Prüfung verschiedener Testkits auf Eignung zum schnellen Nachweis von aviärem Influenzavirus bei Verdacht auf Klassische Geflügelpest

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1 OIE und NRL für ND und AI im Institut für Virusdiagnostik Friedrich-Loeffler-Institut Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Federal Research Institute for Animal Health Prüfung verschiedener Testkits auf Eignung zum schnellen Nachweis von aviärem Influenzavirus bei Verdacht auf Klassische Geflügelpest Einleitung: Die Schnelligkeit der Diagnosestellung ist bei Klassischer Geflügelpest von enormer Bedeutung, da nur durch sofort einsetzende Sperr- und Bekämpfungsmaßnahmen eine unkontrollierte Verschleppung des Erregers verhindert werden kann. Die klinischen Veränderungen und das Sektionsbild allein reichen auf Grund ihrer geringen Spezifität für die Diagnosestellung nicht aus, deshalb muss der Erreger nachgewiesen werden. Die klassische Geflügelpest wird durch hochpathogene (HP) aviäre Influenzaviren (AIV) der Subtypen H5 und H7 verursacht. Auch niedrig pathogene (LP) Viren vom Subtyp H5 und H7 sind anzeige- und bekämpfungspflichtig. Obwohl letztere nur schwache oder keine Krankheitszeichen auslösen, besitzen sie die Potenz zur sprunghaften Steigerung der Pathogenität und sind deshalb als potentielle Geflügelpesterreger anzusehen. Influenzaviren anderer Subtypen können schwache bis mittelgradige Erkrankungen verursachen, werden aber tierseuchenrechtlich nicht gemaßregelt. Eine labordiagnostische Untersuchung auf AIV wird demzufolge aus verschiedenen Anlässen durchgeführt: Untersuchung bei Verdacht auf Geflügelpest auf Grund der Klinik, Pathologie oder epidemiologischer Verbindungen, Überwachungsuntersuchungen von gesunden Geflügelbeständen auf Influenzavirus vom Subtyp H5 und H7, Untersuchung von Wildvögeln auf AIV. Die Labordiagnose erfolgt mittels PCR (M-PCR, HA-H5-PCR, HA-H7-PCR) und kann innerhalb eines Werktages durchgeführt werden. Parallel wird das Virus in Bruteiern isoliert und serologisch subtypisiert. In Abhängigkeit von der Pathogenität des Virus dauert letzteres Verfahren 3-14 Tage. Beide Nachweisverfahren erfordern spezifisch ausgerüstete Laboratorien und ausgebildetes Personal, können also nur in den Veterinäruntersuchungsämtern erfolgen. Die hier geprüften Schnelltest erfordern keine spezifische Laborausrüstung und könnten in einer tierärztlichen Praxis oder vom Amtstierarzt durchgeführt werden Testkits Die in die vergleichende Prüfung einbezogenen 10 Testkits verschiedener Hersteller sind in Tabelle 1 aufgeführt. Bei allen Tests handelt es sich um chromatographische Immunoassays zum Nachweis von Influenzavirus-Antigen. Nur 4 Tests wurden speziell für den Nachweis von Influenzavirus bei Geflügel/Vögeln entwickelt. Sechs Tests sind für die Anwendung in der Humanmedizin konzipiert. Neun Testkits enthalten Teststreifen für die Prüfung von Einzelproben. Bei einem Test handelte es sich jedoch um einen üblichen ELISA mit 96er Platten. Keines der Testkits ist bisher für die aväre Influenzadiagnostik zugelassen. Einige befinden sich noch in der Entwicklungsphase und wurden mittlerweile verändert

