E. Märtlbauer. Antikörperbasierte Biosensoren zum Multimykotoxinnachweis

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1 E. Märtlbauer Antikörperbasierte Biosensoren zum Multimykotoxinnachweis

2 Mykotoxine: Ergotismus im Mittelalter

3 Mykotoxine im letzten Jahrhundert Während u. nach dem 2. Weltkrieg: Alimentary toxic aleukia in Russland Trichothecene? 1961: Turkey X disease : Aflatoxikose (C. C. Wannop, Avian Diseases, 5, ) 1965: Ochratoxin A (Van der Merve et al., Nature 205, ) : Fumonisine (Gelderblom et al., Appl Environ Microbiol 54: ) 1962: Aflatoxin B & G (Nesbitt et al., Nature 195, ) 1946: Glutinosin (Verrucarin A & B) (Brian & McGowan, Nature 157, 334) 3

4 Chronologie markierter Immunoassays 1959 RIA Radioimmunoassay 1971 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay IgG-ELISA Engvall & Perlmann 1976 LIA Luminescence immunoassay und viele weitere 1976 FPIA Fluorescence polarization immunoassay 1970 FIA Fluorescence immunoassay 4

5 Anfangsjahre der Immunoassays für Mykotoxine 1975 RIA Ochratoxin A 1976 RIA Aflatoxin B EIA Aflatoxin B RIA T-2 toxin 1983 RIA Zearalenon 1984 RIA Diacetoxyscirpenol 1988 EIA Deoxynivalenol 1988 EIA Roridin A 1992 EIA Fumonisin 5

6 Mykotoxine und Antikörper O H 1 nm O O H 10 Å O O O 6

7 Immuntests zum Nachweis von Mykotoxinen Mikrotiterplatte Mikrochip Partikel Enzym Gold Nanopartikel Quantumdots HRP ELISA Heterogener Test Markierte Reagenzien Frei: FP Homogener Test Keine Markierung Fluoreszenzpolarisation Gebunden: FP SPR 7

8 Biosensor (IUPAC Definition) z.b. Antikörper Rezeptor Signaltransduktion Signal Reversibles Signal On-off Reaktion Mehrfachmessung Kompakt, verbunden und klein z.b. Elektrochemisch Piezoelektrisch Optisch Surface plasmon resonance(spr) Total internal reflection ellipsometry (TIRE) Optical waveguide light spectroscopy (OWLS) Surface enhanced Raman scattering (SERS) Fluoreszenz/ Lumineszenz Magnetisch (Giant Magnetoresistance) etc. 8

9 Publikationen Literaturauswertung: Web of Science Juli Biosensor: & food: & mycotoxin USA China Italien Span. D Biosensor & food Biosensor & mycotoxin FEI April 2008

10 Einzeltoxinnachweis: z.b. Potentiometrischer Biosensor Referenz Elektrode Mess-Elektrode: H 2 O 2 + p-hppa Rameil et al Analytica Chimica Acta 661:

11 Multimykotoxin-Immunosensoren: Microspheres Laser Durchflußzytometer Fluoreszenzintensität Label Partikelidentifizierung Development of a multiplex flow cytometric microsphere immunoassay for mycotoxins and evaluation of its application in feed. Mycotox Res (2011) 27:63 72 AFB1, OTA, DON, FUM, ZEA, T-2 11

12 Multimykotoxin-Immunosensoren: Label-free Imaging surface plasmon resonance for multiplex microassay sensing of mycotoxins. Anal Bioanal Chem (2011) 400: SPR (DON und ZEA) Development of a microcantilever-based immunosensing method for mycotoxin detection. Biosensors and Bioelectronics 40 () MC-Resonanz (AFB1 und OTA) 12

13 Entwicklung eines Biosensorarrays zur schnellen Bestimmung von Mykotoxinen in Getreide AiF 381 ZN Forschungsstelle 1: Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, Tierärztliche Fakultät, (E. Märtlbauer, R. Dietrich) Forschungsstelle 2: Lehrstuhl für Analytische Chemie, (R. Nießner, D. Knopp, S. Oswald) 13

