Carbaplex IVD PCR Kit

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1 Gebrauchsanweisung Carbaplex IVD PCR Kit Zum Nachweis von Carbapenemase-Genen direkt aus Rektalabstrichen und aus Kulturmaterial CARE- Produkte unterstützen unsere Kunden weltweit mit hochwertigen Verbrauchsartikeln, Zubehör und Spezial-Kits. Sprache: de Revision B (Mai 2017)

2 1 Verwendungszweck 3 2 Produktbeschreibung Kit-Komponenten 5 3 Überprüfung, Aufbewahrung und Stabilität Überprüfung nach Eingang Lagertemperatur Geeigneter Lagerort Stabilität 6 4 Risiko- und Sicherheitshinweise Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen Biologische Risiken Limitierungen des Verfahrens 8 5 Erforderliche, nicht mitgelieferte Materialien Allgemeine Ausrüstung Probengewinnungsausrüstung Real-Time-PCR-Geräte 10 6 Probengewinnung und DNA-Extraktion Empfohlene Extraktionsprotokolle (handelsübliche Plattformen) Empfohlene Extraktionsprotokolle (nur für Bakterienkulturen) 12 7 Testverfahren PCR-Vorbereitung 13 8 Thermocycler-Bedingungen ABI Rotor-Gene Q CFX QuantStudio Interpretation der Ergebnisse Interne Kontrolle Positiv- und Negativkontrolle Unbekannte Proben/Patientenproben Leistungsmerkmale Entsorgung Erläuterung der Symbole Hersteller 27 Seite 2 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

3 1 Verwendungszweck Das Carbaplex Real-Time PCR Assay ist ein in-vitro-diagnostischer Multiplex-PCR-Test (Polymerase- Kettenreaktion) zum qualitativen Nachweis der fünf häufigsten Familien von Carbapenemase-Genen. Der Assay erkennt und differenziert KPC, NDM, VIM, IMP und OXA- 48- like Gen-Targets mittels Nachweis von direkt aus Rektalabstrichproben oder Bakterienkulturen extrahierten Nukleinsäuren. Der Assay ist zum Gebrauch durch qualifiziertes Laborpersonal vorgesehen, um den Nachweis von Carbapenemase produzierenden Enterobacteriaceae (CPE) zu unterstützen, die Patienten in Gesundheitseinrichtungen besiedeln können. Es sind Parallelkulturen erforderlich, um Organismen zur epidemiologischen Typisierung, für antibiotische Resistenztests und zur weiteren konfirmatorischen Identifikation zu gewinnen. 2 Produktbeschreibung Carbapenem-Resistenz Multiresistente Bakterien sind eine weltweite Bedrohung für die öffentliche Gesundheit. Infektionen durch solche Organismen stehen mit hohen Mortalitätsraten bei Patienten in der Langzeit- Akutversorgung in Verbindung. Besonderen Anlass zur Besorgnis geben die Carbapenemase produzierenden Enterobacteriaceae, die aufgrund ihrer leichten Übertragbarkeit zwischen Patienten und Umwelt eine drängende Gefahr für die öffentliche Gesundheit darstellen. Diese Organismen sind gegen die Antibiotika der Carbapenem- Klasse resistent, die in der Therapie vieler bakterieller Infektionen als letztes Mittel gelten. In Europa kommen die folgenden Carbapenemase-Genfamilien am häufigsten vor: Klebsiella- pneumoniae - Carbapenemase (KPC), New Delhi Metallo- Beta- Lactamase (NDM), Verona integron-encoded Metallo-Beta-Lactamase (VIM), IMP-type Metallo-Beta- Lactamase (IMP) und die OXA-48-like carbapenem-hydrolysing Oxacillinasen. 1 CPE schränken die therapeutischen Optionen ein und führen zu einem Anstieg der assoziierten Morbidität und Mortalität. 2,3 Sie werden leicht durch besiedelte Personen in der Gesundheitsversorgung übertragen. In einigen Ländern gelten bestimmte CPE-Klassen bereits als endemisch. Deshalb ist ein schneller und zuverlässiger Nachweis dieser Organismen unerlässlich, um die rechtzeitige Einleitung von Kontaktsicherheitsvorkehrungen sicherzustellen und, wo erforderlich, Isolationsprotokolle definieren und im Fall einer Infektion Therapieentscheidungen treffen zu können. 4 Carbaplex Real-Time PCR Assay Der Carbaplex Real-Time PCR Assay ist ein PCR-gestützter diagnostischer Test auf die häufigsten Carbapenemase- Gene. Der Assay eignet sich für gängige Labor- PCR- Geräte und kann bis zu 96 Proben verarbeiten; die Ergebnisse liegen nach der Extraktion in weniger als 3 Stunden vor. Der Assay erkennt und differenziert KPC, NDM, VIM, IMP und OXA-48-like Targets mittels Nachweis von direkt aus Rektalabstrichproben oder Bakterienkulturen extrahierten Nukleinsäuren. Die von diesem Assay nachgewiesenen bekannten Genvarianten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Der schnelle und zuverlässige Nachweis, den dieser Test ermöglicht, kann zu einer frühzeitigeren Identifikation beitragen, sodass der richtige Umgang mit besiedelten Patienten und gleichzeitig eine rasche Umsetzung von Maßnahmen zur Infektionsvorbeugung und -kontrolle ermöglicht wird. Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 3 von 27

