Einfluss von Verdünnerkomponenten auf die Flüssigkonservierung von Schweinesperma

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1 Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover Einfluss von Verdünnerkomponenten auf die Flüssigkonservierung von Schweinesperma INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Lê Thị Xuyến aus Hải Dương - Việt Nam Hannover 2004

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Dr. h. c. K. F. Weitze 1. Gutachter: Prof Dr. med. vet. Dr. h. c. K. F. Weitze 2. Gutachter: PD Dr. E. große Beilage Tag der mündlichen Prüfung: Die Durchführung der Arbeit wurde durch ein Stipendium des Deutschen Akademischen Austauschdienstes DAAD (Bonn) gefördert.

3 Meinen Eltern als Dank und zur Freude

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5 INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungen Einleitung Literaturübersicht Einfluss der Samenqualität auf die Fertilität von Eberspermien Spermienmotilität (MOT) Anteil morphologisch abweichender Samenzellen (MAS) Kopfdeformationen Akrosomintegrität (NAR) Viabilität (Fluoreszenzmarkierung membrandefekter Spermien) Verdünnung von Ebersperma bei Raumtemperatur von +18 C Physiologische Verhältnisse nach Ejakulation und Anforderung an Verdünnermedien zur Raumtemperatur-Konservierung Wirksame Verdünnerkomponenten Lagerungsdauer und Alterung der Spermien Eigene Untersuchung Materialien Versuchstiere und Ejakulate Methoden Samengewinnung Samenuntersuchung, Verdünnung und Konservierung Motilitätsbeurteilung Darstellung der Akrosomintegrität Darstellung der Membranintegrität mittels Propidiumjodid-Färbung (PI) ph-wert der Medien und verdünnten Samenproben Osmolalität der Medien und verdünnten Samenproben Statistische Auswertung Ergebnisse Äthanol als Lösungsmittel für lipophile Schutzsubstanzen Einfluss eines Zusatzes von Trolox zum Konservierungsmedium auf die Samenqualität Einfluss eines Zusatzes von Vitamin E (α-tocopherol) auf die Lagerfähigkeit von Eberspermien Einfluss von Bikarbonat und Tris auf die Lagerfähigkeit von Eberspermien Einfluss von N-Acetyl-L-Cystein C 5 H 9 NO 3 S (NAC) auf die Konservierbarkeit von Eberspermien Versuche zur Kühlschockanfälligkeit von Eberspermien...60

6 5 Diskussion Bedeutung von Bikarbonat im Verdünnermedium Versuche zur Inkorporierung von Antioxidantien in das Verdünnermedium Vit. E (Trolox, α-tocopherol) Verwendung von N-Acetyl-L-Cystein (NAC) als Antioxidans Modifizierung der Membranfluidität zur Beeinflussung der Kühlanfälligkeit von Eberspermien Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Laborbedarf Chemikalien, Reagenzien und Medikamente Puffer, Lösungen und Verdünner Eidesstattliche Erklärung Danksagung...115

7 Abkürzungen Abb. Abbildung Aqua dest. ad (einfach) destilliertes Wasser bis zu (bestimmten Volumen auffüllen) Bikarb. Bikarbonat BSA Bovines Serumalbumin (Albumin Fraktion V; aus Rinderserum) BTS Beltsville Thawing Solution bzw. beziehungsweise ca. circa Ca 2+ - CO 2 Cu 2+ d.h. Kalziumkationen Bikarbonatanion Kupferkationen das heißt Defekte Akrosomen (%) Prozentsatz akrosomdefekter Samenzellen dest. destillata (einfach destilliert) EDTA Ethylendiamintetraacetat (Ethylendinitrilotetraessigsäuer Dinatriumsalz-Dihydrat) et al. et alii (und andere) etc. et cetera (und so weiter) Fa. Firma g Gramm / Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec2) g / l Gramm je Liter ggf. gegebenenfalls h hour (Stunde) H + HEPES K + l M Mg 2+ ml Wasserstoffkation (2-[2-(Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic acid) Kaliumkation Liter Molar Magnesiumkationen Milliliter

8 mm Millimolar Mn 2+ mosm MOT (%) Mrd. n n.s. Na + NAC p Param. ph PI PI-positiv (%) ROS Tab. Manganiumkationen Milliosmolar Prozentsatz beweglicher Spermien Milliarde (n) Anzahl der Ejakulaten nicht signifikant Natriumkation N-Acetyl-L-Cystein Wahrscheinlichkeitswert für die Nullhypothese Parameter Wasserstoffionenkonzentration Propidiumiodid Prozentsatz membrandefekter Samenzellen; in der PI-Färbung rot gefärbt. radical oxygene species (reaktive Sauerstoffspezies) Tabelle eingetragenes Warenzeichen u. und Verd. Verdünner Vit. Vitamin Vol-% prozentualer Anteil im Volumen vs versus z.b. zum Beispiel %ig prozentig * Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % (p 0,05) ** Irrtumswahrscheinlichkeit von 1 % (p 0,01) *** Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,1 % (p 0,001) eingetragenes Warenzeichen C Grad Celsius

9 - 9-1 Einleitung Die künstliche Besamung ist die zentrale Biotechnik der Tierproduktion und bietet folgende Vorteile: - Vermeidung der Übertragung von Genitalinfektionen - Höhere Ausnutzung der Ejakulate von Zuchttieren - Zeitlich und örtlich flexibler Einsatz des Samens - Fortschritt in Zuchtprogrammen Die Besamung beim Schwein hat dabei mit der Schwierigkeit zu kämpfen, dass infolge der Kühlschockanfälligkeit der Eberspermien bei Temperaturen über +15 C gearbeitet werden muss, so dass lediglich Flüssigsperma mit begrenzter Haltbarkeit verfügbar ist. Die Lagerung bei Temperaturen über +15 C führt zu einem erhöhten Spermienstoffwechsel, verbunden wiederum mit der Möglichkeit der vermehrten Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, die membranwirksam sein können und die erforderliche Aufrechterhaltung der vollen Befruchtungsfähigkeit beieinträchtigen können. Es ist daher Gegenstand der vorliegenden Arbeit, im Verdünner zu suchende Einflussfaktoren auf die Konservierbarkeit experimentell zu bearbeiten, um eine Verbesserung der Haltbarkeit im Sinne einer verlängerten Aufrechterhaltung der vollen Befruchtungsfähigkeit der konservierten Samenzellen zu erreichen. Dabei wurden zunächst die in der Praxis üblichen Verdünnerkomponenten, wie Glukose, Bikarbonat-Zitrat und EDTA, sowie verschiedene neue Zusätze zur Verbesserung des antioxidativen Schutzes und der Abkühlempfindlichkeit der konservierten Spermien untersucht, wobei der Effekt einer Vorinkubation der Samendosen im Verlaufe der Konservierung in unterschiedlichen Temperaturbereichen auf die Samenzellqualität besonders bearbeitet werden sollte.