2 Untersuchungsmaterial Für die Prüfung wurden 6 verschiedene AIV eingesetzt. Ausgewählt wurden sowohl HP als auch LP Stämme vom Subtyp H5, ein hoch pathogener H7-Stamm sowie Viren vom Subtyp H6 und H9, die in den letzten Jahren in Deutschland, in anderen Ländern auch heute noch, bei Wirtschaftgeflügel verbreitet sind. Im Einzelnen handelt es sich um: A/turkey/Germany/R04/02 (H6N2) A/turkey/Germany/R22/96 (H9N2) A/chicken/Italy/22/98 (H5N9) LP, Isolat aus Hühnern, A/teal/Germany/WV1379/03 (H5N2) LP, Isolat aus Wildvogel, A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1) HP, H5N1- Virus aus Asien, A/chicken/Germany/R28/03 (H7N7) HP, aus Geflügelpestausbruch Für die erste Prüfung wurden diese Virustämme in 10er Potenzen in serumhaltigem Medium verdünnt und die Verdünnungen portioniert und bei 70 C bis zur Verwendung eingefroren. Die zweite Prüfung erfolgte an Rachen- und Kloakentupferproben von infizierten Tieren. Um einheitliches Probenmaterial für alle zu prüfenden Tests einsetzen zu können, wurden jeweils 5 Hühner mit AIV okulonasal infiziert und von ihnen in den Folgetagen Abstriche aus dem Rachen und der Kloake entnommen. Die jeweils 5 gleichen Tupfer wurden zusammen aufgearbeitet, indem sie in 5 ml serum- und antibiotikahaltigem Medium 30 Minuten geschüttelt wurden. Anschließend wurde die Flüssigkeit aliquotiert und bei 70 C bis zur Testung gelagert. Von einem Aliquot jeder Probe wurde der Virusgehalt im Brutei bestimmt und es erfolgte eine Untersuchung mittels real-time-m-pcr. Die Testung erfolgte nach der jeweiligen Gebrauchsanweisung der Kits. Je nach Vorschrift wurden Tupfer in die Probenflüssigkeit getaucht oder die Flüssigkeit wurde direkt im Test eingesetzt. Ergebnisse Um die Vergleichsuntersuchung anonym zu gestalten, stimmt in den folgenden Tabellen die Reihenfolge der Tests nicht mit der in Tabelle 1 überein. In Tabelle 2 und 3 wurden aber die gleichen Code-Nummern verwendet. Die anhand der Virusverdünnungsreihen ermittelten Nachweisgrenzen für die verschiedenen AIV gehen aus Tabelle 2 hervor. Neben dem Virustiter in log 10 (Eiinfektiöse Dosis 50%, EID 50 ) sind auch die Intensität der Reaktion und die Zeitdauer bis zur vollen Ausprägung der Reaktion angegeben. In der Tabelle wurden die geringsten noch nachgewiesenen Virusmengen markiert. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung der Tupferproben von Hühnern, die mit HP AIV infiziert wurden. Nach Infektion mit H5N1-Virus verendeten alle Tiere 2 dpi. Die mit H7N7-Virus infizierten Tiere zeigten ab 2 dpi Krankheitszeichen und starben 3 dpi. Deshalb konnte nur an 2 bzw. 3 Tagen Tupfer genommen werden. Aus allen Tupfern konnte im Brutei Virus isoliert werden. Der Virusgehalt war bei den H5N1-infizierten Tieren mit 10 4,5 bis 10 5,5 EID 50 /0,2ml sehr hoch. Die Proben von den H7N7-infizierten Tieren enthielten generell geringere und unterschiedliche Virusmengen. Die Virusausscheidung zeigt einen typischen Verlauf. Am 1. dpi waren im Rachen noch Reste des Inokulums nachweisbar. Mit Zunahme der klinischen Erkrankung stieg auch der Virusgehalt in Rachen und Kloake an und war kurz vor dem Tod der Tiere am höchsten. Die mit LP AIV infizierten Tiere sind klinisch nicht erkrankt. In Tabelle 4 sind die bisherigen Untersuchungsergebnisse der Tupferproben ausgewiesen. Die mit H6N2- oder - 2 -

