T-2- und HT-2-Toxin in Getreide ein Problem?
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- Marcus Dunkle
- vor 6 Jahren
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1 T-2- und HT-2-Toxin in Getreide ein Problem? Ute Meister, Institut für Lebensmittel- und Umweltforschung e.v., Arthur-Scheunert-Allee 40/41, D Nuthetal OT Bergholz-Rehbrücke Projekt gefördert innerhalb des Förderprogramms INNOVATIVE WACHSTUMSTRÄGER (INNO-WATT) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Arbeit (Reg.-Nr. IW050111) Dr. Stefan Hoth, Peter Kölln KgaA, Köllnflockenwerke, Westerstr , D Elmshorn
2 T-2-/HT-2-Toxin Inhaltsübersicht - Bildung / Struktur - Toxizität - Vorkommen - Grenzwertentwürfe - Methoden - bisherige Methoden - Methodenoptimierung - Ergebnisse der Methodenvalidierung - Chromatogramme - Ergebnisse der Untersuchung von Getreide/-produkten
3 T-2-/HT-2-Toxin Bildung / Struktur sekundäre Stoffwechselprodukte von verschiedenen Fusarien F. sporotrichioides F. langsethiae F. tricinctum F. equiseti F. poae Hauptmetabolit in vivo: HT-2-Toxin Typ A Trichothecene Struktur: T-2-Toxin: R 1 = Oac HT-2-Toxin: R 1 = OH
4 T-2-/HT-2-Toxin Toxizität Toxizität vom Scientific Committee for Food (SCF) 2001 als sehr hoch bewertet (SCF): - allgemeine Toxizität - Hämatotoxizität - Immuntoxizität -> daher vorläufiger TDI-Wert: nur 0,06 µg / kg Körpergewicht / Tag = deutlich niedrigerer TDI im Vergleich zu anderen Mykotoxinen: Deoxynivalenol TDI 1,0 µg /kg KW /d Zearalenon TDI 0,2 µg /kg KW /d *) Fumonisine (Σ B 1, B 2, B 3 ) TDI 2,0 µg /kg KW /d Nivalenol TDI 0,7 µg /kg KW /d *) *) vorläufig
5 T-2-/HT-2-Toxin Vorkommen (% pos. Proben) SCOOP-Studie ( ): Daten von aus 8 europäischen Ländern (keine Daten aus Deutschland eingeflossen), Methoden: GC/ECD, GC/MS, HPLC, ELISA T-2-Toxin: - Mais (28 %) HT-2-Toxin: - Hafer (41 %) - Weizen (21 %) -Mais (24 %) - Roggen (21 %) - Roggen (17 %) JECFA-Studie ( ): Daten von weltweit (ca Proben), Methoden: GC/ECD, GC/MS, HPLC, ELISA T-2-Toxin: - Hafer (29 %) HT-2-Toxin: - Hafer (33 %) - Weizen (21 %) - Weizen (10 %) - Gerste (10 %) -Mais(2 %) - Roggen (1 %)
6 T-2-/HT-2-Toxin EU-Grenzwertentwürfe Produktgruppen unverarbeitetes Getreide, Getreideerzeugnisse und alle daraus abgeleiteten Erzeugnisse (außer nachfolgend aufgeführte Produktgruppen) Grenzwertentwürfe (µg/kg) für Σ T-2-/ HT-2-Toxin 100 unverarbeiteter Hafer 500 Hafererzeugnisse mit mehr als 20 % Hafer 200 Kindernahrung auf Getreidebasis 50 -> Grenzwerte zurückgezogen wegen - des Fehlens geeigneter Analysenmethoden - ungenügender Datenlage -> Grenzwerte erwartet für Ende 2008 / Anfang 2009
7 T-2-/HT-2-Toxin Methoden publizierte Methoden: DC GC (GC-ECD, GC-FID, GC-MS) HPLC (HPLC-FLD nach Derivatisierung) LC-MS, LC-MS/MS ELISA Nachteile bisher genutzter Methoden: zu geringe Nachweisgrenze zu störanfällig nicht sehr spezifisch oder apparativ sehr aufwändig
8 T-2-/HT-2-Toxin Methodenanforderungen Entwicklung einer HPLC-Methode durchführbar mit üblichem HPLC-Equipment (HPLC-FLD) zur Bestimmung beider Toxine mit niedriger Nachweisgrenze (< 10 µg/kg) mit guter Präzision (Soll: RSD r < %, RSD R < %) *) mit guter Wiederfindungsrate (Soll: µg/kg) *) *) entspr. Verordnung (EG) Nr. 401/2006 der Kommission vom 12.Februar 2006 zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysenmethoden für die amtliche Kontrolle des Mykotoxingehalts von Lebensmitteln