10 Literaturübersicht 2.1 Einfluss der Samenqualität auf die Fertilität von Eberspermien Die In-vitro-Erfassung der Samenqualität zur Abschätzung der Befruchtungsfähigkeit ist ein wichtiges Anliegen in der Besamungspraxis, in der Forschung und zur Beurteilung der Fruchtbarkeit von männlichen Zuchttieren. Die Fertilität des männlichen Individuums hängt von qualitativen und quantitativen Ejakulatparametern ab (WABERSKI et al. 1999). Für jedes Vatertier gibt es eine Beziehung zwischen Anzahl der Spermien in der Besamungsportion und Fruchtbarkeitserfolg (Trächtigkeitsrate), deren Verlauf in Abhängigkeit von der Spermienanzahl einen unterschiedlich steilen Anstieg und einen individuellen Schwellenwert mit einer maximal zu erreichenden Fertilität zeigt, die auch durch weitere Erhöhung der Spermienzahl nicht steigerbar ist. Qualitative Spermienmängel sind also nicht beliebig quantitativ kompensierbar. Dazu gehören beispielsweise numerische oder strukturelle DNA-Schäden, die meist zwar die initiale Befruchtungsfähigkeit der Spermien nicht einschränken, aber erhöhte embryonale Mortalitätsraten zu Folge haben (SALISBURY und VANDEMARK 1961). Nach WOELDERS (1991) können beim Schwein Trächtigkeitsrate und Wurfgröße mit Erhöhung der Spermienanzahl in der Inseminationsdosis zwar anfänglich gesteigert werden bis ein Maximum erreicht ist, bei dem die Fertilisation aller befruchtbarer Eizellen nicht mehr von der Spermienanzahl abhängt. Dieses Maximum hängt von Faktoren wie Anwesenheit der befruchtungsfähigen Eizellen, dem richtigen Zeitpunkt der Besamung in Bezug zur Ovulation und der Qualität von Eizellen und Spermatozoen ab und beeinflusst auch die Embryonalentwicklung. Die Samenqualität hat einen großen Einfluss auf die Fertilität von Eberspermien sowie von Ebern. Sie beeinflusst den Konzeptionserfolg sowie die Anzahl geborener Ferkel pro Wurf (SAACKE 1982). Dabei ist die Qualität der geborenen Ferkel (gesunde oder tote Ferkel) nicht nur von der Samenqualität abhängig, sondern auch von der Sau (STARK 1985).

11 Die Samenqualität wird routinemäßig hinsichtlich Lebensfähigkeit und Morphologie der Samenzelle beurteilt (SAACKE 1982). Bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit von Samenzellen werden folgende Punkten berücksichtigt (SAACKE 1984): Bewegungsaktivität (Vorwärts und Ortsbewegung) Durchdringungsfähigkeit von Zervikalschleim und Sephadex- Filter Strukturelle Integrität der Zellmembran und des Akrosoms Gehalt der Zelle an DNS, Enzymen und Lipiden Agglutinationsfähigkeit im Blutserumtest (Kopf-zu-Kopf) Bei Tieren mit innerer Befruchtung werden die Verhältnisse durch das Altern von Spermien und Eizelle kompliziert. So haben Experimente gezeigt, dass die Zahl der beweglichen Spermatozoen unter physiologischen Umständen längere Zeit hindurch nach einem einfachen Exponentialgesetz abnimmt. Es wird eine Fertilitätsgleichung angeführt, in der die Wahrscheinlichkeit der Befruchtung als eine Funktion der Zahl der strukturell und in ihrer Bewegung normalen Spermatozoen, ihrer mittleren Geschwindigkeit und der Halbwertzeit dieser Zahlen oder der Migrationsrate als Parameter für die Fruchtbarkeit ausgedrückt wird. Experimentelle Daten bei Rindern, Geflügel, Schwein, Pferden und Männern stimmten mit den theoretischen Vorhersagungen gut überein (VAN DUJN jr. 1971) Spermienmotilität (MOT) VAN DUJN jr. (1971) bestimmte die potentielle Befruchtungsfähigkeit eines männlichen Tieres nach folgenden primären Sameneigenschaften: 1. Gesamtzahl der ejakulierten Spermatozoen 2. mittlere Geschwindigkeit normal beweglicher Spermatozoen 3. Anteil strukturell und funktionell normaler Spermatozoen 4. Geschwindigkeit, mit der die Spermatozoen altern SAACKE (1970) nennt zwei essentielle Eigenschaften des Spermiums: die Fähigkeit der Vorwärtsbewegung und die Fähigkeit zur Penetration der Zona pellucida der

12 Eizelle. Wenn eine dieser Fähigkeiten gestört ist, ist das Spermium nicht mehr fruchtbar. HOLT (1996) betrachtete die Spermienmotilität nach zwei Modi: den Prozentsatz der Spermien mit Bewegung und die Qualität der Bewegung. Der Autor zeigte, dass die computergestützte Auswertung der Spermienmotilität wichtige Informationen nicht nur über die Fertilität des Individuums, sondern auch über die Viabilität der Spermien nach der Tiefgefrierkonservierung oder Flüssigkonservierung ergibt. Durch die computerassistierte Spermienanalyse (CASA) fanden HOLT et al. (1997) in einer dreidimensionalen Datenanalyse eine signifikante Beziehung zwischen der Trächtigkeitsrate von Sauen und der Veränderung der Spermienmotilität von Ebern nach zweistündiger Inkubation im Kapazitationsmedium (Abb. 1). Die Autoren schlussfolgern, dass das beste Regressionsmodell zur Untersuchung der Beziehung zwischen CASA-Daten und Fertilität bis zu 20 % der Variabilität in Abferkelrate und Wurfgröße zu erklären vermag. 80 % der Variationen müssen demnach anderen Faktoren der Samenqualität, insbesondere aber auch der weiblichen Fertilität und dem Besamungsmanagement (wie der Brunsterkennung und dem optimalen Zeitpunkt der Insemination) zugesprochen werden.

13 Abb. 1: Dreidimensionale Motilitätsanalyse: Die Veränderungen der geradlinigen Geschwindigkeit (VSL) und der durchschnittlichen Geschwindigkeit (VAP) während der zweistündigen Inkubation stehen in Bezug zur Konzeptionswahrscheinlichkeit (HOLT 1997). FLOWERS (1997) ermittelte eine statistisch nachweisbare Beziehung zwischen der Motilität und In-vitro- sowie In-vivo-Befruchtungsparametern erst ab einer unteren Motilitätsgrenze von 60 %, also in einem Bereich, der unter der Norm für normal befruchtungskompetente Ejakulate liegt (Tab. 1). Dagegen ließ sich in dem Motilitätsbereich zwischen 70 % und 90 %, der für die Besamungspraxis von Interesse ist, kein unmittelbarer Bezug zur Fertilität ermitteln. Das Experiment zeigte zudem individuelle Ebereffekte innerhalb der Motilitätsgruppen, die darauf hinweisen, dass zusätzlich andere Eigenschaften der Spermien als die Fähigkeit zur Vorwärtsbewegung für deren Befruchtungskompetenz eine Rolle spielen.

