Gefährdung durch Mykotoxine in Getreide? Stabilisotopenverdünnungsanalysen von Trichothecenen

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1 Gefährdung durch Mykotoxine in Getreide? Stabilisotopenverdünnungsanalysen von Trichothecenen Michael Rychlik, Stefan Asam Technische Universität München, Lehrstuhl für Lebensmittelchemie, Garching , 57. Tagung für Getreidechemie, Detmold

2 Gliederung 1. Trichothecene: Bildung, Belastung, Toxikologie 2. Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA): Entwicklung, Validierung 3. Aktuelle Belastungssituation

3 Verarbeitung von Getreide Wachstum Korn Brot

4 Lagerung von Getreide Wachstum Fusarium graminearum Korn Lagerung Aspergillus ochraceus Brot Lagerung Penicillium expansum

5 Mykotoxine in Getreide 2 Trichothecene Fusarium graminearum N chratoxin A l Aspergillus ochraceus Patulin Penicillium expansum

6 Fusarieninfektion von Getreide Schmachtkörner Taubährigkeit unbelasteter Weizen Gibberella ear rot

7 Trichothecene A B 1 R R 2 Trichothecen-Ring 2 R 3 R 2 2 Gruppe A B R 2 R 1 R 2 R 3 R R Ac 4 9 T-2 toxin 4 9 T-2 toxin Ac Diacetoxyscirpenol Ac Neosolaniol Nivalenol Deoxynivalenol (DN) 15-Ac-DN Ac Roridin A = Verrucarin A (Ac = - ) Ac Fusarenon X

8 Toxikologie von Trichothecenen - LD 50 -Werte (Maus, oral): KN T2-Toxin DN LD 50 [mg/kg BW] Epoxid 60 S-Untereinheit der Ribosomen (emmung der Peptidbiosynthese) - Akute Symptome (low dose): Erbrechen (DN = vomitoxin) (high dose): Innere Blutungen, Tod Alimentäre Toxische Aleukie (ATA); Sibirien Keine cancerogene Wirkung - hronisch: Immunosuppression?

9 Tägliche Aufnahme von T2-Toxin in der EU Mittel Mittel hochbelastete (95 Percentile) ng/kg KG TDI 0 Finnland Frankreich Frankreich Kinder Italien Norwegen Quelle: EU, SP, 2003

10 Tägliche Aufnahme von DN in der EU 2000 Mittel 1500 Mittel hochbelastete (95 Percentile) 1000 TDI 500 Frankreich Frankr. Kinder Deutschland Deutschl. Kinder Niederlande Niederlande Kinder Norwegen 0 Norwegen Kleinkinder Quelle: EU, SP, 2003 ng/kg KG

11 Grenzwerte für DN - Tolerable-daily-intake für DN: TDI (DN) = 1 µg/kg BW d - Rechtliche öchstmengen für DN: Textstelle: DiätV 14 Abs. 3 Lebensmittel: Getreideerzeugnisse zur erstellung diätetischer Lebensmittel für Säuglinge und Kleinkinder Mykotoxin-M-V Getreideerzeugnisse 500 DN [µg/kg]: 100 Brot, Kleingebäck und feine Backwaren 350 V (EG) Nr. 466/2001, Unverarbeitete Getreide außer artweizen und afer 1250 Gültig ab Unverarbeiteter artweizen, afer und Mais 1750 Getreidemehl, einschließlich Maismehl 750 Brote, feine Backwaren, Kekse, Getreide-Snacks und Frühstückscerealien 500 Teigwaren (trocken) 750 Getreidebeikost für Säuglinge und Kleinkinder 200

12 Gliederung 1. Trichothecene: Bildung, Belastung, Toxikologie 2. Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA): Entwicklung, Validierung 3. Aktuelle Belastungssituation

13 Prinzip der Stabilisotopenverdünnungsanalyse Isotopologer Standard MS Aufreinigung Derivatisierung Analyt

14 Synthese von markiertem T2-/T2-Toxin (1) T2-Triol 3,4,15-Tri[ 13 2 ]-acetyl-t2-triol = 13

15 Synthese von markiertem T2-/T2-Toxin (2) ,4,15-Tri[ 13 2 ] -acetyl-t2-triol 3 3 N 3 3 [ 13 4 ]-T2-Toxin 2 3 = 13 3 [ 13 2 ]-T2-Toxin

16 Präparative PL des ydrolysats [ 13 2 ]- T2-Toxin= [ 13 4 ]-T2-Toxin=

17 Synthese von markiertem DAS/MAS (1) N Scirpentriol Diacetylscirpenol =DAS 3,4,15-Tri[ 13 2 ]- acetylscirpentriol = 13

18 Synthese von markiertem DAS/MAS (2) N [ 13 4 ]-DAS 3 3,4,15-Tri[ 13 2 ]- acetylscirpentriol = [ 13 2 ]-MAS

19 Markierte Trichothecene- bereits verfügbar A B R 1 2 R 2 2 R 3 R 2 2 R 2 R 1 R 2 R 3 R R Ac 4 9 T-2 toxin 4 9 T-2 toxin Ac Diacetoxyscirpenol Ac Neosolaniol Nivalenol Deoxynivalenol (DN) 15-Ac-DN Ac Roridin A 3 = Verrucarin A (Ac = - ) Ac Fusarenon X Rot: kommerziell erhältlich Grün: von uns synthetisiert

