Seminar WiSe 2015/2016

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1 Massenspektrometrie Seminar WiSe 2015/2016 PD Dr. Markus Nett Nachwuchsgruppenleiter Libi Leibniz Institut i für Naturstoff Forschung und Infektionsbiologie i E mail: markus.nett@hki jena.de

2 Grundvorgänge der Massenspektrometrie Ionisierung Fragmentierung Massen- Fokussierung Zerfall in geladene und ungeladene Bruchstücke Trennung der gebildeten Bruchstücke nach ihrer Masse -2 -

3 Wie werden organische Substanzen ionisiert? durch Beschuss der Probenmoleküle mit Elektronen, Ionen oder Photonen Elektronenstoß-Ionisation (EI) Chemische Ionisation (CI) Fast-Atom-Bombardment (FAB) Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisation (MALDI) durch elektrische Felder Elektrospray-Ionisation (ESI) -3 -

4 Elektronenstoß-Ionisation (EI) Glühkathode Hochvakuum Torr Elektronenstrahl Spalte, elektr. Linsensysteme Vakuumschleuse mit Probenheizung positive Ionen Massenanalysator Elektronenauffänger Hochvakuumpumpe Beschuss mit energiereichen Elektronen (70 ev) harte Ionisierung (Ionisierungspotential: 7-15 ev) Spaltung chemischer Bindungen unter Bildung zahlreicher Fragmentionen -4 -

5 Chemische Ionisation (CI) Glühkathode 0,2 2 Torr Elektronenstrahl (150 ev) Probenmoleküle Ionenstrom zum Massenanalysator Elektronenauffänger Linsensystem der Ionenquelle Reaktandgas Reaktandgas wird durch Elektronenbeschuss ionisiert Protonenübertragung durch Zusammenstöße mit weiteren Reaktandgas-Molekülen Reaktion mit dem gasförmigen Analyt unter Bildung von [MH] -Ionen -5 -

6 Chemische Ionisation theoretische Grundlagen Prinzip: Ionisation erfolgt durch Ionenmolekülreaktion mit einem im Überschuß zugesetzten Reaktandgas R, z.b. Methan, Isobutan, H 2, NH 3,... Primärreaktion: Ionisation des Reaktandgases R mit hoher Energie (~150 ev) R e R 2e (Ionisation) R R RH R (Protonierung) Sekundärreaktionen: zwischen RH und dem Molekül M RH M MH R (Protonierung) [M1]-Ion RH M M-H R H 2 (H-Abstraktion) [M-1]-Ion RH M MRH [MRX]-Ion (Anlagerung) -6 -

7 Fast-Atom-Bombardment (FAB) Primärpartikel (Ar, Xe) Hochvakuum Sekundärpartikel Neutralteilchen, Ionen, Elektronen Selvedge Region Matrix Analyt Analyt in einer flüssigen, schwer flüchtigen Matrix Beschuß mit 5-30 kev-partikeln Zerstäubung der Matrix, Stosskaskade, Bildung von Sekundärpartikeln -7 -

8 Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisation (MALDI) Laserstrahl Analyt-Ion zum Massenanalysator Matrix-Ion Matrix/Analyt Analyt in einer flüssigen Matrix Ionisation mit einem gepulsten Laserstrahl Beschleunigung der entstandenen Ionen in einem elektrischen Feld -8 -

9 Elektrospray-Ionisation (ESI) Prinzip Auslaß Stickstoff: nebulizer-gas Atmosphärendruck Gegenelektrode Mikroöffnung (sample cone) Kapillare gelöste Probe Spülgas (bath-gas, Stickstoff) Spraybildung 2 6 kv Skimmer Transferoptik Ionen zum Hochvakuum und Massenanalysator Zerstäubung der Probenlösung in einem elektrischen Feld Verdampfung des Lösungsmittels => Coulomb-Explosion Detektion von Quasi-Molekülionen, v.a. [MH] und [MNa] bzw. [M-H] -9 -

10 Massenspektrum Darstellung der Ionenhäufigkeit über das Masse-Ladungsverhältnis m/z, normiert auf den Peak mit der größten Häufigkeit (Basispeak: I = 100%) Basispeak Fragmentpeaks ev-ei-ms von Myrcen m/z rel. Intensität % 78 % % 6 % 136 Molpeak M

11 Identifizierung des Molpeaks in EI-MS-Spektren meist die höchste auftretende Massenzahl Peak kann sehr geringe Intensität aufweisen (Fragmentierung) Abnahme der Intensität des Molpeaks -11 -