14 Tab. 1: Beziehung zwischen Motilität von Eberspermien und Fruchtbarkeit in vitro und in vivo (FLOWERS 1997) Motilität (%) Spermienpenetration (%) Abferkelrate (%) Lebend geborene Ferkel > a 87 a 10,6 a a, b 87 a 10,5 a a, b 85 a 10,5 a b 86 a 10,1 a c 72 b 9,2 b d 72 b 9,2 b e 52 c 7,8 c (n = 1808 Besamungen) a - e: Signifikante Unterschiede innerhalb von Säule (p < 0,05) Um die Fertilität von Eberspermien zu bewerten, führten TARDIF et al. (1999) vier Schnelltests der Samenqualität (Motilität, Viabilität, physiologischer Zustand und Gehalt der ATP) vor und nach einem Thermoresistenztest (+42,5 C, 45 Minuten) durch. Die Autoren fanden Wechselbeziehung dieser Parameter mit den späteren in vivo-fertilitätsergebnissen nach der Besamung mit zwei Samendosen von 3x10 9 und 0,3x10 9 beweglichen Zellen in 70 ml (optimale und suboptimale Spermienzahl pro Insemination). Dabei ergaben sich bei den Tieren, die mit optimalen Samendosen besamt wurden, für Motilität, Viabilität, physiologischer Zustand und Gehalt an ATP in der Samenzelle vor und nach dem Thermoreristenztest keine Wechselbeziehung mit der Fertilitätsrate (p > 0,05). Jedoch lag hinsichtlich der Tiere, die mit suboptimaler Samendosen besamt wurden, die Spermienmotilität vor dem Thermalstress in signifikanter Wechselbeziehung zur Fertilitätsrate (r = 0,783, p = 0,01). Die Autoren schlussfolgern, dass die Spermienmotilität ein brauchbarer Indikator für die Befruchtungsfähigkeit der Spermien in vivo ist, wenn im unteren Bereich der Spermienzahl pro Besamungsdosis gearbeitet wird.

15 HUANG et al. (1999) zeigten, dass sich die Spermienqualität nach der Tiefgefrierkonservierung signifikant reduziert und vermuten, dass dies auf eine Veränderung intrazellulärer Proteine zurückzuführen sei. Die Autoren fanden bei gefrorenen und aufgetauten Spermien eine wesentliche Abnahme eines 90kDa- Proteins, das sie als 90kDa-Hitzeschockprotein (HSP90) identifizierten. Die Untersuchung des Zeitverlaufs zeigte, dass die HSP90-Abnahme der Spermien in der ersten Stunde während der Abkühlung auf +5 C geschah. Im Vergleich mit frischem Samen (vor der Abkühlung) ergab sich eine HSP90-Abnahme von 64 %, ohne dass sich die Motilität und der Prozentsatz morphologisch normaler Spermien signifikant während der Behandlungsperiode reduzierte. Die Motilität und der Prozentsatz normaler morphologischer Spermienformen verringerte sich wesentlich, wenn die Spermien nach dem Gefrieren (aus -100 C) aufgetaut wurden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die HSP90-Abnahme der Abnahme der mikroskopisch feststellbaren Spermieneigenschaften vorangeht. Die Zeit zwischen einer HSP90- Abnahme und der Motilitätabnahme der Spermien wurde auf 2 bis 3 Stunden veranschlagt. Unterschiedliche Haltetemperaturen hatten nach PAULENZ et al. (1998, 2000) Einfluss auf die Motilität des flüssigkonservierten Schweinesamens. Als optimale Konservierungstemperatur für flüssigen Schweinesamen in BTS zeigte sich +20 C, während Konservierungstemperaturen von +25 C, +15 C oder +10 C die Motilität der Eberspermien reduzierten. Das Ergebnis der Motilitätabschätzung von Spermien ist abhängig von verschiedenen Faktoren: Temperatur des Auffangefäßes, Verunreinigung des Ejakulates mit Bulbourethraldrüsensekret, Verunreinigung mit Schmutz, Blut oder Wasser, die Qualität des Verdünners und die Erfahrung des Untersuchers (HURTGEN 1984, DIRKSEN 1991).

16 Anteil morphologisch abweichender Samenzellen (MAS) SANCHEZ et al. (1998) fanden, dass unter praktischen Besamungsbedingungen die Anwesenheit immaturer Spermatozoen in der Samendosis einen Einfluss auf die Fertilität haben und zu einem Anstieg unbefruchteter Sauen führen kann. WABERSKI et al. (1994) ermittelten signifikante Beziehungen zwischen der Spermienmorphologie und der Fruchtbarkeit in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer des Spermas. Bei längerer Lagerungsdauer flüssigkonservierten Eberspermas ergab sich aufgrund der damit verbundenen Alterungsprozesse (Anstieg morphologischer Spermienabweichungen) eine stärkere negative Beziehung zur Fertilität als bei kürzerer Lagerungsdauer. Die negative Korrelation zwischen dem Prozentsatz morphologisch veränderter Spermien und Abferkelrate war nach Einsatz von vier Tage altem Sperma ausgeprägter als nach Besamung mit zwei Tage altem Samen (Tabelle 2). Tab. 2: Korrelation zwischen der Morphologie von gelagerten Eberspermien und Fruchtbarkeit (WABERSKI et al. 1994) Tag-2-Samen Tag-4-Samen Trächtigkeitsrate (%) Wurfgröße (Ø) Trächtigkeitsrate (%) Wurfgröße (Ø) morphologisch - 0,77 ** - - 0,9 *** - abweichende Spermien proximale ,79 ** - 0,87 *** Plasmatropfen distale - 0,87 *** - 0,8 ** - 0,92 *** - Plasmatropfen Signifikant für ** p < 0,01; *** p < 0,001 (Feldversuch mit n = 1634 Besamungen)

17 Kopfdeformationen LEIDL et al. (1971) beschrieben ein übersichtliches und praktisch anwendbares Schema zur morphologischen Klassifizierung pathologischer Spermien nach ihrer Entstehung (Abb. 2). Abb. 2: Schema für die Klassifizierung missgebildeter Spermien (LEIDL et al. 1971)

18 Die Autoren kommentierten die Klassifizierung folgendermaßen: Die missgebildeten Spermien verhindern die Befruchtung durch noch voll funktionsfähige Samenzellen. Das Vorkommen eines bestimmten Prozentsatzes missgebildeter Spermien im Ejakulat ist ein Hinweis darauf, dass ein Großteil aller übrigen Samenzellen funktionsunfähig ist. Pathologisch geformte Spermien kommen ebenfalls zur Befruchtung, die befruchteten Eizellen degenerieren aber im Frühstadium. Der Vorgang tritt klinisch als Nicht-Konzeption in Erscheinung. Die Autoren berichten aus ihren experimentellen Versuchbesamungen, dass bei einem Anstieg der pathologisch geformten Spermien auf ca. 18 % im Ebersperma der Prozentsatz befruchteter Eizellen 48 Std. nach der Insemination stark reduziert war. Ein Zusatz von bis 100 % experimentell erzeugter, pathologisch geformter Spermien zu Sperma mit physiologischer Beschaffenheit bewirkte keine Verminderung des Befruchtungsergebnisses. Pathologisch geformte Spermien selbst verursachen keine Befruchtungsstörungen, da sie selbst in der Regel nicht an den Ort der Befruchtung gelangen. Primäre Missbildungen, vor allem des Kopfes, zeigen aber von einem bestimmten Anteil (10 %?) an, dass die übrigen Spermien des Ejakulates Schäden aufweisen können, die zu Befruchtungsstörungen führen Akrosomintegrität (NAR) Das Akrosom ist ein essentieller Teil der Samenzelle. Es beinhaltet zwei für die Befruchtung wichtige Enzyme (Akrosin und Hyaluronidase), die eine Rolle bei der Penetration durch den Cumulus Oophorus und die Zona pellucida spielen (WOELDERS 1991). Die Hyaluronidase löst bei der Befruchtung den Cumulus Oophorus durch Hydrolyse der Matrix zwischen den Cumuluszellen auf. Das überwiegend an die innere Akrosommembran gebundene Akrosin ist für die Penetration des Spermiums durch die Zona pellucida von Bedeutung. Die Akrosomreaktion stellt einen exozytotischen Prozess dar, bei dem durch vielfältige Punktfusionen der äußeren akrosomalen Membran mit der darüber liegenden Plasmamembran die im Akrosom enthaltenen Enzyme freigesetzt werden. Dieses