9 T-2-/HT-2-Toxin HPLC-Methode von Pascale et al. (2003) zur Bestimmung von T-2-Toxin Extraktion mit Methanol/Wasser (80/20, v/v) I Zentrifugation / Filtration / Extraktverdünnung (1:5) I Extraktreinigung an Immunoaffinitätssäulen (T-2-TAG) I Elution mit Methanol, Eindampfen (50 C, N 2 ) I Derivatisierung mit 1-AN / DMAP (50 C, 15 min) I Eindampfen (50 C, N 2 ), Aufnahme in HPLC-Eluent I HPLC mit Fluoreszenzdetektion (λ ex 381 nm, λ em 470 nm) Säule: RP-C18 Eluent: Acetonitril /Wasser 80:20, isokratisch Methode für alle Getreidearten geeignet (LOD 5 µg/kg, RSD < 6 %)
10 T-2-/HT-2-Toxin HPLC-Methode von Visconti et al. (2005) zur Bestimmung von T-2-/HT-2-Toxin Extraktion mit Methanol/Wasser (90/10, v/v) unter Zusatz von NaCl I Zentrifugation / Filtration / Extraktverdünnung (1:5) I Extraktreinigung an Immunoaffinitätssäulen (T-2-TAG) I Elution mit Methanol, Eindampfen (50 C, N 2 ) I Derivatisierung mit 1-AN / DMAP (50 C, 15 min) I Eindampfen (50 C, N 2 ), Aufnahme in HPLC-Eluent I HPLC mit Fluoreszenzdetektion (λ ex 381 nm, λ em 470 nm) Säule: Phenyl-Hexyl Eluent: Acetonitril /Wasser, Gradientenmethode Methode für alle Getreidearten außer Hafer geeignet!
11 T-2-/HT-2-Toxin Prüfung / Optimierung der Methode zur Bestimmung beider Toxine Erforderliche methodische Arbeiten: Testung / Optimierung der HPLC-Bedingungen zur Trennung der Toxine Überprüfung der Derivatisierungsbedingungen für HT-2-Toxin Prüfung/Optimierung der Extraktions- und Extraktreinigungsbedingungen Ermittlung von Wiederfindungsraten Prüfung der Präzision Validierung der Methode für die einzelnen Getreidearten
12 T-2-/HT-2-Toxin HPLC- Gradientenmethode Eluenten: A = Acetonitril / Wasser 80:20, v/v B = demin. Wasser C = Methanol D = Acetonitril Start: 90 % A / 10 % B, Fluss: 0,5 ml/min, Temperatur: 35 C Zeit (min) Eluentenzusammensetzung Fluss (ml/min) % A / 10 % B 0, A von 100 auf 82,5 % senken D linear von 0 auf 17,5 % D steigern 0, ,5 % A / 17,5 % D 1, % C 0, % A / 10 % B 0,5 Stopzeit: 51 min Injektionsvolumen: 20 µl
13 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Standard-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2007.D) T-2-Toxin HT-2-Toxin min Standard T-2- / HT-2-Toxin, je 1 ng inj. (Peakgröße entspricht 50 µg/kg Probe)
14 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Standard-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2013.D) T-2-Toxin HT-2-Toxin min Standard T-2- / HT-2-Toxin, je 0,02 ng inj. (Peakgröße entspricht 1 µg/kg Probe)
15 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Kalibrierung Kalibriergerade T-2-Toxin, (1-250 ng/ml) Kalibriergerade HT-2-Toxin, (1-500 ng/ml)
16 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Nachweis- und Bestimmungsgrenzen statistisch ermittelte Nachweis- und Bestimmungsgrenzen Berechnung aus der Reststandardabweichung der Kalibriergeraden NWG: BG: Berechnung aus 95% Prognosebereich der Kalibriergeraden NWG: BG: T-2-Toxin (0,382) 0,3 µg/kg 0,9 µg/kg 0,6 µg/kg 0,9 µg/kg HT-2-Toxin (0,383) 0,4 µg/kg 1,1 µg/kg 0,7 µg/kg 1,1 µg/kg
17 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Hafer Präzision und Wiederfindungsraten Präzision (n = 6): Standardzusatz je 50 µg/kg T-2-/HT-2-Toxin ohne Zusatz von NaCl mit Zusatz von NaCl T-2-Toxin HT-2-Toxin T-2-Toxin HT-2-Toxin Mittelwert, µg/kg 48,6 42,8 46,0 35,8 Wiederfindungsrate, % 97,2 85,6 92,0 71,6 Variationskoeffizient, % + 3,0 + 4,6 + 2,7 + 2,5 Wiederfindungsraten (mit Zusatz von NaCl): Standardzusatz, µg/kg WF T-2-Toxin, % WF HT-2-Toxin, %
