Schnellmethoden in der Mykotoxinanalytik

Transkript

1 R-Biopharm AG Schnellmethoden in der Mykotoxinanalytik,,Teststreifen Referent: Regina Schäfer Datum: 01. März 2011 Ort: Lehr- und Forschungszentrum Francisco Josephinum R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße Darmstadt, Germany

2 Management Management

3 Geschichte und Meilensteine 1988 Gründung durch Röhm GmbH Darmstadt Mitarbeiter Erste Produkte auf dem Markt, vertrieben durch Riedel de Haën Management Buy Out durch Dr. Ralf M. Dreher Eigener Vertrieb von Agri-Diagnostics Start des Vertriebs der klinischen Diagnostik ISO 9001 and DIN EN Gründung der R-Biopharm Inc. USA Firmenfusion mit Innova Labordiagostik GmbH Weltweiter, exklusiver Vertrieb der enzymatischen Testkits von 91 Roche Diagnostics

4 Geschichte und Meilensteine 2001 Betriebsübernahme (90%) der Rhône Diagnostics Technologies Ltd. Mitarbeiter Gründung von R-Biopharm Italien Umzug ins neue Geschäftsgebäude (Landwehrstraße) Gründung von R-Biopharm China Gründung von R-Biopharm LA und 235 R-Biopharm Brasilien 2007 Gründung von R-Biopharm Spanien and 280 R-Biopharm Australien 2009 Umzug ins neue Geschäftsgebäude 300 (An der neuen Bergstraße)

5 Produkte Klinische Diagnostik Lebens- und Futtermittelanalytik Stuhldiagnostik (56%) Mykotoxine (53 %) Antibiotika (13 %) Allergiediagnostik (34%) Hormone / Anabolika (5%) Lebensmittelallergene / Verfälschung (12 %) Gastroenterologie (6 %) BSE / Risikomaterial (6 %) Serologische Test (4 %) PCR (5%) Vitamine (3%) Microbiology / Hygiene (3%)

6 Methoden der Mykotoxinanalytik Dünnschichtchromatographie (Thin-Layer Chromatography - TLC) Gas/Flüssig Chromatographie (Gas-Liquid Chromatography - GLC) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Massenspektroskopie (MS) Immun Assays () Devices

7 Um Mykotoxinen/ Allergenen/Antibiotika etc. auf der Spur sein zu können, benötigt man: Selektive und empfindliche analytische Methoden die in verschiedensten, komplexen Lebensmitteln verlässliche Ergebnisse liefern und sowohl schnell in der Durchführung als auch einfach in der Handhabung sind aber auch einen flexiblen Probendurchsatz gestatten

8 Assay Design Quelle:

9 Entwicklung eines Testkits Zeitaufwand (Monate) Design des Testkits Auswahl der Antikörper 1 2 Immunisierung 4-9 (12) Testentwicklung 3 Stabilitätstests 3 Scale-Up, Produktion 3 interne Validierung 3 externe Validierung 3-36 insgesamt 2-5 Jahre

10 3-dimensionale Struktur eines Antikörpers (Ak, Ab)

11 Schnellmethoden in der Mykotoxin-Analytik Enzymlinked Immunosorbent Assay RIDASCREEN FAST DON

12 - Enzymlinked Immunosorbent Assay basierend auf der Verwendung spezifischer Antikörper gegen Mykotoxine Detektion durch eine Farbreaktion (visuell oder mittels Photometer erkennbar) quantitative, semi-quantitative oder qualitative Ergebnisse Abarbeitung größerer Probenmengen möglich (Mikrotiterplatten-Design) für Mykotoxine werden kompetitive s verwendet

13 Kompetitiver (1) Mikrotiterplatte beschichtet mit spezifischen Antikörpern Fangantikörper gegen anti-deoxynivalenol-antikörper

14 Kompetitiver (2) Zugabe der Standards bzw. Probelösung

15 Kompetitiver (3) Zugabe des Enzymkonjugats (enzymmarkiertes Deoxynivalenol) E E E E E E E E

16 Kompetitiver (4) Zugabe des anti-deoxynivalenol-antikörpers E E E E E E E E

17 Kompetitiver (5) Reaktionsstart E E E E E E E E Freies und enzymmarkiertes Deoxynivalenol konkurrieren um die Antikörperbindungsstellen. Gleichzeitig werden die anti- Deoxynivalenol-Ak von den immobilisierten Fang-Ak gebunden

18 Kompetitiver (6) Waschvorgang (3x) E E E E Nicht gebundenes, enzymmarkiertes Deoxynivalenol wird entfernt E E E E

19 Kompetitiver (7) Status nach 3-maligem Waschen Überschüssige, ungebundene Reagenzien weggewaschen E E E E

20 Kompetitiver (8) Zugabe Substrat/Chromogen S/C E E P E E Das Enzymkonjugat katalysiert die Farbänderung des Chromogens mit Hilfe des Substrats von einem farblosen Zustand in ein blaues Endprodukt (P)

21 Kompetitiver (9) Zugabe Stopp-Reagenz E E E E Die Reaktion wird abgestoppt und es entwickelt sich eine gelbe Farbe. Die Extinktion wird photometrisch gemessen.