19 Ereignis findet am Ort der Fertilisation statt und wird durch örtliche Faktoren oder spezifische Effektoren ausgelöst. Die übrig bleibende innere akrosomale Membran funktioniert wie die neue Grenze zwischen der Zelle und ihrer Umgebung und bleibt intakt. Es ist daher davon auszugehen, dass eine Missbildung oder Schädigung des Akrosoms die Fähigkeit des einzelnen Spermatozoons, eine Eizelle zu befruchten, beeinträchtigt. (WOELDERS 1991). Deshalb wird der Prozentsatz der Zellen mit einem intakten Akrosom als ein wichtiger Parameter der Samenqualität betrachtet (PURSEL et al. 1972). Die Akrosomreaktion ist eine Voraussetzung für die Penetration der Zona pellucida beim Säugetierspermatozoon. Bei einigen Spezies können Spermien, die sich in der Akrosomreaktion befinden, noch an die Zona pellucida binden, während bei anderen Spezies nur Spermien mit intaktem Akrosom die initiale Bindung an die Zona pellucida durchführen. Beim Schwein ist nachgewiesen, dass nur Spermien mit Akrosomintegrität initial an die Zona pellucida der Oozyte binden können (FAZELI et. al 1997). Nach PAULENZ et al. (1998) reagieren Eberspermien sehr sensitiv auf einen Kühlschock, besonders im Haltetemperaturbereich von +15 C bis 0 C. Die optimale Konservierungstemperatur für flüssigen Schweinesamen in BTS liegt daher bei +20 C. Auch mit einer Konservierungstemperatur von +25 C fanden die Autoren keinen negativen Einfluss auf die Akrosomintegrität, während Konservierungstemperaturen von +15 C oder +10 C den Prozentsatz intakter Akrosome verringerte. Während der Abkühlung zur Kryopreservation kommt es zu Akrosomveränderungen der Spermien. Werden die Spermien jedoch vor dem Gefrieren für 3,5 Stunden bei +15 C angepasst, erhöht sich der Prozentsatz der akrosomintakten Spermien nach dem Gefrieren und Auftauen signifikant (MAXWELL et al. 1997). PURSEL et al. (1972) beurteilten die Akrosomveränderungen der Eberspermien mit Hilfe des Phasenkontrastmikrokopes und ermittelten folgende kontinuierlich ineinander übergehenden Stufen der Alterung (Abb. 3):

20 Abb. 3: Bild 1 bis 5: Phasenkontrastmikrographien von unfixierten kältegeschockten Eberspermien, eingeteilt nach Akrosommorphologie. Alle Bilder in der Vergrößerung x4000 (PURSEL et al. 1972). Bild 1. NAR = Normal apical ridge (normaler apikaler Rand): Die Akrosomkappe liegt dem Kern glatt auf und besitzt einen scharfen und klaren halbmondförmigen apikalen Rand. Bild 2. NAR = Normal apical ridge with particles (arrows): (normaler apikaler Rand mit Partikel) (Pfeile): NAR -Spermatozoen sind ähnlich wie NAR-Spermatozoen, weisen jedoch anhaftende Partikel an der Akrosomenkappe und der postnukleären Zone auf. Bild 3. DAR = Damaged apical ridge (beschädigter apikaler Rand): unregelmäßig vergrößerter hinterer Bereich des apikalen Randes. Bild 4. MAS = Missing apical ridge (fehlender apikaler Rand): Spermatozoen ohne apikalen Rand, vordere Akrosomkappe ist jedoch noch dicht am Spermienkopf angeheftet. Bild 5. LAC = Loose acrosomal cap (Akrosomkappe in Ablösung): Spermien weisen Vesikelbildung der vorderen Akrosomkappe auf. In Anlehnung an diese Einteilung wählte WEITZE (1977) für die am Akrosom des Kaninchenspermiums feststellbaren Veränderungen folgende Bezeichnungen, die auch in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden: NAR = Normaler apikaler Rand GAR = Geschwollener apikaler Rand

21 AIA = Akrosom in Ablösung AA = Abgelöstes Akrosom DAR = Deformierter apikaler Rand Viabilität (Fluoreszenzmarkierung membrandefekter Spermien) Um die Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten, muss ein Spermatozoon eine intakte Plasmamembran behalten. Diese Integrität ist notwendig für einen normalen Energiemetabolismus mit Produktion und Verbrauch von ATP, der zur Aufrechterhaltung der Motilität von Spermien erforderlich ist (JANUSKAUSKAS et al. 1996). Außerdem muss der Membranbereich des Spermienkopfes für die unter physiologischen Bedingungen im weiblichen Genitale erfolgenden Schritte der Fertilisation intakt bleiben (Binden an das Epithel des unteren Eileiters, periovulatorisches Lösen vom Epithel und Kapazitationsveränderungen der Spermienmembran, Erkennen der und Bindung an die Zona pellucida; Akrosomreaktion und Penetration der Zona; Verschmelzen mit dem Oolemma und Inkorporation in das Eizellplasma (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1997, TOEPFER- PETERSEN et al. 2000). Schnelles Abkühlen der Samenzelle führt zu Membranschäden, die bei Unterschreitung von +15 C, insbesondere bei den für die Tiefgefrierung erforderlichen Behandlungsschritten der Eberspermien verstärkt auftreten. Diese Membranschäden ähneln den bei der Kapazitation auftretenden Veränderungen und führen zu einer vorzeitigen Akrosomreaktion, verbunden mit einer signifikanten Verringerung der Überlebenszeit und schnellen Elimination aus dem weiblichen Genitaltrakt mit der Konsequenz verringerter Befruchtungsleistung des Inseminates (WATSON et al. 2000). Kühlbehandelte Spermien akkumulieren Calciumionen, wie ROBERTSON und WATSON (1986) durch Aufnahme von 45Ca 2+ zeigten; dabei führt eine Vorinkubation bei Temperaturen über +15 C zu einer Verminderung der Calciumaufnahme, die zu einer verbesserten Abkühlresistenz führt (ROBERTSON et al. 1989). Möglicherweise ist der Zusatz von Zitrat und EDTA in den üblichen

22 Ebersamenverdünnern in diesem Zusammenhang von Bedeutung, da beide Substanzen Chelatoren von Calciumionen sind. Die mittels CTC-Markierung und Calciumaufnahme bei in vitro-kapazitation nachgewiesenen Veränderungen scheinen den nach Abkühlen und Wiedererwärmen auftretenden Schäden ähnlich zu sein. Der Anstieg freien Calciums wird als einer der ersten Kapazitationsschritte angesehen und ist wahrscheinlich Teil der Signaltransduktion, die zu Membranveränderungen führt und schlussendlich in einer Destabilisierung der Plasmamembran und Fusion der äußeren Akrosommembran und der darüber liegenden Plamamembran mündet (WATSON et al. 2000). Es ist daher verständlich, dass ein Konservierungsverfahren vor allem das Auftreten derartiger destabilisierender Membranveränderungen verhindern sollte, die, wenn sie unmittelbar vor der Befruchtung auftreten, physiologisch und voraussetzend für eine Befruchtung sind. Zur Darstellung membrandefekter, d.h. als tot oder moribund angesehener Spermien wird ein DNA-spezifisches Fluorophor, Propidiumjodid, verwendet, dass die Köpfe geschädigter Spermien intensiv rot färbt, während membranintakte Samenzellen sich ungefärbt darstellen (GARNER et al. 1986). Im wissenschaftlichen Sprachgebrauch wird dieses Verfahren als Viabilitätstest (viability assessment) bezeichnet. Die Autoren gehen davon aus, dass absterbende Spermien ihre Fähigkeit verlieren, den Influx des membranimpermeablen Farbstoffes PI zu verhindern, wobei PI wahrscheinlich in das Kernkompartment über Poren in der Kernmembran eindringt, die sich im Diverticulum oder in Membranfalten im hinteren Kopfbereich nahe der Implantationsgrube befinden (ERICSSON et al. 1993, GARNER u. JOHNSON 1995). Weitere Fluoreszenzfarbstoffe, wie Carboxyfluoreszeindiacetat (CFDA), SYBR-14, Hoechst und andere werden ebenfalls zur Evaluierung der Plasmamembranintegrität verwendet. Das zugrundeliegende Prinzip ist der Ausschluß von nicht permeablen DNA-markierenden Farbstoffen oder die Verhinderung des Austrittes von Reaktionsprodukten permeabler Farbstoffe durch intakte Plasmamembranen. Mit diesen Methoden sind Membranschäden indirekt nachweisbar, die sich der konventionellen lichtmikroskopischen Untersuchung entziehen (WABERSKI et al. 1999).