18 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Validierung Getreidearten Präzision und Wiederfindungsraten bei Standardzusatz je 50 µg/kg (Zusatz von NaCl) Getreideart (n = 6) T-2-Toxin HT-2-Toxin µg/kg WF (%) RSDr (%) µg/kg WF (%) RSDr (%) Hafer , ,5 Mais Roggen Weizen Gerste ,9 3,1 5,0 4, ,5 6,2 4,1 7,4
19 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Bewertung mit sog. Tauglichkeits-Ansatz Methoden, die nicht im Ringversuch geprüft worden sind, können nach EG-VO 401/2006 mit einem sogenannten Tauglichkeits-Ansatz bewertet werden Berechnung einer Unsicherheitsfunktion Uf, die Maximalwerte für die Unsicherheit festlegt, die als annehmbar gilt: Uf (µg/kg) = (LOD/2) 2 + (a x C) 2 LOD a C = Nachweisgrenze der Methode (= 1 µ/kg) = konstanter numerischer Faktor in Abhängigkeit von der Konzentration (bei < 50 µg/kg ist a = 0,2, bei µg/kg ist a = 0,18) = Konzentration des Analyten (= 50 µg/kg) Uf = 10,0 µg/kg Methode gilt als geeignet, wenn RSDr < Uf kein standardisiertes Referenzmaterial zur Prüfung der Vergleichbarkeit vorhanden
20 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Hafer-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2004.D) min Hafer (Standardzusatz T-2-/HT-2-Toxin je 50µg/kg)
21 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Hafer-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2014.D) T-2-Toxin HT-2-Toxin min natürlich kontaminierter Hafer, (T-2-Toxin: 2 µg/kg, HT-2-Toxin: 4 µg/kg)
22 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Mais-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2012.D) T-2-Toxin HT-2-Toxin min Mais mit Standardzusatz (je 50 µg/kg), Zusatz von NaCl
23 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Mais-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2004.D) T-2-Toxin HT-2-Toxin min natürlich kontam. Mais, (T-2-Toxin: 1 µg/kg, HT-2-Toxin: 5 µg/kg), NaCl- Zusatz
24 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Roggen-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2014.D) T-2-Toxin HT-2-Toxin min Roggen mit Standardzusatz (je 50 µg/kg), Zusatz von NaCl
25 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Roggen-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2023.D) min Roggen, T-2-/HT-2-Toxin: nicht nachweisbar (Zusatz von NaCl)
26 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Weizen-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2016.D) T-2-Toxin HT-2-Toxin min Weizen mit Standardzusatz (je 50 µg/kg), Zusatz von NaCl
27 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Weizen-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2026.D) T-2-Toxin HT-2-Toxin min natürlich kontam. Weizen, T-2-Toxin: 1µg/kg, HT-2-Toxin: 9 µg/kg (NaCl-Zusatz)
28 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Gersten-Chomatogramm FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2009.D) LU T-2-Toxin HT-2-Toxin min Gerste mit Standardzusatz (je 50 µg/kg), Zusatz von NaCl
29 T-2-/HT-2-Toxin Ergebnisse Gersten-Chomatogramm LU FLD1 A, Ex=381, Em=470 (T2HT2T~1\T \T2HT2017.D) min Gerste, T-2-/HT-2-Toxin: nicht nachweisbar (Zusatz von NaCl)
