Mykotoxin-Schnellmethoden Untersuchungen zur Eignung zweier Testsysteme bei der Ermittlung von DON-Gehalten in Weizen

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1 Mykotoxin-Schnellmethoden Untersuchungen zur Eignung zweier Testsysteme bei der Ermittlung von DON-Gehalten in Weizen Sandra Masloff und Thomas Betsche Forschung Institut für für Biochemie die Sicherheit von Getreide unserer und Lebensmittel Kartoffeln

2 Mykotoxine sind Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen und phytopathogenen Pilzen. Lebensmittel Futtermittel Ölhaltige Samen Aspergillus Aflatoxine Mutterkornpilze Fusarium Penicillium Aspergillus Getreideprodukte Ergotalkaloide Trichothecene Fumonisine Zearalenon Aflatoxine Ochratoxin Carryover? Obst & Gemüse Aspergillus Penicillium Patulin verändert nach G. Engelhardt, LGL, 2004

3 Fusarium-Pilze Fusarien entwickeln sich als phytopathogene Pilze auf Getreidepflanzen Bildung von verschiedenen Mykotoxinen: z.b. Deoxynivalenol (DON) Symptome bei Tier & Mensch: Erbrechen, Futterverweigerung, Durchfall, und Langzeitwirkungen Fusarium graminearum Weizenkörner mit Fusarienbefall

4 Höchstwerte Seit gelten Höchstwerte für bestimmte Fusarientoxine (EU-Verordnung (EG) 856/2005) Höchstwert für Deoxynivalenol (DON) in unverarbeitetem Getreide: Weizen: 1250 µg/kg Sowohl für Erzeuger als auch aufnehmende Hand sind Schnelltests zur Bewertung von Weizenpartien ein wichtiges Instrument.

5 Anforderungen an Mykotoxin-Schnelltests Zuverlässigkeit leichte Handhabung, weil ggf. von Personen ohne Laborerfahrung durchzuführen Praxistauglichkeit, weil ggf. kein chemisches Untersuchungslabor zur Verfügung steht

6 Charakteristika der zwei getesteten erwerblichen Schnelltests RIDA QUICK DON Reveal DON Vorbereitung Probenahme und Vermahlung Probenahme und Vermahlung Extraktion mit Puffer mit Wasser Filtration ja (Ergebnis dieser Studie) Durchführung mit Tropfpipette mit Mikroliterpipette ja Auswertung Nach Augenschein an Hand einer Auswertehilfe (Karte) mit einem Auswertegerät Aussage qualitativ je nach Einwaage liegt der Schwellenwert für eine ja/nein- Antwort bei: 1000 µg/kg DON 1250 oder höher semiquantitativ: Zuordnung zu einem Konzentrationsbereich < 500, , > 2000 µg/kg DON

7 Ziele Zuverlässigkeit der Testsysteme: Treffsicherheit Reproduzierbarkeit Eignung für Personen mit und ohne Laborerfahrung Durchführung und Auswertung

8 RIDA Quick DON: Ablaufschema Probenahme Vermahlung Extraktion (Probe + Puffer -> Schütteln) Filtration Aufgabe einer definierten Menge des Filtrats auf das Probenfeld Inkubation Auswertung an Hand der Auswerte-Karte Die Bildproportionen wurden zur besseren Darstellung verändert

9 1 Flow chart of an immunochromatographic test for the detection of DON (example Rida Quick DON, r-biopharm) 1) grind sample Crush grains (mill) 10. Compare band density with those of the evaluation card: result 2 2. mix 9. incubate for 10 min weigh 2 g 8. apply 120 µl of filtrate to dip-stick 4. add 10 ml of extraction buffer agitate for 3 min 6. filtrate 7. label the reaction strip 5 6 7

10 RIDA Quick DON: Auswertung Die Bildproportionen wurden zur besseren Darstellung verändert DON-Gehalt [µg/kg] gemäß HPLC

11 RIDA Quick DON: Auswertung unter 1000µg/kg über 1000µg/kg

12 RIDA Quick DON: Treffsicherheit des Tests ermittelt anhand von 43 natürlich kontaminierten Weizenproben 3-fach-Bestimmung mit 3-fach-Auswertung: Teststreifen 1 Testdurchführung Person A mit Laborerfahrung Auswertung durch Person A Auswertung durch Person B Auswertung durch Person C Teststreifen 2 Teststreifen 3 Person B ohne Laborerfahrung Testdurchführung Person C ohne Laborerfahrung Auswertung durch Person A Auswertung durch Person B Auswertung durch Person C Auswertung durch Person A Auswertung durch Person B Auswertung durch Person C

13 RIDA Quick DON: Ergebnisse zur Treffsicherheit Anzahl der Auswertungen DON-Gehalt in µg/kg (HPLC) richtige Interpretation Schwellenwert 1000 µg/kg falsche Interpretation