23 Um die Viabilität von Eber- und Bullenspermien zu untersuchen, verwendeten PINTADO et al. (2000) verschiedene Farbstoffe (Propidiumjodid PI, Hoechst 33258, Eosin) um die DNA von Spermien, die keine Lebensfähigkeit haben, zu markieren. Die Autoren ermittelten, dass der Anteil der PI-positiven Zellen signifikant höher ist als der Anteil der Hoechst positiven Zellen und der Eosin-positiven Zellen, während es keinen Unterschied der Ergebnisse nach Hoechst Färbung und Eosin-Färbung gab. Die Autoren folgerten, dass eine PI-Färbung von Eber- und Bullenspermien am besten geeignet war, den Membranzustand der Samenzellen anzuzeigen. Im Vergleich zur Viabilität der Spermien in frischem Samen sinkt die Viabilität gefrierkonservierter Spermien signifikant (MAXWELL et al., 1997). Dabei ist die Membranveränderung der Samenzelle, die eine Abkühlung bis +5 C durchgemacht hat, höher als die nach Abkühlung auf lediglich +15 C. Die bei Abkühlung bis +5 C ermittelte Membranveränderung der Samenzelle war sogar stärker als die während des Gefrierens und Auftauens eintretende. Die Autoren bestätigten frühere Erfahrungen, dass die Vorinkubation des zu konservierenden Samens bei +15 C die auftretenden Schäden signifikant verminderte. Es ist daher naheliegend, dass sich der Membranzustand von Ebersamenzellen bei Unterschreiten der Temperaturgrenze von +15 C signifikant verändert und dass eine Vorinkubation diese Veränderung im Sinne einer Kühlschockresistenz signifikant verringert. 2.2 Verdünnung von Ebersperma bei Raumtemperatur von +18 C Physiologische Verhältnisse nach Ejakulation und Anforderung an Verdünnermedien zur Raumtemperatur-Konservierung Die bei der Ejakulation erfolgende Vermischung von Nebenhodensperma und Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen führt zu einer momentanen Stimulation des Energiestoffwechsels, deren wesentlicher Ausdruck das Einsetzen der Beweglichkeit der Spermiengeißel ist. Unter physiologischen Bedingungen einer Bedeckung gelangt das gesamte Ejakulat unmittelbar in den Uterus, wo es sich mit dem

24 Uterinsekret vermischt und durch Myometriumsmotorik sehr schnell über die große Oberfläche des Endometriums der langen Gebärmutterhörner verteilt wird. Nach neueren Erkenntnissen gelangt eine erste befruchtungskompetente Spermienpopulation innerhalb weniger Minuten in den uterotubalen Bereich, wo die Samenzellen in Schleimhautlängsfalten in den unteren Isthmus aktiv aufsteigen, wobei sie vom umgebenden Sekret getrennt werden, das nach Beendigung des Uterustransportes noch Seminalplasmabestandteile in geringer Konzentration enthalten dürfte. Hieraus wird gefolgert, dass der Kontakt zum akzessorischen Sekret zeitlich begrenzt ist, ohne dass hierdurch die während der Ejakulation einsetzenden Interaktionen zwischen Samenzellen und Seminalplasma beeinträchtigt werden. Seminalplasma beeinflusst die Spermienphysiologie nicht nur hinsichtlich der Stimulation der Motilität über einen Bikarbonat-Effekt sondern verändert auch die Membranstabilität und die Widerstandsfähigkeit der Spermien gegenüber einer frühzeitigen Dekondensation des Chromatins (RODRIGUEZ- MARTINEZ 2003). Einige Ejakulatfraktionen, wie Anteile der Gelfraktion, verringern die Fertilität der Samenproben (IWAMOTO et al. 1992). Daher ist das Entfernen des Seminalplasmas (durch Zentrifugation oder Ausverdünnen mit einem Puffer) gängige Praxis, um eine maximale Viabilität des Spermas im Rahmen der Spermakonservierung zu sichern. Andererseits erhöht sich beim Ebersperma nach Inkubation bei Raumtemperatur in Anwesenheit des Semialplasmas die Widerstandsfähigkeit gegenüber dem Kühlschock, ein Vorgang, der dann ausgeprägt eintritt, wenn kurz zuvor gewonnene Ejakulate gekühlt werden (PURSEL et al. 1973, TAMULI und WATSON 1994). Im Rahmen der Gefrierkonservierung ist diese Vorinkubation von essentieller Bedeutung für die Überlebensrate der Spermien. Bei Anwendung dieser Vorinkuation (bis zu 20 h in homologen Seminalplasma ohne Gelfraktion) konnten keine schädigenden Veränderungen der Überlebensrate nach dem Auftauen (ERIKSSON et al. 2001) oder nach in vitro-fertilisierung (SUZUKI et al. 2002) festgestellt werden. Diese Vorgänge sind als Hinweise zu werten, dass die diskutierten schädigenden Einflüsse des Seminalplasmas spezifisch an gewisse Fraktionen gebunden sind, die bei der Gefrierkonservierung zuvor eliminiert worden sind. Generell enthält das Seminalplasma spezifische Proteine aus dem