4 Tabelle 1 Carbapenemase-Gene und ihre Varianten, die mit dem Carbaplex Real-Time PCR Assay nachgewiesen werden können Carbapenemase-Familie Varianten KPC NDM VIM IMP OXA-48 KPC-1-19, KPC-21, KPC-22, KPC-24 NDM-1-16 VIM-1-6, VIM-8-45 IMP-1, IMP-3, IMP-6, IMP-10, IMP-25, IMP-30, IMP-34, IMP-40, IMP- 42, IMP-52 OXA-48, OXA-162, OXA-163, OXA-181, OXA-199, OXA-204, OXA- 232, OXA-244, OXA-245, OXA-247, OXA-370, OXA-405, OXA-416, OXA-438, OXA-439, OXA-484 Literatur 1. European Centre for Disease Prevention and Control. Carbapenemase- producing bacteria in Europe: interim results from the European Survey on carbapenemase- producing Enterobacteriaceae (EuSCAPE) project. Stockholm: ECDC; M. E. Falagas et al., Emerg. Infect. Dis., 2014, 20, D. Ben-David et al., Clin. Microbial. Infect., 2012, 18, European Centre for Disease Prevention and Control. Evidence brief: Update on the spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Europe, Stockholm: ECDC; 2015 Seite 4 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

5 2.1 Kit-Komponenten Die gelieferten Reagenzmengen reichen für 100 Tests. Carbaplex PCR Kit Reagenz Volumen je Röhrchen Anz. Röhrchen Verschlussfarbe PCR MM Carbaplex 1,5 ml 2 Orange 100 Carbaplex MM µl 1 Violett 100 Carbaplex MM µl 1 Gelb 100 PCR Water 800 µl 1 Weiß 200 Reaktionen je Röhrchen Carbaplex Control Kit Reagenz Volumen je Röhrchen Anz. Röhrchen Verschlussfarbe Interne Kontrolle 135 µl 3 Rot Positive Control Carbaplex 240 µl 3 Blau Negative Control 240 µl 3 Weiß Bestellinformationen Produkt Bestell-Nr. Carbaplex IVD PCR Kit Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 5 von 27

6 3 Überprüfung, Aufbewahrung und Stabilität 3.1 Überprüfung nach Eingang Das Carbaplex IVD PCR Kit ist nach dem Eingang zu überprüfen. Wenn die Verpackung beschädigt ist, darf das Kit nicht verwendet werden. Alle Reagenzien im Carbaplex IVD PCR Kit werden zudem gefroren versendet und müssen in gefrorenem Zustand eingehen. Wenn Reagenzien bei Eingang nicht gefroren sind oder die Röhrchen beim Versand beschädigt wurden, wenden Sie sich an die Bruker Daltonik GmbH. 3.2 Lagertemperatur 25 C 15 C Das Carbaplex IVD PCR Kit wird auf Trockeneis geliefert und muss nach Eingang im hier angegebenen Temperaturbereich gelagert werden. 3.3 Geeigneter Lagerort Die interne Reagenzbox mit der Bezeichnung Carbaplex PCR Kit muss in einem amplikonfreien Labor gelagert werden. Die interne Reagenzbox mit der Bezeichnung Carbaplex Control Kit enthält eine interne Kontrolle sowie Positiv- und Negativassaykontrollen und muss in dem Bereich der Einrichtung gelagert werden, in dem das DNA-Template/Proben-Template zugegeben wird. 3.4 Stabilität Die Leistung des Carbaplex Real-Time PCR Assays wird durch 10-maliges Einfrieren und Auftauen nachweislich nicht beeinträchtigt. Alle im Carbaplex IVD PCR Kit enthaltenen Reagenzien wurden zur Verwendung bis zum auf dem Kit- Etikett angegebenen Verfallsdatum validiert und müssen innerhalb dieses Zeitraums verwendet werden. Seite 6 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

7 4 Risiko- und Sicherheitshinweise Zur Herstellung des Carbaplex IVD PCR Kits werden keine Gefahrstoffe verwendet. Die Zusammensetzung aller Kitreagenzien stellt kein besonderes Risiko für den Anwender oder sein Eigentum dar. Für die Durchführung der in dieser Gebrauchsanweisung beschriebenen Verfahren werden möglicherweise zusätzliche Chemikalien und Materialien benötigt. Die vom Hersteller zur Verfügung gestellten Warnhinweise, Anweisungen und Datenblätter zur Materialsicherheit sind sorgfältig durchzulesen. Beim Umgang mit Chemikalien, biologischen Gefahrstoffen oder anderen Materialien sind die allgemein gültigen Sicherheitsvorschriften zu befolgen. 4.1 Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen Der Carbaplex Real-Time PCR Assay ist ein In-vitro-Diagnostikum. Dieser Test ist ausschließlich für den Einsatz auf PCR-Plattformen vorgesehen, auf denen der Prozess validiert wurde. Die Ergebnisse des Carbaplex Real- Time PCR Assays müssen zusammen mit den Ergebnissen weiterer diagnostischer Tests und dem klinischen Bild von geschultem Fachpersonal interpretiert werden. Das Testverfahren ist so durchzuführen, wie es in der vorliegenden Gebrauchsanweisung beschrieben ist. Jegliche Abweichung von den beschriebenen Protokollen kann zum Scheitern des Assays oder zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Dieser Test ist ausschließlich für DNA vorgesehen, die aus Rektalabstrichen sowie aus Bakterienkulturen anderer klinischer Probenmaterialien extrahiert wurde. Beim Umgang mit den Proben sind die üblichen Vorsichtsmaßnahmen und die Richtlinien der Einrichtung einzuhalten. DNA in niedrigen Konzentrationen kann instabil sein, wenn sie längere Zeit gelagert wird. Bruker rät dazu, die Probenlagerdauer vor der Testdurchführung möglichst kurz zu halten. Reagenzien nach dem angegebenen Verfallsdatum nicht mehr verwenden. Reagenzien aus unterschiedlichen Röhrchen oder Kits nicht miteinander mischen, auch wenn sie aus derselben Charge stammen. Keine Reagenzien anderer Hersteller verwenden. Darauf achten, dass die Kitreagenzien nicht kontaminiert werden. Kontamination durch Positivkontrollen und Proben verhindern, indem die gute Laborpraxis eingehalten und der Workflow entsprechend organisiert und separiert wird. Sicherstellen, dass alle zusätzlich benötigten Verbrauchsartikel DNase/RNase-frei sind. Beim Umgang mit den Kitreagenzien Schutzkleidung und Einweghandschuhe tragen. Kitreagenzien nicht verwenden, wenn das Etikettensiegel bei Eingang beschädigt ist. In Bereichen, in denen Proben oder Kitreagenzien verarbeitet werden, nicht rauchen, essen oder trinken. Nicht verwendete Reagenzien und Abfall gemäß den nationalen und örtlichen Vorschriften entsorgen. Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 7 von 27