14 RIDA Quick DON: Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit an vier Proben Versuchskonzept: Person A (Laborerfahrung) 7 Teststreifen Auswertung durch Person A Auswertung durch Person B Auswertung durch Person C Person B (keine Laborerfahrung) Person C (keine Laborerfahrung) 7 Teststreifen 7 Teststreifen Auswertung durch Person A Auswertung durch Person B Auswertung durch Person C Auswertung durch Person A Auswertung durch Person B Auswertung durch Person C

15 RIDA Quick DON: Reproduzierbarkeit Auswertungen Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Interpretation falsch Interpretation richtig DON-Gehalt in µg/kg (HPLC)

16 RIDA Quick DON: Variabilität bei der Auswertung Beurteilung aller Teststreifen durch die drei Testpersonen: DON-Gehalt [µg/kg] Übereinstimmend richtige Auswertung Unsicherheit bei der Auswertung < Übereinstimmend falsche Auswertung > Proben mit DON-Gehalten von mehr als ca µg/kg sind relativ sicher identifizierbar. Proben mit deutlich unter der Nachweisgrenze liegenden DON- Gehalten wurden häufig als positiv bewertet. Es werden ggf. mehr Proben aussortiert als erforderlich.

17 RIDA Quick DON: Test-Handling für Personen mit und ohne Laborerfahrung problemlos für Personen mit Laborerfahrung nach kurzer Einweisung problemlos für Personen ohne Laborerfahrung Übung bei der Auswertung ist für beide Personengruppen erforderlich keine Unterschiede in den Ergebnissen der Testpersonen mit und ohne Laborerfahrung erkennbar

18 Charakteristika der Schnelltests RIDA QUICK DON Reveal DON Vorbereitung Probenahme und Vermahlung Probenahme und Vermahlung Extraktion mit Puffer mit Wasser Filtration ja (Ergebnis dieser Studie) ja Durchführung mit Tropfpipette mit Mikroliterpipette Auswertung per Auge an Hand einer Auswertekarte mit einem Auswertegerät Aussage Qualitativ (semiquantitativ) Schwellenwert für ja/nein- Antwort je nach Einwaage bei 1000, 1250 oder höher semiquantitativ: Zuordnung zu einem Konzentrationsbereich < 500, , > 2000 µg/kg DON

19 Reveal DON: Auswertung Die Auswertung erfolgt mit einem Auswertegerät Die Bildproportionen wurden zur besseren Darstellung verändert HPLC DON-Gehalt [µg/kg]

20 Versuchskonzept I. 28 natürlich kontaminierte Proben: Bestimmung mit je einem Teststreifen mind. Dreifachmessung mit dem Auswertegerät bei nicht einheitlichen Ergebnissen: weitere Messungen Durchführung von einer nicht laborerfahrenen Person II. 20 natürlich kontaminierte und 4 dotierte Proben: Bestimmung mit drei Teststreifen je Probe Zwei bis Mehrfachmessung mit dem Auswertegerät Durchführung von einer laborerfahrenen Person

21 Reveal DON: Ergebnisse zur Treffsicherheit 8 ertungen w Anzahl der Aus HPLC: Bereiche des Auswertegeräts: < > 2000 Ergebnis richtig Ergebnis zu niedrig Ergebnis zu hoch DON-Gehalt [µg/kg]

22 Reveal DON: Variabilität bei der Durchführung und der Auswertung Zweifach-Messung wird empfohlen. Analyse von 20 Proben mit Dreifachbestimmung (insgesamt 60 Teststreifen): Sieben Teststreifen lieferten auch bei Mehrfach-Messung ein falsches Ergebnis Wichtig: bei drei dieser Testsstreifen war DON an der Grenze zwischen Konzentrationsbereichen

23 Reveal DON: Test-Handling für Personen mit und ohne Laborerfahrung Test erfordert den Einsatz einer Mikroliterpipette kein Problem für Personen mit Laborerfahrung Einweisung und Übung für laborunerfahrene Personen erforderlich Auswertung erfordert Umgang mit dem Auswertegerät (PDA) Unabhängigkeit vom Faktor Mensch ( Tagesform und Interpretationsspielräume) und von den Lichtverhältnissen

24 Fazit RIDA Quick DON und Reveal DON Personen ohne Laborerfahrung können beide Schnelltests nach kurzem Training erfolgreich durchführen. Weizenpartien mit DON-Gehalten über 1250 µg/kg können mit beiden Schnelltests bei geringer Fehlerquote als kritisch erkannt werden, korrekte Probenahme vorausgesetzt! Die Schnelltests sollten nur zur Einordnung eingesetzt werden. HPLC u. ä. Analysentechniken sind vor allem im Höchstwertbereich anzuraten, und in Streitfällen weiterhin erforderlich.

25 Labor für Mykotoxine und Getreidepilze Sandra Masloff und Thomas Betsche Wir danken Annette Ahrendt Ruzica Busch Berbel Korff Peggy Lange Beate Lippert Elfriede Schieseck Nina Wehmeier Anne Barton Eric Seipenbusch - Leiter Dr. Thomas Betsche