25 Nebenhoden und/oder den Anhangsdrüsen (TÖPFER-PETERSEN et al. 2000), die in der Lage sind, die Destabilisierung der fluiden Spermienmembran zu verhindern, die z. B. bei der Kryokonservierung oder Kapazitierung erfolgt (HARRISON 1996). In diesen beiden Fällen wird unter anderem ein Grossteil der Seminalplasmaproteine entfernt, die an die Peripherie der Spermienmembran assoziiert sind (CALVETE et al. 1997, MAXWELL u. JOHNSON 1999). Es wird angenommen, dass der Kühlschock der Samenzelle mit der Lipidzusammensetzung des Membranbilayers zusammenhängt, wodurch die Fluidität der Membran verändert wird (WATSON 1996). Bei sinkender Temperatur soll es zu einer Verringerung der lateralen Bewegung von Phospholipiden der Membran und einer damit verbundenen Transition von einem fluiden zu einem Gelzustand kommen, welches infolge der unterschiedlichen Transitionstemperaturen für verschiedene Membranlipide zu Phasenseparationen führt, wobei Proteine in irreversibler Weise geclustert werden (DE LEEUW et al. 1990). Der Grad der Veränderung (Clusterung) hängt offenbar von der Membranzusammensetzung ab, wie Unterschiede der Fettsäurenzusammensetzung der Lipide zwischen kühlresistenten Bullenspermien und kühlempfindlichen Eberspermien zeigen. Da die Fettsäurenzusammensetzung der Phospholipide das Phasenverhalten beeinflusst, könnten hiermit die Unterschiede zwischen Bullen- und Eberspermien erklärt werden, der durch einen geringeren Gehalt an Phosphatidylcholin und einen höheren Anteil an Phosphatidylethanolamin und Sphingomyelin beim Eber gekennzeichnet ist. Ein anderer Faktor, der das thermotrophe Verhalten von Membranen beeinträchtigt, ist der Gehalt an Cholesterin. Da das Cholesterin / Phospholipidverhätlnis bei Eberspermien sehr niedrig und Cholesterin asymmetrisch verteilt ist, liegt es mehr im äußeren als inneren Monolayer der Membran, was den inneren Monolayer empfindlicher gegenüber Kälteschock machen könnte. Auch wenn teilweise reversibel, könnte eine kälteverursachte Reorganisation von Membranbestandteilen die Membranfunktion auf unterschiedliche Weise beeinträchtigen, wie beispielsweise Anstieg der Permeabilität (Verlust von Kationen und Enzymen), Reduzierung von Enzymaktivität und diffusionsabhängigen Membranprozessen und Veränderungen in der lateralen Bewegung von Kanälen (DE LEEUW et al. 1990).

26 Verdünnung und Abkühlung machen die Eberspermienmembran stärker permeabel (RODRIGUEZ-MARTINEZ 2003), so dass Phasenveränderungen und der damit verbundene Eintritt freier Calciumionen aus dem Medium in die Zelle calciumabhängige Prozesse stimulieren könnten, die mit der Kapazitation zusammenhängen. Da die Zellmembran hierbei fusionsfähiger wird, werden die üblichen Mechanismen der Kapazitation übersprungen. Wesentlich scheint aus praktischer Sicht zu sein, dass die Kühlsensibilität von Eberspermien sich in Abhängigkeit von Zeit und Temperatur verändert und dass Faktoren, wie Reifezustand, Seminalplasma, Verdünnung und Alterung während der Inkubation dabei eine Rolle spielen (JOHNSON et al. 2000). Für die Spermakonservierung ist demnach die Wirkung des bei der Ejakulation beigemischten Seminalplasmas auf die in ihm suspendierten Spermienzellen zu berücksichtigen, auch wenn die Verweildauer unter in vivo Bedingungen sehr kurz ist. Das Seminalplasma ist für die Spermien in dieser Hinsicht ein Transportmedium, darüberhinaus aber auch Quelle wichtiger an die Spermienmembran assoziierender Substanzen, insbesondere Proteine, die befruchtungsrelevant sind. Samenkonservierung bedeutet im Allgemeinen längere Verweildauer der Spermien im Seminalplasma und in artifiziellen Medien (Verdünner, Inkubationsmedien), einschließlich einer Verringerung der zellulären Konzentration. Damit verbunden ist für die Spermien ein mechanischer und osmotischer Stress, der durch Oberflächeneffekten, die von den Gerätschaften ausgehen und durch Temperaturänderungen verstärkt werden kann. Bei längerer Verweildauer bewirken die enzymatischen Komponenten einen glykolytischen bzw. fruktolytischen Abbau der Kohlenhydrate. Das dabei anfallende Laktat führt zu einer Ansäuerung und einer Erhöhung des osmotischen Drucks, was unspezifisch auf alle enzymatischen Komponenten einschließlich der membranständigen Enzyme der Spermien Einfluss hat (z.b. Transport-ATPasen). Damit verbunden dürfte auch eine langsame Anpassung der Spermatozoen an die Milieubedingungen des Seminalplasmas, wie Na + /K + -Verhältnis und Ca 2+ -Ionen-Konzentration, sein. Eine spontan ablaufende Lipidperoxidation in den nicht zellständigen Lipidkomponenten des Plasmas ist ebenfalls wahrscheinlich. In Abhängigkeit von der jeweils beabsichtigten

27 Verwendung (Flüssigkonservierung bei Raumtemperatur, Gefrierkonservierung) ist die längere Verweildauer nicht immer unbedingt von Vorteil. Im Hinblick auf die für die Konservierung unerlässlichen Medien ist es empirisch gesehen nicht unbedingt von Vorteil, wenn die verwendeten Verdünnerlösungen in der Zusammensetzung dem Seminalplasma ähnlich sind (PETZOLDT 2001) Wirksame Verdünnerkomponenten Wesentliche Faktoren für die Verdünnung sind ph-wert, Ionenstärke, Typ der Ionen und osmotischer Druck des Mediums sowie der Zusatz von antimikrobiellen Substanzen. Frisch ejakuliertes Ebersperma hat einen ph-wert zwischen 7,2 und 7,5, unterhalb diesem werden Motilität und Stoffwechsel graduell reduziert. Der hohe Glucoseanteil der meisten Ebersamenverdünner verursacht eine beträchtliche Verringerung des intrazellulären ph-wertes unter 6,0. Diese intrazelluläre Acidose befähigt die Samenzelle offenbar, bei Raumtemperatur einige Tage zu überleben. In Vergleich zu anderen Tierarten ist die glycolytische Aktivität von Eberspermien sehr gering. Da bei Aufbewahrung in Plastiktuben ein sehr geringer oder kein Sauerstoffzutritt vorhanden ist, ist die Motilität der Spermien bei relativ hohen Temperaturen stark einschränkt. Da die Ionenstärke von Ebersamenverdünner nicht wesentlich zu sein scheint, wird die Osmolarität durch nichtionische Substanzen, wie Glucose, erzielt. Die Ionen für Frischsamenverdünner stammen aus Natrium- Bikarbonat-Zitrat oder in einigen Verdünnern aus Kaliumchlorid. Ersteres wird als Puffer verwendet, Kaliumchlorid in geringen Konzentrationen (4 mm K + ) zur Aufrechterhaltung der Na + -K + -Pumpe, um den intrazellulären K + -Verlust und Verringerung der Motilität zu verhindern (ALVAREZ u. STOREY 1982). Bikarbonat führt andererseits innerhalb weniger Minuten zu einer Veränderung der Membranlipidarchitektur, wodurch eine irreversible Membrandestabilisierung verursacht wird, die als wichtiger Schritt der Kapazitierung der Samenzelle angesehen wird (HARRISON 1996), was im Hinblick auf die übliche und erfolgreiche Verwendung von Bikarbonatpuffern als Konservierungsmedium widersprüchlich ist.