12 Identifizierung des Molpeaks in EI-MS-Spektren Plausible Massendifferenzen zu den nächsten Signalen? Δ4-14 sowie Δ21-25 zwischen Molpeak und erstem Fragmentpeak sind unwahrscheinlich. Der Molpeak ist immer ein Radikalkation M ungerade Elektronenzahl (OE, odd electron) Ion mit einer geraden Elektronenzahl (EE, even electron) Fragmentpeak H - Atome C - Atome - 2 N - Atome 2 1 Ergebnis gerade? ja OE nein EE

13 Identifizierung des Molpeaks Übungsaufgabe Durch peak matching wurde die Elementarzusammensetzung der folgenden Ionen bestimmt. Welches Ion kommt als Molpeak in Betracht? Ion #1: C 10 H 14 O Ion #2: C 6 H 8 NO

14 Informationen aus dem Signal des Molpeaks Summenformel Stickstoffregel Eine ungerade Massenzahl des Molekülions weist auf das Vorhandensein einer ungeraden Zahl von N-Atomen im Molekül hin. Ist die Massenzahl dagegen geradzahlig, enthält das Molekül entweder gar keinen Stickstoff oder eine gerade Zahl von N-Atomen Atomen. Isotopenmuster Hinweis auf das Vorkommen von Cl, Br, Ni, Cu, Zn, etc

15 Hochauflösende Massenspektrometrie Mit Ausnahme des Kohlenstoffisotops 12 C sind die Atommassen der Elemente nicht ganzzahlig. => Massendefekt 1 H hat eine Atommasse von 14 N hat eine Atommasse von 16 O hat eine Atommasse von u u u Wenn die Massenzahl eines Ions auf mindestens vier Dezimalstellen genau bestimmt werden kann, so läßt sich dessen monoisotopische elementare Zusammensetzung berechnen. Bestimmung der Summenformel

16 Peak-matching-Methode Die experimentell bestimmte Masse wird mit der exakten Masse einer Referenzsubstanz verglichen. In dem folgenden Beispiel wurde die Masse des Molekülions mit 566,2179 u bestimmt:

17 Abschätzen der Summenformel mit der Rule of 13 1 Abstraktion: das Molekül besteht nur aus C- und H-Atomen; die Zahl 13 entspricht der Summe der Atommassen eines C- und eines H-Atoms Molekulargewicht M/13 = n r/13 n: ganzzahliger Anteil M: r: Rest Summenformel: C n H nr Der Grad der Ungesättigtheit, d.h. die Anzahl der Doppelbindungen und/oder Ringe in dem potentiellen Molekül, berechnet sich nach der Formel: DBE = (n r 2)/ J. Chem. Educ. 1983, 60,

18 Rule of 13 Übungsaufgabe 1 Bestimmen Sie die Summenformel und den Grad an Ungesättigtheit für ein Molekülion mit der Masse 78. Um was für eine Verbindung könnte es sich handeln?

19 Abschätzen der Summenformel mit der Rule of 13 2 Für die Erweiterung der Summenformel C n H nr um andere Elemente muss zunächst das CH-Massenäquivalent subtrahiert werden. Element N O CH-Äquivalent CH 2 CH 4 DBE = 2C 2 H j Σ(B 2) 2 F P CH 7 C 2 H 7 C: H: Anzahl C-Atome in der erweiterten Summenformel Anzahl H-Atome in der erweiterten Summenformel S 35 Cl C 2 H 8 C 2 H 11 j: B: Anzahl der eingeführten Atome Anzahl der Bindungen, die das eingeführte Atom eingeht 79 Br C 6 H 7 od. C 5 H 19 I C 10 H 7 J. Chem. Educ. 1983, 60,

20 Rule of 13 Übungsaufgabe 2 Bestimmen Sie die Summenformel und den Grad an Ungesättigtheit für ein Molekülion mit der Masse 142, das entweder (i) ein Sauerstoffatom oder (ii) ein Chloratom enthält

21 Rule of 13 Übungsaufgabe 3 Sie erhalten EI-MS- und IR-Spektrum einer nicht identifizierten Verbindung. Machen Sie einen Vorschlag zu der Summenformel des betreffenden Moleküls nach Auswertung der Spektren. Um was für eine Verbindung könnte es sich handeln?

22 Doppelbindungsäquivalente (DBE) Berechnung Doppelbindungsäquivalente 1. O- und S-Atome in der Summenformel ersatzlos streichen 2. jedes Halogen durch ein H-Atom ersetzen 3. für jedes N- und/oder P-Atom die Anzahl der H-Atome um 1 reduzieren n: Anzahl der C-Atome DBE = (2 x n 2) m 2 m: Anzahl der H-Atome jede Doppelbindung z.b. C=C, C=O, C=N, C=S, N=O, N=N, S=O = 1 DBE jeder Ring = 1 DBE jede Dreifachbindung = 2 DBE z.b. C C, C N

23 Doppelbindungsäquivalente (DBE) Anwendungsbeispiele Im Falle eines gesättigten, acyclischen Kohlenwasserstoffs gilt: m = 2 x n 2 (2 x n 2) (2 x n 2) DBE = = 0 2 Verbindung Summenformel Anzahl Doppelbindungen Anzahl Ringe DBE Benzen C 6 H (2 x 6 2) = 4 Essigsäure C 2 H 4 O Ethanol C 2 H 6 O 0 0 Glycin C 2 H 5 NO Coffein C 8 H 10 O 2 N (2 x 2 2) 4 2 (2 x 2 2) 6 2 (2 x 2 2) 4 2 (2 x 8 2) 6 2 = 1 = 0 = 1 =

24 Übungsaufgabe 4 Berechnen Sie die Doppelbindungsäquivalente für die folgenden Summenformeln und machen Sie Vorschläge zu den Strukturen der jeweiligen Verbindungen! 1) C 5 H 5 N 2) C 10H 8 3) C 3 H 4 O 4 4) C 3 H 5 NO

25 Isotopenmuster Die natürlich vorkommenden Elemente sind häufig Mischungen aus mehreren Isotopen des gleichen Elements, z.b. 12 C/ 13 C (98.90/1.10); 35 Cl/ 37 Cl (75.43/24.57); 79 Br/ 81 Br (50.44/49.56) In der Massenspektrometrie werden die einzelnen Isotope eines Moleküls getrennt registriert. Isotopenpeaks Die durch Kombination mit den schwereren Isotopen gebildeten Molekülionen liegen bei entsprechend höheren MZ und werden bezeichnet: M1, M2,... Beispiel: CH 3 Cl MZ 12 C 1 H 35 3 Cl 13 C 1 H 35 3 Cl ( 12 C 2 H 1 H 35 2 Cl) 12 C 1 H 37 3 Cl ( 13 C 2 H 1 H 2 35 Cl) M M1 M1 sehr geringe Wahrscheinlichkeit M2 M2 sehr geringe Wahrscheinlichkeit

26 Isotopenmuster Molpeak M 75 ev-ei-ms von m-dichlorbenzen m/z rel. Intensität % 7 % 63 % 4 % 10 % 148 Isotopenpeaks Fragmentpeaks

27 Fragmentierungsreaktionen in der EI-MS Spaltung einer chem. Bindung Spaltung zweier Bindungen Folgespaltungen Alkylspaltung Allylspaltung Benzyl-/Tropyliumspaltung Retro-Diels-Alder-Reaktion Umlagerungen Olefinspaltung Abspaltung von CO Onium-Umlagerung α-spaltung McLafferty-Umlagerung

28 Fragmentierung bei der EI-MS e e e e Molekül e Ionisierung Molekülion Neutral- Radikal- molekül Kation Radikal Kation Neutralmolekül Radikal- Kation Radikal Kation Neutralmolekül Kation

29 Stephenson-Audier-Regel Die Ladung wird von dem Bruchstück mit dem kleineren Ionisierungspotential übernommen, d.h. von jenem Fragment, das am leichtesten ein Elektron abgeben könnte. Heteroaromaten, Aromaten und konjugierte Polyene besitzen relativ niedrige Ionisierungspotentiale

30 Fragmentierungsreaktionen allgemeine Prinzipien Fragmentierungs-Reaktionen in der EI-MS sind monomolekular endotherm kinetisch kontrolliert Welche Bindung gespalten wird, hängt ab von der Bindungsenergie der Stabilität der gebildeten Fragmente? Neutralmoleküle? durch induktive Effekte, Mesomerie oder Umlagerung stabilisierbare Kationen

31 Alkylspaltung (σ-spaltung) Spaltung erfolgt an verzweigten C-Atomen Präferenz für den Verlust des größten Alkylradikals Stabilisierung des Carbo-Kations durch induktive Effekte CH 3 < RCH 2 <RCH 2 < R 3 C CH 3 CH 3 CH 2 CH 2 C CH 2 CH 2 C CH 3 CH