3 mit H9N2- Virus infizierten Tiere schieden das Infektionsvirus nur in geringer Menge und unregelmäßig aus. Die höchsten Virustiter betragen 10 2,8 EID 50 /0,2ml. Das H5N2-Isolat aus einem Wildvogel ließ sich bei den infizierten Hühnern weder im Rachen noch in der Kloake nachweisen. Die Entwicklung spezifischer Antikörper zeigte aber, dass die Infektion angegangen war. Wegen mangelnder personeller Kapazität konnten diese Tupferproben noch nicht mit den Schnelltests untersucht werden. Deshalb kann auf der Basis der vorliegenden Ergebnisse nur vermutet werden, dass der Virusgehalt in den Proben unter der Nachweisgrenze der Tests liegen wird. Wertung Mit allen geprüften Tests konnten aviäre Influenzaviren der Subtypen H5, H6, H7 und H9 nachgewiesen werden, darunter auch aktuelles H5N1-Virus aus Asien. Die Empfindlichkeit der Tests ist unterschiedlich. In dem ersten Versuch mit Virusverdünnungen zeigen einige Tests schon Virusmengen ab 10 4,8 EID 50 / 0.2 ml an. Andere Tests brauchten die 10 bis 100fache Virusmenge, um eine eindeutige positive Reaktion zu geben. In der Prüfung an Tupferproben zeigten alle Tests eine höhere Emfindlichkeit als nach den Ergebnissen des Vorversuchs erwartet. Allerdings gibt es auch hier große Unterschiede. Das H5N1-Virus wurde von 8 Kits schnell und sicher nachgewiesen. Nur die in den Ergebnistabellen in Position 1 und 2 aufgeführten Kits zeigten eine schwache oder keine Reaktion. Das H7N7-Virus ist in den Proben nur in geringeren Mengen vorhanden, demzufolge gaben die Tests auch negative, fragliche und schwache Reaktionen. Ab einem Titer von > 10 3 EID 50 / 0.2 ml gelang jedoch der Nachweis mit den meisten Kits. Bei Schlussfolgerungen für die praktische Diagnostik ist zu bedenken, dass es sich bei den untersuchten Tupferproben um Sammelpools aus je 5 Einzelproben handelte, die einen Mittelwert repräsentierten. Zum gleichen Zeitpunkt pi gewonnen, haben einzelne Einzelproben sicher einen höheren, andere dagegen einen geringeren Virusgehalt. Deshalb muss eine ausreichende Anzahl Tiere untersucht werden. Generell ist einzuschätzen, dass mit den Schnelltests aviäre Influenzaviren nachgewiesen werden können. Sie eignen sich auch für die Untersuchung von Rachen- und Kloakentupfern von Geflügel. Für eine positive Reaktion ist allerdings eine beträchtliche Virusmenge notwendig, wie sie in der Regel nur nach einer Infektion mit hoch pathogenen Virusstämmen bei klinisch erkrankten Tieren erreicht wird. Im Falle eines klinischen Verdachtes auf Geflügelpest kann durch ein positives Schnelltest-Ergebnis der Verdacht erhärtet werden. Parallel dazu oder sofort im Anschluss muss dennoch die gesetzlich vorgeschriebene Untersuchung eingeleitet werden, die zur exakten Diagnosestellung mit Bestimmung des Virus-Subtyps und der Pathogenität des Erregers führt. Wegen der relativ geringen Sensitivität der Schnelltests kann bei einem negativen Ergebnis der Verdacht auf Geflügelpest nicht fallengelassen werden, sondern der Ausschluss erfordert die vorschriftsmäßige Untersuchung im Speziallabor. Für Überwachungsuntersuchungen auf Influenzavirus bei gesunden Tieren eignen sich die Schnelltests auf Grund der geringen Sensitivität nicht, da von infizierten, aber klinisch gesunden Tieren in der Regel nur sehr wenig und auch nicht kontinuierlich Virus ausgeschieden wird. Insel Riems, Dr. Ortrud Werner - 3 -

4 Tabelle 1 In die vergleichende Prüfung einbezogene Schnelltests Firma Bezeichnung Vom Testhersteller empfohlenes Untersuchungsmaterial Biochek Nucleoprotein ELISA Vogel: Trachealtupfer Synbiotics Flu Detect TM Test Strip Influenza Typ A Antigen Testkit Vögel: Trachealabstriche, Kloakenabstrich Animal Genetics, Korea Anigen Rapid Avian Influenza Virus Antigen Test Kit Vögel: Kloakenabstrich, Fäzes MegaCor Austria FASTest R AIV Ag. ad us. Vet. Geflügel: Kloakenabstrich, Fäzes Medix Biochemica, Finnland Actim tm INFLUENZA A&B Human: Nasenaspirat, Nasenspülflüss., Nasenabstrich Roche Diagnostics Influenza A/B Rapid Test Human: Rachen-, Nasenabstriche Quidel QuickVue Influenza A+B test Human: Nasenabstrich, Nasenspülflüss., Nasenaspirat Becton Dickinson BD Directigen TM FLU A Human: Nasopharyngealspülflüss, - aspirat (Abstrich weniger gut) Coris BioConcept Influ A&B Respi-Strip Human: NPS, washes or swabs Keine Nasenabstriche Meridian Bioscience ImmunoCard STAT! R Flu A&B PLUS Human: Nasenspülflüss., Nasen-Rachen-Aspirat, Nasen-Rachen-Abstrich - 4 -