8 4.2 Biologische Risiken Der Carbaplex Real- Time PCR Assay arbeitet mit potenziell gefährlichem und infektiösem biologischen Material. Das Personal, das mit diesen Systemen arbeitet, ist dafür verantwortlich, alle erforderlichen Gesundheits- und Sicherheitsmaßnahmen zu lesen und zu befolgen. Es ist sehr wichtig, bei der Arbeit stets geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen: mindestens Laborkittel, Schutzhandschuhe und Schutzbrille. 4.3 Limitierungen des Verfahrens Andere Carbapenemase- Gene, die nicht in Tabelle 1 aufgeführt sind, können für eine Carbapenemase- Produktion in Enterobacteriaceae verantwortlich sein und werden vom Carbaplex Real-Time PCR Assay nicht erkannt. Ein negatives Ergebnis im Carbaplex Real-Time PCR Assay bedeutet nicht, dass das Bakterium nicht Carbapenem-resistent ist. Eine Carbapenem-Resistenz kann durch verschiedene andere Mechanismen verursacht werden, die von diesem Assay nicht erkannt werden. Daher darf das Ergebnis des Carbaplex Real- Time PCR Assays nicht als Grundlage für Therapieentscheidungen herangezogen werden. Die Effizienz der Extraktion kann die Ergebnisse beeinflussen und zu falsch- negativen Ergebnissen führen. Vorläufige Daten deuten darauf hin, dass die Stabilität von extrahierter DNA durch Einfrieren und längere Lagerung beeinträchtigt werden kann. Es wird daher empfohlen, die Proben so schnell wie möglich nach der Entnahme zu verarbeiten. Falsch-positive Ergebnisse können durch eine externe Kontamination der ursprünglichen Probe oder durch eine Kontamination während der PCR-Präparation verursacht werden. Bei diesem Assay handelt es sich um einen qualitativen Test, der keine quantitativen Daten zu den nachgewiesenen Organismen liefert. Seite 8 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

9 5 Erforderliche, nicht mitgelieferte Materialien 5.1 Allgemeine Ausrüstung Geräte Empfohlene Nukleinsäure-Extraktionsplattform Validierter Real-Time-Thermocycler Abzug der Klasse II/PCR-Station Vortexer Minizentrifuge Zentrifuge für Mikroplatten (empfohlen) Kühlschrank (2 bis 8 C) und Gefrierschrank ( 25 C bis 15 C) Mikropipetten für Mengen von 1 µl bis µl Reagenzien Extraktionsreagenzien Extraktions-Positivkontrolle (empfohlen, z. B. zuvor charakterisierte Positivprobe) Extraktions-Negativkontrolle (empfohlen, z. B. nukleasefreies Wasser) Verbrauchsartikel Geeignete DNase/RNase-freie Kunststoffartikel für die PCR-Präparation DNase/RNase-freie Pipettenspitzen Einweghandschuhe, puderfrei Geeignete PCR-Kunststoffartikel für den verwendeten Thermocycler 5.2 Probengewinnungsausrüstung Rektalabstrichtupfer Abstrichtupfer zur Probengewinnung, z. B. Eswab (Copan Diagnostics) oder Sigmatranswabs (Medical Wire and Equipment), in flüssigem Amies-Transportmedium Bakterienkultur Wasser in PCR-Qualität Eppendorf-Röhrchen Densitometer oder McFarland-Standards zur Messung von Bakteriensuspensionen Zentrifuge für 1,5-mL-Mikroröhrchen Heizblock für 1,5-mL-Mikroröhrchen Vortexer Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 9 von 27

10 5.3 Real-Time-PCR-Geräte Das Carbaplex Real-Time PCR Assay wurde für verschiedene Real-Time-PCR-Geräte validiert. Die validierten Geräte und Verbrauchsartikel, die bei der Verifizierung und Validierung eingesetzt wurden, sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Details zu den Real-Time-PCR-Geräten Hersteller des Real- Time-PCR-Geräts Modell der Real- Time-PCR-Plattform Applied Biosystems ABI 7500 Fast 2.3 Bio-Rad CFX Qiagen Rotor- Gene Q HRM 5plex Applied Biosystems QuantStudio Softwareversion des Real-Time-PCR-Geräts Q-Rex (mit Plug- in Target Detection ) Validierte Verbrauchsartikel MicroAmp Fast Optical 96-Well MicroAmp Optical 8-Cap Strips MicroAmp Fast Optical 96-Well MicroAmp Optical 8-Cap Strips Qiagen Strip Tubes and Caps, 0.1 ml MicroAmp Fast Optical 96-Well MicroAmp Optical 8-Cap Strips Seite 10 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