32 Alkylspaltung (σ-spaltung) CH 3 H 3 C CH CH 2 CH 2 CH 2 CH Molpeak M 100

33 Übungsaufgabe 5 43 Ordnen Sie die den nachfolgenden Stellungsisomeren (C 8 H 18 ) die zugehörigen MS-Spektren zu: Ethylhexan 57 2,2-Dimethylhexan

34 Allylspaltung Spaltung erfolgt in Allylstellung Stabilisierung des Carbo-Kations durch mesomere Effekte CH = CH CH 2 CH 2 CH = CH CH 2 CH CH = CH 2 CH

35 Allylspaltung CH 3 H 3 C C = CH CH 2 CH 2 CH Molpeak M 98

36 Benzyl- oder Tropyliumspaltung Spaltung erfolgt in der Benzylstellung Stabilisierung durch Umlagerung g zum Tropylium-Kation CH CH 2 X X 2 Umlagerung

37 Benzyl- oder Tropyliumspaltung Benzyl- Spaltung C 6 H 5 CH 2 m/z 91 C 6 H 5 C 4 H m/z 134 McLafferty- Umlagerung C 3 H 7 C 6 H 5 CH 3 H2 C = CH CH 3 m/z Molpeak M

38 α-spaltung Bei einfach gebundenen Heteroatomen (O, S, N) wird bevorzugt die α-bindung gespalten, weil das entstehende Kation durch Mesomerie stabilisiert wird. Der schwerere Substituent wird bevorzugt eliminiert. R X CH 2 R R X CH 2 R X = CH 2 R

39 α-spaltung H 58 H 3 C CH 2 N CH 2 CH 2 CH Molpeak M 72 87

40 α-spaltung Spaltung erfolgt an der zur Carbonylfunktion benachbarten Bindung Stabilisierung des Carbo-Kations durch mesomere Effekte bevorzugte Eliminierung des größeren Radikals Säure < Ester < Keton R CH 2 C R = O R CH 2 C R = O C R O

41 α-spaltung 57 H 3 C CH 2 C CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 99 = O Molpeak M 128

42 Retro-Diels-Alder-Reaktion (RDA-Reaktion) Sechsgliedrige cyclische Systeme, die eine Doppelbindung enthalten, zerfallen in eine Dien- und eine En-Komponente. Ladung verbleibt i.d.r. am Dien alternative Ladungsverteilung? Detektion der En-Komponente im MS

43 Retro-Diels-Alder-Reaktion (RDA-Reaktion) m/z 136 m/z Molpeak M 136

44 McLafferty-Umlagerung Übertragung des γ-ständigen H-Atoms auf ein doppelt gebundenes Atom X X ist meistens ein Heteroatom Verschiebung der Doppelbindung Eliminierung eines Neutralteilchens mit den β- und γ-ständigen Atomen X H α γ β H X α γ β

45 McLafferty-Umlagerung γ β H 3 C CH 2 CH 2 CH 2 C OH m/z 102 α = O H 3 C CH = CH 2 H C=C(OH) 2 C 2 m/z 60 60

46 Folgespaltungen Die bei der Alkylspaltung entstandenen Kationen können durch Eliminierung von Olefinen weiter fragmentieren (Olefinspaltung): R CH 2 CH 2 C R CH 2 H 2 C = C Aus den durch α-spaltung gebildeten Kationen wird leicht CO eliminiert (CO-Verlust): C R CO R O

47 CO-Verlust CO OH O m/z 94 m/z 66 Molpeak M 94 66

48 Folgespaltungen Die bei der α-spaltung gebildeten Onium-Ionen können einer Umlagerung unterliegen (Onium-Umlagerung): R CH 2 CH 2 CH 2 X = C R CH 2 CH = CH 2 H X = C

49 Übungsaufgabe 6 Erläutern Sie die Fragmentierung der abgebildeten Verbindung bei der EI-MS

50 Übungsaufgabe 7 Erläutern Sie die Fragmentierung der abgebildeten Verbindung bei der EI-MS

51 Übungsaufgabe 8 Erläutern Sie die Fragmentierung der abgebildeten Verbindung bei der EI-MS M

52 Übungsaufgabe 9 Erläutern Sie die Fragmentierung der abgebildeten Verbindung bei der EI-MS. m/z

53 Übungsaufgabe 10 Interpretieren Sie das dargestellte MS-Spektrum im Hinblick auf charakteristische (M X)-Signale Schlüsselbruchstücke und Serien stattgefundene Fragmentierungen Arecolin