28 Jedoch ist zu bedenken, dass bei der Flüssigkonservierung stets eine ausreichende Chelatkonzentration vorhanden ist, die die Kapazitationsinduktion offenbar verhindert, während in den Versuchen von HARRISON (1996) stets mit mehrfach gewaschenen Spermien gearbeitet wurde, so dass das Bikarbonat seine Wirkung voll entfalten konnte. Neuere Verdünner basieren auf zwitterionischen organischen Puffern, insbesondere TES und HEPES (CRABO et al. 1972, WEITZE 1990), die Schwermetalle binden und den ph-wert kontrollieren. HEPES ist von der IUPAC-IUB empfohlene Abkürzung für die 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure(C 8 H 18 N 2 O 4 S). HEPES hat ein Molekulargewicht von 238,31 g / Molekül und wirkt als Zwitterionenpuffer im Bereich von ph:7,0 bis 8,0 (NEUMÜLLER 1983). FERGUSON et al. (1980) zeigten, dass HEPES am erfolgreichsten den Anforderungen an eine ideale Puffersubstanz nachkommt. Nach GOOD und IZAWA (1972) erfolgt keine Bindung von Mg² +, Ca² +, Mn² + und Cu² + an HEPES. Da Eberflüssigsperma oberhalb von +15 C konserviert werden muss, sind eine Reihe von Verdünnern angewendet worden, die die Stoffwechselaktivität durch Medien mit hohem CO - 2 -Gehalt (durch Begasung) erniedrigten (DU MESNIL DU BUISSON u. DAUZIER 1959). Viele Verdünner für Schweinesamen beinhalten EDTA, dessen Verwendung weltweit erstmalig im sogenannten Kiew-Verdünner (PLISKO 1965) erfolgte, was ein wesentlicher Schritt zur weltweiten Anwendung von flüssigkonservierten Ebersamen war (HÄGER u. MÄCKLE 1971). EDTA als eine hemmende Substanz fängt divalente Metall-Ionen, besonders Ca 2+ ein, und es ist anzunehmen, dass ihre Bewegung über die Plasmamembran durch EDTA vermindert wird (WATSON 1990). HARRISON et al. (1978) zeigten, dass EDTA die Motilität von Schafbockspermien nicht beeinflusste und dass sich durch die Anwesenheit von EDTA eine Agglutination von Widderspermien deutlich auflöste. Nach QUINN und WHITE (1968) schützt EDTA (in Konzentrationen von etwa 50 µm) Widderspermien gegen Kühlschock. Der Kühlschock verursacht eine Abnahme der Kalium- und Magnesium-Konzentration der Spermien und eine Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes. Diese negativen Auswirkungen wurden durch die

29 Anwesenheit des EDTA verhindert. Es waren höhere Konzentrationen erforderlich, um Permeabilitäts-Veränderungen zu reduzieren, die mittels Färbungsreaktion nachgewiesen wurden. EDTA verhinderte zwar nicht den Influx von Natrium bzw. den Efflux von Kalium und Magnesium an kühlgeschockten Spermien, jedoch wurde eine Anreicherung von Kalzium in den Spermien durch EDTA in höheren Konzentrationen verhindert. SENEGACNIK (1986) untersuchte den Effekt von EDTA auf den Metabolismus von Eberspermien. Der Stoffwechsel der Eberspermien wurde durch Konzentrationsmessungen extrazellulärer Glukose und Phosphor nach Lagerung für 0, 24, 48, 72 und 96 Stunden bewertet. Die Ergebnisse zeigten einen hemmenden Effekt von EDTA gegenüber einem EDTA-freien Verdünner. Die extrazelluläre Konzentration von Alanin-Aspartat-Aminotransferase war unter dem Einfluss von EDTA infolge des Effektes auf die Permeabilität der Spermienmembran ebenfalls geringer. Der Autor ermittelte eine optimale Konzentration von EDTA in den Medien von 1 bis 1,25 mg / ml. EDTA reagiert mit vielen Metallionen unter Bildung nichtionisierter Chelate und Freisetzung von H + -Ionen (BERNSTEIN 1958). Durch sein Bindungsvermögen für verschiedene Kationen und toxische Schwermetallionen wirkt EDTA regulierend auf die Ionenkonzentration im Verdünnermedium, hemmt dadurch die liposomale Peroxidation und wirkt indirekt membranstabilisierend (TIEN et al. 1982). Durch die chelatierende Wirkung zweiwertiger Metallionen, insbesondere Ca 2+, wird deren Transport über die Zellmembran vermindern (WATSON 1990), wodurch der Beginn der Kapazitierung und Akrosomreaktion verhindert wird. Hinsichtlich gebräuchlicher Konservierungsmedien ist der am meisten verwendete Verdünner Beltsville-TS (BTS), der von PURSEL und JOHNSON (1975) zum Auftauen von gefrierkonservierten Eberspermien verwendet wurde (Beltsville Thawing Solution) und später für die Flüssigkonservierung adaptiert wurde (JOHNSON et al. 1988). Dieser Verdünner enthält geringe Kaliumkonzentrationen und soll den intrazellulären Gehalt dieses Ions auf physiologischem Niveau halten. Komplexere Medien enthalten Tris, Zitronensäure, BSA und Cystein zusätzlich zu Glucose und EDTA (GOTTARDI et al. 1980) oder BSA und HEPES (WEITZE 1990).

30 Diese Verdünner werden bis zu einer Haltezeit von 5 Tagen und länger verwendet und als sog. Langzeitverdünner bezeichnet. Bovines Serumalbumin (BSA) ist ein aus dem Rinderblut gewonnenes Plasmaprotein. Es besteht aus einer einzelnen Peptidkette mit über 580 Aminosäureresten und drei Domänen mit jeweils zwei Subdomänen. Letztere werden wiederum aus drei Aminosäureschleifen gebildet (BROWN 1977). BSA hat ein Molekulargewicht von Im Vergleichen zu anderen extrazellulären Plasmaproteinen hat BSA einen hohen Cysteingehalt und besitzt eine freie Sulfhydrylgruppe (PETERS 1975). HARRISON et al. (1978) zeigten, dass BSA einen positiven Effekt auf die Motilitätserhaltung der Eberspermien hat. Dabei beeinflusst BSA die Motilität direkt, eventuell durch die Bindung von Lipidperoxidationsprodukten und die Entfernung eines Motilitäts-Hemmfaktors, nicht aber über eine Veränderung des ATP-Gehaltes und des Energieumsatzes (HARRISON et al. 1982). BSA wirkt nicht als ein Chelator, da es nicht durch EDTA zu ersetzen ist (HARRISON et al. 1978). Andererseits hat es eine hohe Bindungsaffinität zu organischen Substanzen mit einer hydrophoben Komponente sowie zu Anionen und zweiwertigen Kationen (HARRISON et al. 1982). Die Bedeutung von BSA zur Verlängerung der Überlebenszeit und Befruchtungsfähigkeit von Eberspermien wurde von WEITZE (1991) verschiedenen Effekten des Moleküls zugeordnet, ohne dass eine vollständige Erklärung des Schutzeffektes möglich war. BSA bindet selektiv an die Plasmamembran des Verbindungs- und Hauptstücks der Spermiengeißel. Diese regionale Bindung ist offenbar korreliert mit einem protektiv-stimulierenden Effekt auf die Spermienmotilität (ALTHOUSE et al. 1998). Chemisch vermittelt BSA einen gewissen Puffereffekt (SCHAAP 1987), einschließlich einer Neutralisierung von Stoffwechselprodukten sowohl der Spermien selbst als auch von Bakterien (BAMBA und SONE 1981). An Kaninchenspermien konnte eine antiperoxidative Wirkung von BSA nachgewiesen werden (ALVAREZ und STOREY 1983). In Laboruntersuchungen als auch Besamungsversuchen zeigten ALTHOUSE et al. (1998), dass mit BSA-haltigem Medium (Androhep) verdünntes Ebersperma für 60 h bis auf +12 C abgekühlt ohne Verminderung von Spermaqualität und Befruchtungsergebnisse gelagert werden konnte. Dieses ist als