11 6 Probengewinnung und DNA-Extraktion Die Qualität der extrahierten DNA ist maßgeblich für die von Real- Time- PCR- Assays erreichte Sensitivität. Deshalb müssen die Proben gemäß den nachstehenden Anweisungen gewonnen und aufbewahrt werden. Die Proben müssen gemäß den örtlichen Vorgaben gewonnen und gehandhabt werden. Die DNA-Extraktion aus Rektalabstrichen muss mittels einer validierten Plattform und eines validierten Verfahrens zur Nukleinsäureextraktion erfolgen. Die DNA aus Bakterienkulturen kann mittels eines Extraktionsprotokolls zur Lyse durch Kochen wie in Abschnitt 6.2 beschrieben erfolgen. Gemäß der guten Laborpraxis sollte je Analyse mindestens eine Positiv- und eine Negativextraktionskontrolle mitgeführt werden. Zur Langzeitaufbewahrung müssen extrahierte Proben bei 80 C bis 20 C gelagert werden. Hinweis DNA in niedrigen Konzentrationen kann instabil sein, wenn sie längere Zeit gelagert wird. 6.1 Empfohlene Extraktionsprotokolle (handelsübliche Plattformen) Die Protokolle für handelsübliche Extraktionsplattformen werden zur direkten Verwendung mit Abstrichen bereitgestellt, eignen sich jedoch auch für Proben aus Bakterienkulturen. Die Plattformen und die zugehörigen Parameter sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Extraktionsprotokolle zur Durchführung auf handelsüblichen Extraktionsplattformen Qiagen EZ1 Qiagen QIAsymphony biomérieux NucliSENS easymag Abstrich in 1 ml Amies- Transportmedium geben und vor Gebrauch 30 s vortexen. Abstrich in 1 ml Amies- Transportmedium geben und vor Gebrauch 30 s vortexen. Abstrich in 2 ml NucliSENS easymag Lysepuffer geben und vor Gebrauch 30 s vortexen. Verwendetes Extraktionskit DSP Virus Kit (1) QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (2) Qiagen Midi Kit Total Nucleic Acid Extraction 400 µl beimpftes Amies-Medium direkt in die Extraktionsplattform geben. 400 µl beimpftes Amies-Medium direkt in die Extraktionsplattform geben. 2 ml beimpften NucliSENS easymag Lysepuffer direkt in die Extraktionsplattform geben. Extraktionsplattform Abstrichprotokoll Extraktionsaufgabevolumen Extraktionselutionsvolumen 60 µl 60 µl 70 µl Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 11 von 27

12 6.2 Empfohlene Extraktionsprotokolle (nur für Bakterienkulturen) Protokoll für die DNA-Extraktion aus Bakterienzellsuspensionen mittels Lyse durch Kochen Aus Bouillon eine Bakterienzellsuspension mit McFarland 0,5 (ca. 1x10 8 KBE/mL) in PCR- Wasser herstellen. 200 µl von jeder Zellsuspension in separate 1,5-mL-Mikroröhrchen überführen. Die Röhrchen 10 Minuten auf 98 C aufheizen. Die Röhrchen nach der Inkubation 30 Sekunden vortexen. Die Röhrchen 2 Minuten bei maximaler Drehzahl zentrifugieren und den Überstand in ein frisches Röhrchen überführen. Entweder sofort die PCR-Reaktion aus diesem Überstand präparieren oder den Überstand bei 80 C (langfristige Aufbewahrung) bzw. bei 20 C (kurzfristige Aufbewahrung) einfrieren. Seite 12 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

13 7 Testverfahren 7.1 PCR-Vorbereitung ACHTUNG Bruker empfiehlt für die Präparation aller PCR- Reaktionen die Verwendung eines Reinraums (PCR- Labors), wobei das Template in einem Bereich außerhalb des Reinraums zugegeben wird. Um jegliches Risiko einer Kontamination zu vermeiden, ist jederzeit die gute Laborpraxis zu befolgen und der Workflow entsprechend zu separieren. Es müssen DNase/RNase-freie Kunststoffartikel verwendet werden. Hinweis Der Carbaplex Real- Time PCR Assay ist ein 2- Well- PCR- Assay, bei dem sich die Primer/Sonde-Mastermixes der beiden Wells voneinander unterscheiden. Dadurch kann ein Ergebnis für jede der Carbapenemase-Genfamilien berichtet werden. Es wird empfohlen, die einzelnen Proben, Positiv- oder Negativkontrollen mit jedem Primer/Sonde- Mastermix in nebeneinander liegenden Wells zu testen, z. B. Probe 1 in den Reaktions-Wells A1 und B1. Es liegt in der Verantwortung des Anwenders, vor der PCR- Präparation die Proben den entsprechenden Wells in der entsprechenden Platte zuzuweisen; diese Informationen müssen für eine eventuelle Nachverfolgung aufgezeichnet werden. In einem amplikonfreien Bereich das Carbaplex PCR Kit aus dem Gefrierschrank nehmen und die Reagenzien auftauen lassen. Das mitgelieferte PCR- Mastermix ( PCR MM Carbaplex ) sowie jedes der mitgelieferten Primer/Sonde- Mastermixes ( Carbaplex MM 1 und Carbaplex MM 2 ) kurz vortexen und zentrifugieren. 2 PCR- Reaktions- Mastermixes präparieren: eines mit Carbaplex MM 1 und eines mit Carbaplex MM 2; dabei die in Tabelle 4 aufgeführten Reagenzien und Volumina verwenden. Die Volumina sind pro Reaktions-Well angegeben und müssen mit der Anzahl der Reaktions-Wells multipliziert werden, dabei ist die Anzahl der Proben, der Positiv- und der Negativkontrollen in der Analyse zu berücksichtigen. Die präparierten PCR- Reaktions- Mastermixes müssen gründlich gemischt und 10 s zentrifugiert werden. Tabelle 4 Präparationsvolumina für das PCR-Reaktions-Mastermix in einem amplikonfreien Bereich Assay-Kitreagenzien PCR-Reaktion Mastermix 1 PCR-Reaktion Mastermix 2 PCR MM Carbaplex 12,5 µl 12,5 µl Carbaplex MM 1 1,25 µl - Carbaplex MM 2-1,25 µl PCR Water 0,25 µl 0,25 µl Gesamtvolumen (je Well) 14 µl 14 µl Beispiel: Für 8 Proben, 1 Positivkontrolle und 1 Negativkontrolle beträgt das Endvolumen von PCR- Reaktions- Mastermix = 140 µl und das Endvolumen von PCR- Reaktions-Mastermix = 140 µl. Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 13 von 27

14 Die PCR-Reaktions-Mastermixes vor der Pipettierung in die Reaktions-Wells in den Template- /Probenzugabebereich überführen, um die interne Kontrolle zuzugeben. Das Carbaplex Control Kit aus dem Gefrierschrank nehmen und die Reagenzien auftauen lassen. Das interne Kontrollmaterial muss jedem der PCR-Reaktions-Mastermixes zugegeben werden. Von der interne Kontrolle wird 1 µl je Reaktions-Well zugegeben (siehe Tabelle 5). Tabelle 5 Endvolumina der PCR-Reaktions-Mastermixes einschließlich interner Kontrolle Mastermix-Reagenzien + interne Kontrolle PCR-Reaktion Mastermix 1 PCR-Reaktions-Mastermix (aus Tabelle 4) 14 µl 14 µl Internes Kontrollmaterial 1 µl 1 µl Gesamtvolumen (je Well) 15 µl 15 µl PCR-Reaktion Mastermix 2 Beispiel: Bei 10 Reaktions-Wells (8 Proben, 1 Positivkontrolle und 1 Negativkontrolle) müssen jedem der Stamm-Mastermixes 10 µl des internen Kontrollmaterials zugegeben werden. Bei 10 Reaktions- Wells ergibt dies Endvolumina der PCR- Reaktions- Mastermixes von jeweils 150 µl. Für jede Probe bzw. Kontrolle je 15 µl PCR- Reaktions- Mastermix 1 und 2 in die entsprechenden Wells der Platte geben. Proben und Kontrollen müssen separat in Anwesenheit von PCR-Reaktions-Mastermix 1 und PCR-Reaktions-Mastermix 2 analysiert werden. Für jede Probe 10 µl des extrahierten Probenmaterials in einen Well mit PCR- Reaktions- Mastermix 1 und einen Well mit PCR-Reaktions-Mastermix 2 geben (siehe Tabelle 6). Für jede Positivkontrollreaktion 10 µl Positive Control Carbaplex in einen Well mit PCR- Reaktions-Mastermix 1 geben. Und: 10 µl Positive Control Carbaplex in einen Well mit PCR- Reaktions- Mastermix 2 geben. Mit jedem Mastermix muss mindestens eine Positivkontrolle mitgeführt werden, damit die Effizienz der Reaktion beurteilt werden kann. Für jede Negativkontrollreaktion 10 µl Negative Control in einen Well mit PCR- Reaktions- Mastermix 1 und einen Well mit PCR-Reaktions-Mastermix 2 geben. Mit jedem Mastermix muss mindestens eine Negativkontrolle mitgeführt werden, damit eine etwaige Kontamination beurteilt werden kann. Tabelle 6 Pipettierte Volumina von PCR-Reaktions-Mastermix 1 und 2 je Reaktions-Well Zusammensetzung des PCR-Reaktions-Wells PCR-Reaktion Mastermix 1 PCR-Reaktions-Mastermix + interne Kontrolle 15 µl 15 µl Proben-/Kontrollmaterial-Template 10 µl 10 µl Endvolumen (je Well) 25 µl 25 µl PCR-Reaktion Mastermix 2 Anschließend muss die Platte versiegelt und zur Amplifikation in einen validierten Thermocycler überführt werden. Sicherstellen, dass die Proben vor dem Einsetzen in den Thermocycler kurz zentrifugiert werden. Anweisungen zum Einrichten des Amplifikationslaufs sind dem Handbuch des Geräts zu entnehmen. Die Amplifikation muss mit den in Abschnitt 8 aufgeführten gerätespezifischen Parametern durchgeführt werden. Seite 14 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

15 8 Thermocycler-Bedingungen 8.1 ABI 7500 Informationen zum Betrieb des Real-Time-PCR-Geräts und zur Durchführung der Datenanalyse sind dem Benutzerhandbuch zu entnehmen. Die Amplifikationsplots jeder Probe müssen stets einer Sichtprüfung unterzogen werden, um sicherzustellen, dass die erfassten Ergebnisse auf eine echte Amplifikation zurückzuführen sind und nicht auf Hintergrundsignale, die die festgelegten Schwellenwerte überschreiten. In jedem Kanal den entsprechenden Fluorophor auswählen und dem zugehörigen Target gemäß Tabelle 7 zuweisen. Tabelle 7 Zum Nachweis von Carbapenemase-Gen-Targets mit dem ABI 7500 verwendete Detektorkanäle GREEN YELLOW ORANGE RED Reporter-Farbstoff-Kanal FAM JOE Texas Red Cy5 Quencher Keiner Keiner Keiner Keiner Target, nachgewiesen mit Carbaplex MM 1 Target, nachgewiesen mit Carbaplex MM 2 Das ABI 7500 mit folgenden Einstellungen konfigurieren: Interne Kontrolle KPC NDM OXA-48-like Interne Kontrolle IMP VIM n. z. Experimentart: quantitative Bestimmung Standardkurve Verwendete Reagenzien: TaqMan Reagents Rampengeschwindigkeit: Standard Reaktionsvolumen: 25 µl Passiver Referenzfarbstoff: keiner Die Einstellungen für das thermische Profil sind in Tabelle 8 aufgeführt. Es müssen Daten für alle 45 Zyklen erfasst werden. Tabelle 8 PCR-Parameter für den Carbaplex Real-Time PCR Assay Schritt Temperatur ( C) Dauer Anzahl Zyklen Datenerfassung Aktivierung min 1 Aus Denaturierung s Aus 45 Annealing/Elongation s Ein Zur Analyse der Daten sicherstellen, dass der passive Referenzfarbstoff ROX ausgeschaltet ist, und unter Options bei jedem Target das Kontrollkästchen für den automatischen Schwellenwert deaktivieren. Die Basislinie sollte weiter automatisch berechnet werden. Im Fenster Analysis settings die Schwellenwerte für die einzelnen Detektorkanäle gemäß Tabelle 9 einstellen. Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 15 von 27

16 Tabelle 9 ABI 7500 Schwellenwerte für den Carbaplex Real-Time PCR Assay Kanal FAM JOE TEXAS RED Cy5 KPC NDM OXA-48-like Target(s) Interne Kontrolle IMP VIM - Threshold Seite 16 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

17 8.2 Rotor-Gene Q Informationen zum Betrieb des Real-Time-PCR-Geräts und zur Durchführung der Datenanalyse sind dem Benutzerhandbuch zu entnehmen. Die Amplifikationsplots jeder Probe müssen stets einer Sichtprüfung unterzogen werden, um sicherzustellen, dass die erfassten Ergebnisse auf eine echte Amplifikation zurückzuführen sind und nicht auf Hintergrundsignale, die die festgelegten Schwellenwerte überschreiten. In jedem Kanal den entsprechenden Fluorophor auswählen und dem zugehörigen Target gemäß Tabelle 10 zuweisen. Tabelle 10 Zum Nachweis von Carbapenemase-Gen-Targets mit dem Rotor-Gene verwendete Detektorkanäle Reporter-Farbstoff-Kanal GREEN YELLOW ORANGE RED Target, nachgewiesen mit Carbaplex MM 1 Target, nachgewiesen mit Carbaplex MM 2 Das Rotor-Gene Q mit folgenden Einstellungen konfigurieren: 72-well rotor auswählen. Reaktionsvolumen: 25 µl Interne Kontrolle KPC NDM OXA-48-like Interne Kontrolle IMP VIM n. z. Vor der ersten Akquisition Auto Gain für alle Wells einschalten. Die Einstellungen für das thermische Profil sind in Tabelle 11 aufgeführt. Es müssen Daten für alle 45 Zyklen erfasst werden. Tabelle 11 PCR-Parameter für den Carbaplex Real-Time PCR Assay Schritt Temperatur ( C) Dauer Anzahl Zyklen Datenerfassung Aktivierung min 1 Aus Denaturierung s Aus 45 Annealing/Elongation s Ein Zur Datenanalyse mit der Option Target Detection die folgenden Einstellungen festlegen: Filterdaten: remove non-amplified curves with auswählen und unter fluorescent change (Fluoreszenzänderung) den Prozentanteil für jeden Kanal gemäß Tabelle 12 eingeben. Normalisierung: Dynamic Tube und Use Noise Slope Correction auswählen. Cq-Berechnung: Als Schwellen- Startzyklus 5 auswählen und die Schwelle für jeden Kanal gemäß Tabelle 12 eingeben. Nebensprechen-Kompensation: Unter Settings die Kompensationen Orange bleeding into Red und Yellow bleeding into Green hinzufügen, auf OK klicken und dann Compensate crosstalk aktivieren. Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 17 von 27

18 Tabelle 12 Rotor-Gene Q Schwellenwerte für den Carbaplex Real-Time PCR Assay Kanal GREEN YELLOW ORANGE RED Target(s) Interne Kontrolle KPC NDM OXA-48-like IMP VIM - Threshold 0,02 0,03 0,02 0,03 Fluorescent change 0 % 2 % 2 % 5 % Seite 18 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

19 8.3 CFX96 Informationen zum Betrieb des Real-Time-PCR-Geräts und zur Durchführung der Datenanalyse sind dem Benutzerhandbuch zu entnehmen. Die Amplifikationsplots jeder Probe müssen stets einer Sichtprüfung unterzogen werden, um sicherzustellen, dass die erfassten Ergebnisse auf eine echte Amplifikation zurückzuführen sind und nicht auf Hintergrundsignale, die die festgelegten Schwellenwerte überschreiten. In jedem Kanal den entsprechenden Fluorophor auswählen und dem zugehörigen Target gemäß Tabelle 13 zuweisen. Tabelle 13 Zum Nachweis von Carbapenemase-Gen-Targets mit dem CFX96 verwendete Detektorkanäle GREEN YELLOW ORANGE RED Reporter-Farbstoff-Kanal FAM VIC Texas Red Cy5 Target, nachgewiesen mit Carbaplex MM 1 Target, nachgewiesen mit Carbaplex MM 2 Das CFX96 mit folgenden Einstellungen konfigurieren: Probenvolumen: 25 µl Scanmodus: alle Kanäle Plattentyp: BR clear Interne Kontrolle KPC NDM OXA-48-like Interne Kontrolle IMP VIM n. z. Die Einstellungen für das thermische Profil sind in Tabelle 14 aufgeführt. Es müssen Daten für alle 45 Zyklen erfasst werden. Tabelle 14 PCR-Parameter für den Carbaplex Real-Time PCR Assay Schritt Temperatur ( C) Dauer Anzahl Zyklen Datenerfassung Aktivierung min 1 Aus Denaturierung s Aus 45 Annealing/Elongation s Ein Zur Analyse der Daten unter Baseline Setting folgende Optionen auswählen: Baseline Subtracted Curve fit (Kurvenanpassung nach Basisliniensubtraktion) Apply fluorescent drift correction (Fluoreszenzdrift-Korrektur) Zum Einstellen der Schwellenwerte für die einzelnen Detektorkanäle Baseline threshold > Single threshold > User defined aufrufen und die Werte aus Tabelle 15 eingeben. Basislinie muss auf autocalculated gesetzt bleiben. Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 19 von 27

20 Tabelle 15 CFX96 Schwellenwerte für den Carbaplex Real-Time PCR Assay Kanal FAM VIC TEXAS RED Cy5 KPC NDM OXA-48-like Target(s) Interne Kontrolle IMP VIM - Threshold Seite 20 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

21 8.4 QuantStudio 5 Informationen zum Betrieb des Real-Time-PCR-Geräts und zur Durchführung der Datenanalyse sind dem Benutzerhandbuch zu entnehmen. Die Amplifikationsplots jeder Probe müssen stets einer Sichtprüfung unterzogen werden, um sicherzustellen, dass die erfassten Ergebnisse auf eine echte Amplifikation zurückzuführen sind und nicht auf Hintergrundsignale, die die festgelegten Schwellenwerte überschreiten. In Tabelle 16 sind die Targets aufgeführt, die von den entsprechenden Detektorkanälen erkannt werden. Diese Farbstoffe als Reporter-Farbstoffe einstellen. Tabelle 16 Zum Nachweis von Carbapenemase-Gen-Targets mit dem QuantStudio verwendete Detektorkanäle GREEN YELLOW ORANGE RED Reporter-Farbstoff-Kanal FAM VIC JUN Cy5 Quencher Keiner Keiner Keiner Keiner Target, nachgewiesen mit Carbaplex MM 1 Target, nachgewiesen mit Carbaplex MM 2 Das QuantStudio 5 mit folgenden Einstellungen konfigurieren: Probenvolumen: 25 µl Interne Kontrolle KPC NDM OXA-48-like Interne Kontrolle IMP VIM n. z. Standardmodus (mit Rampengeschwindigkeiten von 1,6 C/s) Die Einstellungen für das thermische Profil sind in Tabelle 17 aufgeführt. Es müssen Daten für alle 45 Zyklen erfasst werden. Tabelle 17 PCR-Parameter für den Carbaplex Real-Time PCR Assay Schritt Temperatur ( C) Dauer Anzahl Zyklen Datenerfassung Aktivierung min 1 Aus Denaturierung s Aus 45 Annealing/Elongation s Ein Zur Analyse der Daten sicherstellen, dass der passive Referenzfarbstoff ROX ausgeschaltet ist, und bei jedem Target das Kontrollkästchen für den automatischen Schwellenwert deaktivieren. Die Basislinie sollte weiter automatisch berechnet werden. Im Fenster Analysis settings die Schwellenwerte für die einzelnen Detektorkanäle gemäß Tabelle 18 einstellen. Tabelle 18 QuantStudio 5 Schwellenwerte für den Carbaplex Real-Time PCR Assay Kanal FAM VIC JUN Cy5 Target(s) Interne Kontrolle KPC IMP NDM VIM OXA-48-like Threshold Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 21 von 27

22 9 Interpretation der Ergebnisse 9.1 Interne Kontrolle Bei einem positiven Ergebnis muss keine interne Kontrolle nachgewiesen werden. In Fällen, in denen die interne Kontrolle gescheitert ist, die Probe jedoch auf mindestens ein Carbapenemase-Gen positiv getestet wurde, ist das positive Ergebnis als gültig anzusehen. In Fällen, in denen die Probe auf allen Targets negativ getestet wurde und die interne Kontrolle ebenfalls negativ ist, muss der Anwender den Assay mit denselben Extrakten, jedoch mit 1:10- Verdünnung, wiederholen. Wenn die interne Kontrolle dann ein positives Ergebnis liefert, ist das vorherige Ergebnis wahrscheinlich auf einen Handhabungsfehler/eine PCR- Hemmung zurückzuführen und es sind die neuen Ergebnisse zu berichten. Wenn die interne Kontrolle bei der Testwiederholung weiterhin ein negatives Ergebnis liefert, muss die Probe ab dem Extraktionsschritt erneut getestet werden. 9.2 Positiv- und Negativkontrolle Bei jeder Analyse müssen mindestens eine Positiv- und eine Negativkontrolle aus dem Kontrollkit mitgeführt werden. Jede Negativ- bzw. Positivkontrolle muss auf dieselbe Weise vorbereitet und getestet werden wie die Patientenproben. Ein positives Ergebnis bei einer Negativkontrolle weist auf Fehler bei der Probenhandhabung oder eine Kontamination hin. Das Assay- Projekt muss mit einem frischen Aliquot des Negativkontrollmaterials wiederholt werden. Dabei muss sichergestellt sein, dass der Arbeitsbereich und die Geräte ordnungsgemäß dekontaminiert wurden und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) äußerst sorgfältig vorbereitet wird. Ein negatives Ergebnis bei einer Positivkontrolle weist auf ein Reagenzversagen oder Fehler bei der Probenhandhabung hin. Sicherstellen, dass alle Reagenzien ordnungsgemäß aufbewahrt wurden und ihr Verfallsdatum, sofern zutreffend, nicht überschritten haben, bevor das Assay-Projekt nach äußerst sorgfältiger PCR-Vorbereitung wiederholt wird. Die erwarteten Ergebnisse der Positivkontrolle sind in Tabelle 19 aufgeführt. Tabelle 19 Erwartete Ergebnisse der Positivkontrolle Verwendetes Primer/Sonde-Mastermix Carbaplex MM 1 Carbaplex MM 2 Erwartete positive Targets KPC POSITIV NDM POSITIV OXA-48-LIKE POSITIV IMP POSITIV VIM POSITIV 9.3 Unbekannte Proben/Patientenproben Die Amplifikationsplots jeder Probe müssen stets einer Sichtprüfung unterzogen werden, um sicherzustellen, dass die erfassten Ergebnisse auf eine echte Amplifikation zurückzuführen sind und nicht auf Hintergrundsignale, die die festgelegten Schwellenwerte überschreiten. Proben, die mit Verdacht auf CPE zum Testen eingesandt werden, können je nach Probenart erhebliche Unterschiede in der vorhandenen Materiallast aufweisen. Deshalb kann jeder C t -Wert unter Seite 22 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