20 Probenaufarbeitung Probe (1 kg) omogenisieren Interner Standard Einwaage (1 g) Extraktion (AN/Wasser: 84+16, v+v; 10 ml; 90 min) Filtrieren Romer MultiSep olumn Eluat Einrotieren Wiederaufnehmen (100 µl) PL-MS/MS

21 Nachweisgrenzen und Wiederfindung DN 3-Ac-DN 4-Ac-NIV T2 T2 DAS MAS NWG [µg/kg] 15-Ac-DN bestimmt nach ädrich und Vogelgesang; Deutsche Lebensmittel Rundschau 95 (1999) Wiederfindung DN 3-Ac-DN 15-Ac- DN T2 97% 95% 102% 115 % 4-Ac- NIV T2 DAS MAS 99% 91% 110% Zusatz-Niveau: 50 µg/kg

22 Präzision und Richtigkeit RSD (n=3) DN 3-Ac-DN 15-Ac- DN 4-Ac-NIV T2 T2 DAS MAS 2 % 6 % 3 % 7 % 5% 4% 1% Richtigkeit - Analyse von zertifiziertem Referenzmaterial: DN Zertifizierter Gehalt [µg/kg]: 474 ± 30 Gefundener Gehalt [µg/kg]: 464 ± 22 Abweichung: 2,1 %

23 Typ-B Trichothecene in einem Maismehl RT: 4,78 DN 85 µg/kg MS/MS RT: 4,77 [ ]-DN MS/MS RT: 8,97 4-Ac-NIV MS/MS RT: 8,99 [ 13 2 ]-4-Ac-NIV RT: 18,20 RT: 18,19 15-Ac-DN [ 13 2 ]-15-Ac-DN 15 µg/kg MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS RT: 19,01 3-Ac-DN MS/MS 312 MS/MS [ 13 2 ]-3-Ac-DN MS/MS MS/MS Time (min) 4 RT: 19,00

24 Simultane Bestimmung von 8 Trichothecenen

25 Vergleich versch. Quantifizierungsmethoden DN T2 [ppb] SIVA SIVA nach clean-up Externe Eichung Externe matrixkorrelierte Eichung

26 Gliederung 1. Trichothecene: Bildung, Belastung, Toxikologie 2. Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA): Entwicklung, Validierung 3. Aktuelle Belastungssituation

27 Typ A-Trichothecene: Getreide Anzahl der Proben: Gehalt in µg/kg T2-Toxin T2-Toxin DAS MAS aferflocken n. d aferkörner n. d. 0 aferkekse Maismehl Maisgrieß Dinkelkörner Kartoffeln Pferdefutter Schweinefutter : nicht detektierbar

28 Typ B-Trichothecene: Getreide und Mehl Anzahl der Anzahl der positiven Proben (Gehalt in µg/kg): Proben: DN 3-Ac-DN 15-Ac-DN 4-Ac-NIV Weizen Konventioneller Anbau Weizen Ökologischer Anbau Mais Konventioneller Anbau Mais Ökologischer Anbau (35 300) 1 (~ 7) 1 (~ 4) (15 60) 1 (~ 6) (8 160) 1 (~ 4) 3 (30 50) 1 (~ 1) 2 2 (6 30) 0 2 (10 20) 0 Gerste 1 1 (35) afer Roggen 1 1 (50) Dinkel 1 1 (40) Reis : nicht detektierbar

29 Gehalt an DN in verarbeiteten Lebensmitteln Anzahl der Proben: Anzahl der positiven Proben (Gehalt in µg/kg): DN Frühstückscerealien 7 7 (15 120) Toastbrot 1 1 (45) Tortilla hips 1 1 (30) Vollkornkekse 1 1 (15) Spaghetti 1 1 (30) Bier (normal) 1 1 (8) Weißbier I 3 3 (10 20) Weißbier II 1 1 (7) Kindernahrung 1 1 (15) = 30 % TDI (1 µg/kg BW d) bzgl. 1 Liter Bier; 70 kg BW; 1 d = 10 % TDI (1 µg/kg BW d) bzgl. 50 g; 7 kg BW; 1 d

30 Ausblick: Risikominimierung Bisher bekannte Maßnahmen zur Verhinderung einer Fusarieninfektion: - Fungizideinsatz bei feuchtem Wetter: Starke Niederschläge zur Getreideblüte Mildes, feuchtes Wetter in der Folgezeit - Mais nicht als Vorkultur - Pflügen - Resistente Weizensorten ggfs. Bt-modifiziert

31 Danksagung Stefan Asam