31 wichtiger Hinweis darauf zu verstehen, dass BSA eine graduelle Abkühlung von Ebersperma unter +15 C ermöglicht, ohne die Befruchtungsfähigkeit zu beeinträchtigen. In einer Reihe von Untersuchungen ergaben sich Hinweise auf die Wirkung von Reaktiven Oxygen Spezies (ROS) als essentielle Faktoren der Spermienschädigung, insbesondere durch Hydrogenperoxid (H 2 O 2 ), Superoxidanionen (O - 2 ) und / oder Hydroxylradikale (OH - ) (AITKEN et al. 1989). Ein möglicher Grund für die extrem hohe Anfälligkeit von Spermien gegenüber oxydativem Stress ist der sehr hohe Gehalt von polyungesättigten Fettsäuren in der Plasmamembran, insbesondere von Docosahexonoidansäure. Diese im Vergleich zu somatischen Zellen einzigartige Zusammensetzung der Phospholipide der Spermien-Plasmamembran wird als wesentlich für die Aufrechterhaltung der Membranstabilität, Fluidität und Permeabilität angesehen (PARKS und HAMMERSTEDT 1985). Diese besondere chemische Zusammensetzung der Plasmamembran ist verantwortlich für eine normale Spermienfunktion, bei der ROS wahrscheinlich eine physiologische Rolle während der Kapazitation spielen, indem sie die Eigenschaften der Plasmamembran modulieren, die sehr sensitiv gegenüber Oxidation ist (AITKEN et al 1995). Derselbe Autor zeigte auch, dass ROS eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Spermienfunktion durch die Redoxregulation der Tyrosinphosphorylierung zu haben scheint. Wenn Spermien durch einen hohen Grad oxidativer Belastung in ihrer Funktion beeinträchtigt werden, führt das zu einem Verlust an Spermienmotilität und verminderter Penetrationrate oder sogar zum Zelltod (OEDA et al. 1997), was wahrscheinlich durch einen sehr geringen Gehalt an Schutzsystemen und dem Fehlen von Katalase liegt, so dass Spermien besonders empfindlich gegenüber Oxidation sind. Um den schädigenden Effekt von ROS an Spermien zu vermindern, verwendeten OEDA et al. (1997) N-Acetyl-L-Cystein (NAC), eine reduzierende Substanz, die bei Lungenerkrankungen wegen ihres enormen viskositätsmindernden Effekte des Sputums mittels Sulfhydryl-Disulfid-Interaktionen eingesetzt wird. NAC ist in wässriger Lösung stark sauer (ph 1,5 bis 2,0), so dass dieses bei der Anfertigung von Verdünnermedien berücksichtigt werden muß. Die Autoren arbeiteten mit

32 Konzentrationen von 0,1, 1,0 und 5,0 mg / ml Medium und ermittelten bei einer Konzentration von 1,0 mg /ml eine signifikante Verbesserung der Spermienmotilität. Wie bereits in den vorhergehenden Abschnitten erläutert, sind Eberspermien extrem kühlschockanfällig, wenn sie unter die Temperaturgrenze von +15 C abgekühlt werden, so dass eine routinemäßige Konservierung im Temperaturbereich von +17 C bis +18 C erfolgt. Ist das Abkühlen von Samenproben, wie etwa anlässlich der Gefrierkonservierung, unerlässlich, wird der Kühlschock graduell durch eine zwischen 2 und 16 h andauernde Vorinkubation bei Temperaturen oberhalb +15 C erreicht, bevor die Temperatur weiter auf +5 C gesenkt wird (JOHNSON et al. 2000). Aber auch unter Berücksichtigung dieser inkubationsabhängigen Steigerung der Kühlresistenz ist diese nur graduell, was eine der Ursachen für die unzureichende Befruchtungsfähigkeit gefrierkonservierten Eberspermas ist. Auch wenn keine endgültige Erklärung des Phänomens der graduellen Kühlschockresistenz nach Inkubation verfügbar ist, wird davon ausgegangen, dass Veränderungen in der Membranzusammensetzung und / oder in der Stabilität integraler Proteine hierbei beteiligt sind (ZENG und TERADA 2000), so dass hypothetisch eine in vitro-modifikation der Membran die Kühlschockresistenz der Spermien verändern könnte. Wie Untersuchungen von VISCONTI et al. (1999) ergaben, führten Cyclodextrin in Kapazitations-Untersuchungen zu einer Freisetzung von Cholesterin aus der Spermienzelle von Bulle und Maus. Die Tatsache, dass Cyclodextrin den Cholesteringehalt der Plasmamembran verändern kann, veranlasste ZENG und TERADA (2001 b) zu Kälteschockversuchen an Eberspermien. Ähnlich wie die Zugabe von Phospholipiden (z.b. Eidotter) führte auch Cyclodextrinzusatz zu einer Verbesserung der Kühlsensibiltät durch eine signifikante Veränderung der Motilitätswerte. Man geht hypothetisch davon aus, dass der Schutzeffekt eines Phospholipidzusatzes durch eine Veränderung des Phospholipid-Cholesterin-Verhältnisses in der Membran bedingt ist. Wie an Erythrozyten ermittelt wurde, führte ein exogener Zusatz von Phospholipiden zu einer Extraktion von Cholesterin aus der Zellmembran, wodurch das Phospholipid- Cholesterin-Verhältnis in der Membran verändert wurde (CHRISTIAN et al. 1997). Da

33 ein Efflux von Cholesterin aus der Membran zu einer erhöhten Membranfluidität führt, schlußfolgerte man, dass die Membranfluidität in einem korrelativen Zusammenhang mit der Kühlschockresistenz von Spermien stehen kann. Die Autoren kamen zum Schluss, dass ggf. auch andere cholesterinbindende Substanzen, wie High Density Lipoproteine oder BSA, spermienwirksam sein könnten. 2.3 Lagerungsdauer und Alterung der Spermien Die Flüssigkonservierung von Ebersperma führt zu strukturellen und funktionellen Veränderungen als Anzeichen für einen natürlichen Alterungsprozess, der von der Lagerdauer abhängt. Alterung der Spermien erfolgt in vitro und nach der Besamung in vivo, wenn die befruchtungskompetente Spermienpopulation im unteren Eileiter auf die Freisetzung der Eizellen während der Ovulation wartet. Dieses bedeutet, dass der Befruchtungserfolg durch zwei Alterungsperioden beeinflusst wird: die in vitro-lagerung vor der Insemination für 5 Tage oder mehr, und die in vivo-alterung, die zunimmt, wenn das Intervall zwischen Besamung und Ovulation über 12 bis 24 h ausgedehnt wird (WABERSKI et al. 1994). Unter Praxisbedingungen ist ein Abfall der Befruchtungsfähigkeit während der Lagerung nicht auszuschließen, auch wenn sogenannte Langzeitverdünner zum Einsatz kommen. Dennoch scheinen spezielle Verdünnerbestandteile, wie BSA und Art des Puffers, die lagerungsbedingte Alterung und den damit verbundenen Abfall der Befruchtungsleistung zu verringern. Erhöhte Anzahl an Spermien in der Besamungsdosis, die Anwesenheit von Seminalplasma und die geringe Verdünnungsrate scheinen den mit der Samenalterung verbundenen Verlust an Fruchtbarkeit zu verringern. In diesem Zusammenhang müssen aber deutliche Unterschiede in der Befruchtungsleistung zwischen Ebern berücksichtigt werden, die nur teilweise Unterschieden in der Spermienqualität, wie Motilität und Morphologie, zugeordnet werden können (WEITZE 1990). Die alterungsbedingten funktionellen Veränderungen in den unterschiedlichen Kompartements der Samenzelle, wie Mitochondrien, Geißel, Akrosom und