22 Kompetitiver (10) Messen der Extinktion bei 450 nm

23 Die gemessene Extinktion (Farbintensität) ist umgekehrt proportional zur Deoxynivalenol Konzentration in der Probe bzw. im Standard Umso intensiver die Farbe, desto geringer ist die Deoxynivalenol- Konzentration

24 (single control) gebrauchsfertiger Deoxynivalenol Standard 1 (0 ppb) B/B0-Werte der Deoxynivalenol Standards 2-8 (0,074, 0,222, 0,666, 1,333, 2, 4 und 6 ppm) sind am QS-Zertifikat angegeben Standardkurve wird anhand der gemessenen Absorption von Standard 1 (0 ppb) und der im Zertifikat angeführten B/B0-Werte für die Standards 2-8 in die RIDA SOFT Win eingegeben Programm errechnet daraus die entsprechende Standardkurve und die resultierenden Gehalte an Deoxynivalenol in den Proben

25 (single control)

26 (single control)

27 RIDASCREEN FAST (SC) Assay Vermahlen der Probe Extraktion mit 70% Methanol (außer RIDASCREEN FAST DON (SC), dabei Extraktion mit Wasser) 3 Minuten schütteln Filtrieren Verdünnen Testdurchführung (ca. 8 Minuten)

28 (SC) - Enzymlinked Immunosorbent Assay Vorteile: Einfachere Abarbeitung größerer Probenmengen Kreuzreaktivität mit verwandten Molekülen Einfache Handhabung, geringe Investitionskosten Vorteile (SC): Einsparung der Kavitäten (senkt Analysenkosten) keine mykotoxinhaltigen Standardlösungen Nachteile: Kreuzreaktivität mit verwandten Molekülen

29 RIDASCREEN - Schlussfolgerung Schnell Einfach Auswertegerät Ergebnisse in weniger als 30 Minuten inklusive Probenaufarbeitung keine intensive Einschulung Streifen-/Plattenphotometer vielseitig einsetzbar (Allergen-/Vitaminanalytik, Mikrobiologie...) Vergleichbarkeit Gute Korrelation mit HPLC Ergebnissen Flexibel Kann sowohl quantitativ, semiquantitativ oder qualitativ eingesetzt werden

30 Dipstick,, Teststreifen RIDA QUICK Fumonisin

31 RIDA QUICK DON Testformat: Standards: Probenvorbereitung: Zeitbedarf: Nachweisgrenze: Spezifität: 20 Teststreifen für je eine Bestimmung, einzeln verpackt Kontrollbande am Teststreifen Homogenisieren, Extrahieren Probenvorbereitung ca. 10 min (für 10 Proben) Inkubationszeit 5 min abhängig vom Extraktionsvolumen ca. 0,5 ppm / ca. 1,25 ppm Weizen, Triticale und Mais

32 RIDA QUICK DON Vorbereitungen (1) Reagenzien vor Gebrauch auf RT bringen Extraktionspuffer liegt als read-to-use Reagenz vor

33 RIDA QUICK DON Vorbereitungen (2) Vermahlung einer ausreichend homogenisierten Probe Für eine effiziente Probenextraktion, sollte die Oberfläche der Probe so groß wie sein!

34 RIDA QUICK DON Vorbereitungen (3) 1 g der zerkleinerten Probe einwiegen Extraktionspuffer abmessen und zur Probe hinzufügen 1 g + 40 ml Puffer 1,25 ppm NWG 1 g + 15 ml Puffer 0,5 ppm NWG 1

35 RIDA QUICK DON Vorbereitungen (4) Vollständige Extraktion durch ca. 3 min kräftiges Schütteln (manuell oder mittels Schüttler)

36 RIDA QUICK DON Vorbereitungen (5) Lösung sedimentieren lassen (ca. 3 5 min, alternativ filtrieren oder zentrifugieren)

37 RIDA QUICK DON Durchführung (1) 100 µl des Überstandes ( 5 Tropfen mit der Einwegpipette) auf das Applikationsfeld des Teststreifens auftragen

38 RIDA QUICK DON Durchführung (2) Nach 5 min (+/- 1) bei RT (20-25 C) die Reaktion durch Zugabe von 100 µl (5 Tropfen) Stopplösung abstoppen (Ergebnis wird fixiert)

39 RIDA QUICK DON Auswertung Negativ <1250 µg/kg (ppb) Testbande Kontrollbande Applikationsfeld Positiv >1250 µg/kg (ppb)

40 RIDA QUICK DON Teststreifen ohne Gehäuse 500 ppb 750 ppb 1250 ppb 2000 ppb 4000 ppb Testbande Kontrollbande positiv

41 RIDA QUICK Schnelltests Zubehör Gerätekoffer Transferpipetten

42 RIDA QUICK Schnelltests Zubehör Auswertegerät

43 RIDA QUICK Fumonisin Format Testformat: Standards: Probenvorbereitung: Zeitbedarf: 25 Teststreifen für je eine Bestimmung, einzeln verpackt Kontrollbande am Teststreifen Homogenisieren, Extrahieren Probenvorbereitung ca. 10 min (für 10 Proben) Inkubationszeit ca. 5 min Nachweisgrenze: ca. 2 ppb (bei Verdünnungsfaktor 10) Spezifität: Mais

44 RIDA QUICK Aflatoxin Format Testformat: Standards: Probenvorbereitung: Zeitbedarf: Nachweisgrenze: Spezifität: 20 Teststreifen für je eine Bestimmung, einzeln verpackt Kontrollbande am Teststreifen Homogenisieren, Extrahieren Probenvorbereitung ca. 10 min (für 10 Proben) Inkubationszeit ca min ca. 4 ppb Getreide, Nüsse, Pistazien, Mandeln, Feigen und Cashew Kerne

45 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit