantwortet Fragen aus dem Publikum Systemen kann jedoch eine verbesserte Anlagenperformance erzielt werden. Als Behandlungsmethoden kommen Sprühen, Eintauchen oder Befüllen, Umlauf (Zirkulation), oder punktuelle Behandlung zum Einsatz. Vor einer Reinigung müssen jeweils die beste Methode sowie die Spülmöglichkeiten und Auflagen fundiert abgeklärt werden. Vor allem Dampfsysteme ohne Zirkulationskreisläufe sind problematischer zu reinigen als Loop-Systeme der Reinstwasserinstallationen. Eine Vorbehandlung mit erwärmter alkalischer Lösung empfiehlt sich bei Neuanlagen. Dadurch werden Staub, Öl oder Fett sowie Metallpartikel entfernt. Dieser Schritt verbessert auch die Benetzbarkeit für nachfolgende Behandlungsprozesse. Danach wird eine Zwischenspülung vor der Säurereinigung durchgeführt. Am Ende erfolgt eine vollständige Freispülung der Säure. Zur Kontrolle der kompletten Entfernung hat sich eine Leitfähigkeitsspülung bewährt. Rouging und Blacking sind also abhängig von der Unversehrtheit des Passivfilms und vom Temperaturbereich. Aufgrund dieses zweiten Punktes lassen sie sich in Reinstwasser und -Dampfsystemen kaum verhindern. Früh erkannt, lassen sich die Beläge jedoch noch relativ einfach und schonend entfernen. Dennoch ist Vorsorge besser als Reinigung: Um Rouging, Lochfrass und andere Korrosionen zu verhindern, sollten gerade auch Neuanlagen genau inspiziert werden. Nach der Montage stellen Fett, Späne, Bau- und Metallstaub, Anlauffarben, Beizreste, Kratzer, Markierungen und Schweissnähte Schwachstellen im Passivfilm dar. Diese können später zu Ausgangsstellen von Korrosion werden. Daher empfiehlt Göbel vor der Inbetriebnahme eine besonders genaue Inspektion: «Die Entfernung von mangelhaften Metallverarbeitungsstellen durch eine gute Erstreinigung bietet die Chance, Rouging deutlich zu verzögern.» Quellen (Bild S. Bichsel)
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