5 Tabelle 2 Nachweis von verschiedenen AIV in Verdünnungsreihen. Die Viren wurden in 10er Potenzen in serumhaltigem Medium verdünnt und nach Testvorschrift geprüft. Ergebnisse angegeben als: Virustiter in log 10 EID 50 /0,2 ml Intensität der Reaktion Positivkontrolle im Testkit +++ Stärker als Positivkontrolle ++++ Schwächer als Positivkontrolle ++ Sehr schwache Reaktion + Kaum erkennbare Reaktion (+) Reaktionszeit in Minuten bis zur vollen Ausprägung der Reaktion (in Klammern) Die geringsten, aber noch eindeutig mit + angezeigten Virusmengen sind dunkel hinterlegt. Virus Testkit H6N2 H9N2 LP H5N9 10 7,8 /0,2ml LP H5N2 10 8,2 /0,2ml HP H5N1 10 8,5 /0,2 ml HP H7N7 10 7,8 / 0,2ml 1 7, (1) 6,5 ++ ( 6) 7,5 +++ ( 2) 6,5 (+) ( 6) 6, (2) 5,8 ++ (4) 7,2 +++ (2) 6,2 + (7) 5,2 neg 7,5 +++ (3) 6,5 + (7) 6,8 +++ (2) 5,8 ++ (5) 2 7, (<1) 6,5 ++ (8) 5,5 (+) (15) 7,5 ++ (<1) 6,5 (+) (15) 6,8 ++ (<1) 5,8 (+) (15) 7,2 +++ (<1) 6,2 + (7) 5,2 (+) (15) 7,5 (+) (15) 6,5 neg 6,8 +++ (1) 5,8 + (3) - 5 -

6 3 7,5 + (8) 6,5 (+) (15) 7,5 ++ ( 7) 6,5 (+) (15) 6,8 + (10) 5,8 (+) (15) 7,2 + (7) 6,2 (+) (15) 5,2 neg 7,5 ++ (10) 6,5 + (15) 6,8 ++ (4) 5,8 + (15) Testkit Virus H6N2 H9N2 LP H5N9 10 7,8 /0,2ml LP H5N2 10 8,2 /0,2ml HP H5N1 10 8,5 /0,2 ml HP H7N7 10 7,8 / 0,2ml 4 7, (<1) 6,5 ++ ( 1) 5,5 + (10) 4,5 (+) (15) 3,5 neg 7, (<1) 6,5 ++ (1) 5,5 + (10) 4,5? 3,5 neg 6, (<1) 5,8 ++ (1) 4,8 + (7) 7, (1) 6,2 ++ (2) 5,2 + (10) 7, (<1) 6,5 ++ (4) 5,5 + (8) 6, (<1) 5,8 +++ (1) 4,8 + (6) 3,8 (+) (15) 2,8 neg 5 Avian Influenza Virus Antigen Test Kit Vertrieb Labor Diagnostik Leipzig 7,5 +++ (1) 6,5 ++ (3) 5,5 (+) (20) 7,5 +++ (1) 6,5 ++ (2) 5,5 (+) (15) 6,8 +++ (1) 5,8 ++ (4) 4,8 (+) (15) 7,2 +++ (1) 6,2 ++ (2) 5,2 + (20) 7,5 +++ (<1) 6,5 + (9) 6,8 +++ (<1) 5,8 ++ (8) 4,8 (+) (25) 6 7,5 +++ (1) 6,5 ++ (3) 7,5 +++ (1) 6,5 + (6) 6, (1) 5,8 +++ (3) 4,8 (+) (15) 7,2 +++ (1) 6,2 + (6) 5,2 neg 7,5 +++ (<1) 6,5 + (5) 6,8 +++ (<1) 5,8 + (5) 7 7,5 + 6,5 + 5,5 + 4,5 + 3,5 neg 7,5 + 6,5 + 5,5 + 6,8 + 5,8 + 4,8 + 7,2 + 6,2 + 5,2 + 7,5 + 6,5 + 5,5 + 6,8 + 5,8 + 4,

7 Testkit H6N2 H9N2 LP H5N9 10 7,8 /0,2ml Virus LP H5N2 10 8,2 /0,2ml HP H5N1 10 8,5 /0,2 ml HP H7N7 10 7,8 / 0,2ml 8 7, (<1) 6,5 +++ (1) 5,5 + (5) 7, (<1) 6,5 ++ (1) 5,5 + (6) 6, (<1) 5,8 +++ (1) 4,8 + (5) 7, (<1) 6,2 +++ (1) 5,2 + (6) 7, (<1) 6,5 ++ (2) 5,5 + (7) 4,5 (+) (15) 3,5 neg 6, (<1) 5,8 +++ (2) 4,8 ++ (5) 3,8 (+) (10) 2,8 neg 9 7,5 +++ (1) 6,5 +++ (1) 5,5 + (4) 7,5 +++ (1) 6,5 ++ (2) 5,5 (+) (4) 6, (1) 5, (1) 4,8 ++ (4) 7, (1) 6,2 +++ (1) 5,2 + (4) 7, (<1) 6,5 ++ (1) 5,5 (+) (5) 6, (<1) 5,8 +++ (12) 4,8 + (5) 10 7,5 +++ (1) 6,5 ++ (1) 7, (1) 6,5 + (2) 6,8 +++ (1) 5,8 ++ (2) 7, (1) 6,2 ++ (1) 5,2 neg 7,5 +++ (1) 6,5 + (5) 6,8 +++ (1) 5,8 ++ (3) 4,8 (+) (10) - 7 -