23 45 bei den entsprechenden Carbapenemase-Genen eine positive Probe anzeigen. In Tabelle 20 und Tabelle 21 sind die Ergebnisse für Carbaplex MM 1 und Carbaplex MM 2 aus den einzelnen Test-Wells zusammengestellt. Tabelle 20 Mit Carbaplex MM 1 erzielte Ergebnisse Kanal Zugehöriges Carbapenemase-Gen C t -Wert Ergebnisinterpretation Green Yellow Orange Red Interne Kontrolle KPC NDM OXA-48-like > 10 Interne Kontrolle BESTANDEN N/A ODER< 10 Interne Kontrolle GESCHEITERT < 45 Probe positiv n. z. Probe negativ < 45 Probe positiv n. z. Probe negativ < 45 Probe positiv n. z. Probe negativ Tabelle 21 Mit Carbaplex MM 2 erzielte Ergebnisse Kanal Zugehöriges Carbapenemase-Gen C t -Wert Ergebnisinterpretation Green Yellow Orange Interne Kontrolle IMP VIM > 10 Interne Kontrolle BESTANDEN N/A ODER < 10 Interne Kontrolle GESCHEITERT < 45 Probe positiv n. z. Probe negativ < 45 Probe positiv n. z. Probe negativ Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 23 von 27

24 10 Leistungsmerkmale Die im Rahmen der Verifizierung und Validierung des Carbaplex Real-Time PCR Assays bestimmten Leistungsmerkmale sind in Tabelle 22 und Tabelle 23 aufgeführt. Tabelle 22 gibt die analytische Leistung bei bekannten Materialmengen an, die an der Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) von mindestens 10 Eingangskopien (DNA) analysiert wurden; Tabelle 23 fasst die klinischen Leistungsdaten aus einer multizentrischen Leistungsbewertung zusammen. Tabelle 22 Analytische Leistungsmerkmale des Carbaplex Real-Time PCR Assays Sensitivität (%) Spezifität (%) Künstlich hergestellte Proben 97,6 99,3 Tabelle 23 Klinische Leistungsmerkmale des Carbaplex Real-Time PCR Assays Leistung bei prospektiven Rektalabstrichen (%) Sensitivität (%) 100,0 96,3 Spezifität (%) 98,2 98,8 Leistung bei klinischen Isolaten (%) Die Zahlen der klinischen Leistung beruhen auf 500 Rektalabstrichen, die im Rahmen der Routineversorgung genommen wurden, und 151 klinischen Isolaten. Seite 24 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

25 11 Entsorgung Allgemeine Entsorgung Nicht verwendete Reagenzien, Abfall und Verpackungsmaterial gemäß den nationalen und örtlichen Vorschriften entsorgen. Entsorgung von Trockeneis Trockeneis enthält CO2 und muss mit Handschuhen an einem gut belüfteten Ort gehandhabt werden. Trockeneis gemäß den nationalen und örtlichen Vorschriften entsorgen. Entsorgung von Verpackungsmaterial Sämtliches Verpackungsmaterial gemäß den örtlichen Wiederverwertungsvorschriften entsorgen. Die obigen Entsorgungsanweisungen gelten für die EU- Mitgliedsstaaten. Die ordnungsgemäße Entsorgung dieses Produkts trägt zum Schutz der natürlichen Ressourcen bei und stellt sicher, dass das Produkt so wiederverwertet wird, dass potenzielle negative Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit vermieden werden. Weitere Informationen erteilt der örtliche Entsorgungsbetrieb. Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 25 von 27

26 12 Erläuterung der Symbole Die folgenden Symbole werden auf den Etiketten des Carbaplex IVD PCR Kits oder in dieser Gebrauchsanweisung verwendet. Symbol Bedeutung Verwendbar bis JJJJ-MM-TT Chargennummer Hersteller In-vitro-Diagnostikum Enthält Material für <n> Tests Artikelnummer Ober- und Untergrenze der Lagertemperatur Garantiert Konformität mit allen relevanten gesetzlichen Bestimmungen Seite 26 von 27 Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Revision B

27 13 Hersteller Bruker Daltonik GmbH Fahrenheitstraße Bremen Deutschland Support [email protected] Telefon: BRKRSUPPORT ( ) Verkaufsberatung Für allgemeine Informationen wenden Sie sich bitte an: [email protected] Für Bestellinformationen wenden Sie sich bitte an: [email protected] Telefon: Internet: Anstelle der Informationen aus älteren Dokumenten gelten die Beschreibungen und technischen Spezifikationen aus diesem Dokument. Diese können ohne vorherige Benachrichtigung geändert werden. Copyright 2017 Bruker Daltonik GmbH Revision B Carbaplex IVD PCR Kit Gebrauchsanweisung Seite 27 von 27