30 T-2-/HT-2-Toxin untersuchte Getreideproben Mit der optimierten Methode wurden untersucht: 65 Haferproben (54 Proben Rohhafer, 11 Proben Haferprodukte) 29 Maisproben (21 Proben nativer Mais, 8 Proben Maismahlprodukte) 14 Weizenproben (12 Proben nativer Weizen, 2 Proben Weizenmehl) 5 Roggenproben (4 Proben nativer Roggen, 1 Probe Roggenmehl) 4 Gerstenproben (3 Proben native Gerste, 1 Probe Gerstenflocken) Ergebnisse: Hafer: fast 100 % Kontamination (3-174 µg/kg) Mais: ca. 80 % Kontamination (2-106 µg/kg) Weizen, Gerste: gelegentliche niedrige Analysenbefunde (1-10 µg/kg) Roggen: keine Toxinnachweise
31 T-2-/HT-2-Toxin Vorkommen in Hafer (geschält) T-2-Toxin HT-2-Toxin deut. Hafer (Pr.1-36) finn. Hafer (Pr ) schwed. Hafer (Pr ) Toxingehalt (µg/kg) lett. Hafer (Pr. 50) poln. Hafer (Pr. 51) tschech. Hafer (Pr. 52) engl. Hafer (Pr. 53) dän. Hafer (Pr.54) Haferproben
32 T-2-/HT-2-Toxin Vorkommen in Hafer und Haferprodukten Min.-/Max.-Gehalte und Mittelwerte Gehalt T-2-/HT-2-Toxin (µg/kg) Proben Proben Min Max. Mittelwert 3 Proben Hafer (geschält) Haferflocken / -mehl Haferkleie Haferproben
33 T-2-/HT-2-Toxin Vorkommen in Mais und Maismahlprodukten Min.-/Max.-Gehalte und Mittelwerte Gehalt T-2-/HT-2-Toxin (µg/kg) Proben Mais 9 Proben 9 5 Maismahlprod. Min Max Mittelwert Maisproben
34 T2-, HT2-Toxine in Getreide - ein Problem? 58. Tagung für Getreidechemie, Detmold, Ute Meister, Nuthetal, und Dr. Stefan Hoth, Elmshorn
35 Toxikologie t-tdi: 0,06 µg T2 und HT2 /kg Körpergewicht (Quelle: wiss. Ausschuss Lebensmittel (SCF, 30. Mai 2001) Vergleich: DON 1 µg/kg Annahme: (Banasiak et al. 2005) 0,06µg/kg 16 kg 0,064 kg Kleinkind von 16 kg Verzehr von täglich 64 g Haferflocken (Intensivnutzer, Kurzzeit) = 15µg/kg
36 Übersicht Rohhafer T2- / HT2-Gehalt in Rohhafer
37 Übersicht Haferprodukte T2- / HT2-Gehalt in verarbeitetem Hafer Reduktion in der Mühle durchschnittlich ~
38 Reduktion durch Verarbeitung Beispiel einer Reduktionsstudie 80 % Reduktion µg/kg
39 Datenlage unbefriedigend Reduktion von 30% bis 99,9%* Trend: Hohe Gehalte - hohe Reduktionsraten extrem hoch belastete Spelzen Niedrige Gehalte - niedrige Reduktionsrate keine verlässliche Reduktion durch
40 Grenzwerte für T2 und HT2 Festlegung möglicher Grenzwerte auf Anfang 2009 verschoben. EU sammelt weitere Daten In Deutschland läuft bis Ende 2008 eine BLE Studie über: Verbesserung und Validierung der Analytik für T-2 Toxin und HT-2 Toxin sowie Vorkommen dieser Mykotoxine in Lebensmitteln des deutschen Marktes (Gareis, Lauber, Märtlbauer, Usleber) etwa 1500 Proben Endverbraucherpackungen aus dem Markt
41 Maßnahmen Die europäischen Hafermühlen sind aktiv! Studie über 2 Jahre Schwerpunkt Fertigpackungen Verteilung T2 / HT2 innerhalb von Chargen Reduktionsstudien
42 Der Konflikt Die vorhandene Datenlage deutet auf einen Konflikt hin: - niedriger t-tdi mit schlechter Datenlage als Grundlage - hohe Gehalte von T2 / HT2 in einzelnen Partien Die Höhe des festzulegenden Grenzwertes für T2 / HT2 kann einen starken Einfluss auf die Verfügbarkeit der ohnehin knappen Rohware Hafer haben. Reduktion der verfügbaren Haferpartien
43 Es besteht Handlungsbedarf! Teile dieses Vortrags sind der Präsentation von CEEREAL (Jens Meyer, H. & J. Brüggen KG) auf dem EC Fusarium Toxin meeting am 15.Januar 2007 in Brüssel entnommen.
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