14 Toxin-Array H 2 O 2 + Luminol Oswald et al. () Automated regenerable microarray-based immunoassay for rapid parallel quantification of mycotoxins in cereals. Analytical and Bioanalytical Chemistry: HRP AiF 381 ZN 14

15 Mykotoxin-Derivate Immunogenherstellung Chipherstellung Deoxynivalenol (Di)-Hemisuccinat Fumonisin B1 HT-Toxin -COOH Ochratoxin A Zearalenon Oxim AiF 381 ZN 15

16 Monoklonale Antikörper Mykotoxin MAk Subtyp Aflatoxin 1F2 IgG 2a Deoxynivalenol 1H8 IgG 1 Zearalenon 1B11 IgG 2a KLH Fumonisin 1E5 IgG 1 1H4 IgG 1 T-2/HT-2 Toxin 2A12 2E7 IgG2a IgG2b Ochratoxin A 1G8 3A3 IgG 1 NH Zu Projektbeginn vorhanden Während des Projektes entwickelt AiF 381 ZN 16

17 Mikroarray O NH Glaschip: silanisiert und funktionalisiert OH NH AiF 381 ZN 17

18 Probenvorbereitung Mahlen Extraktion Analyse 25 g Probe (Hafer) ml (80% MeOH) + 5 g NaCl 5 min mixen im Eisbad Filtration Verd. auf 20% MeOH Gesamtdauer der Probenvorbereitung: 7 min Dauer eines Messzyklus (am MCR3): 11 min Summe: 18 min AiF 381 ZN 18

19 Validierung: Referenzproben DON Matrix 1 DON Konz. [µg/kg] Gefundene Konz. [µg/kg] WF [%] Weizen 1400 ± ± ± 2 Weizen ± 7 - Weizen 400 ± ± ± 9 Hafer Hafer 500 ± ± ± 9 1 Triology Reference Materials (R-Biopharm), IRMM und Biopure AiF 381 ZN 19

20 Validierung: Labor- und Methodenvergleich DON - Konzentration [µg/kg] Matrix LC-MS Aokin MCR 3 EIA (n = 3) (n = 1) (n = 6) (n = 2) Weizen ± ± ± 12 Weizen ± ± ± 184 Weizen ± ± ± 89 Weizen ± ± ± 82 Weizen ± ± ± 43 Weizen ± ± ± 226 Weizen 7 99 ± ± ± 17 Weizen ± ± ± Korn, Proben: Rosenmühle Landshut AiF 381 ZN 20

21 Chemilumineszenz [a.u.] Regenerierbarkeit Multiplex-Messung von 50 Zyklen mit blank-matrix (Weizen, Roggen, Mais, Hafer) OTA AFB1 DON FB1 T-2 Negativkontrolle Anzahl der Regenerationszyklen Mykotoxin CL nach 50 Zyklen 1 Aflatoxin B ± 8.87 Ochratoxin A ± 1.80 Deoxynivalenol ± 6.90 Fumonisin B ± 4.60 T-2 Toxin ± MW(Messung 48,49,50)/MW(Messung 2,3,4)*100%; in verschiedenen Matrizen AiF 381 ZN 21

22 Zusammenfassung Generierung und Charakterisierung neuer Antikörper Stabiler, regenerierbarer Mikroarray für 5 Mykotoxine Einfache Extraktionsmethode Gesamttestdauer: 18 min To do: Zearalenon HT-2 Auf dem Chip Konformationsänderung? Chipbeschichtung mit Zearalenon-analog Antikörper nicht desorbierbar (auch nicht nach PEGylierung: Kettenlänge 4 bzw. 8 Atome) Verwendung von Fab-Fragmenten AiF 381 ZN 22

23 Ausblick Microtitertests Schnelltests Biosensoren 2010 Einzelsensoren 2010 Schnelltests Mycotoxinarrays 2015 Lab on a Chip ? 23

24 Vielen Dank 24