8 Tabelle 3 Untersuchung von Rachen- und Kloaken-Tupferproben von HP AIV infizierten Hühnern mittels verschiedener Schnelltests Testkit 14/1/R * 14/1/ 10 3,1 K HP AIV A/ch/Germ/R28/03 (H7N7) 14/2/ R 10 0,8 10 2,5 14/2/K 14/3/R 14/3/K 10 2,8 10 3,8 10 3,2 1 neg ** neg neg neg + (8) (+) (10) 2 (+) (15) neg neg neg ++ (<1) + (15) 3 + (15) neg neg (+) (15) +++ (2) + (15) 4 ++ (5) neg ++ (5) + (7) ++++ (2) +++ (2) 5 Avian Influenza Virus Antigen Test Kit Vertrieb Labor Diagnostik Leipzig +++ (<1) (+) + neg ++++ (<1) ++ (5) 6 ++ (1) neg neg (+) (15) +++ (<1) ++ (<1) 7 + neg neg neg (2) neg + (10) + (10) ++++ (0) ++ (2) (<1) neg + (5) + (2) ++++ (<1) ++ (<1) (5) neg neg + (5) +++ (1) ++ (4) Testkit HP AIV A/duck/ Vietnam/R80/05 (H5N1) 15/1/R 15/1/K 15/2/R 15/2/K 10 4,5 10 5,5 10 5,5 10 4,5 1 + (8) (+) (10) + (8) ++ (3) 2 neg neg neg + (2) 3 ++ (5) ++ (5) ++ (5) +++ (2) (<1) +++ (<1) +++ (2) ++++ (<1) 5 Avian Influenza Virus Antigen Test Kit Vertrieb Labor Diagnostik Leipzig +++ (1) +++ (1) +++ (1) ++++ (<1) (<1) ++ (1) +++ (<1) ++++ (<1) - 8 -

9 (2) +++ (2) +++ (2) ++++ (<1) (<1) +++ (<1) +++ (<1) ++++ (<1) (4) ++ (4) ++ (4) +++ (1) * Bezeichnung der Tupfer: Tierversuchs-Nr. / Tag p.i. / Rachen oder Kloake Mittels Virusisolierung im Brutei nachgewiesener Titer in EID 50 /0,2ml ** Untersuchungsergebnis: Intensität der Reaktion Positivkontrolle im Testkit +++ Stärker als Positivkontrolle ++++ Schwächer als Positivkontrolle ++ Sehr schwache Reaktion + Kaum erkennbare Reaktion (+) Keine Reaktion neg Reaktionszeit in Minuten bis zur vollen Ausprägung der Reaktion (in Klammern) - 9 -

10 Tabelle 4 Virusgehalt in Rachen- und Kloakentupferproben von Hühnern, infiziert mit unterschiedlichen LP AIV. Tupfernahme 3, 5, 7 und 10 dpi. Virus Tag und Tupferart Virustiter im Brutei in log 10 EID 50 /0,2ml real-time-m-pcr* R 22/96 H9N2 R 04/02 H6N2 WV 1379 H5N2 3 R (Rachen) 0,5 + 3 K (Kloake) negativ negativ 5 R negativ + 5 K 1,5 + 7 R negativ (+) 7 K 2, R negativ negativ 10 K 0,2 (+) 3 R negativ + 3 K 1, R negativ (+) 5 K 2, R negativ (+) 7 K 2, R negativ negativ 10 K negativ negativ 3 R negativ negativ 3 K negativ negativ 5 R negativ negativ 5 K negativ negativ 7 R negativ negativ 7 K negativ negativ 10 R negativ negativ 10 K negativ negativ *) Wertung der PCR-Ergebnisse: TC : TC : ++++ TC : +++ TC : ++ TC : + TC : (+) TC>40 : negativ