Der Nachweis von Antibiotika in Milch mit Biosensor

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1 Der Nachweis von Antibiotika in Milch mit Biosensor E. Märtlbauer, A. Strasser, R. Dietrich Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, Ludwig-Maximilians- Universität, München M. Weller, B. Knecht, R. Niessner Lehrstuhl für Hydrogeologie, Hydrochemie und Umweltanalytik, Technische Universität, München Kempten, November 2004 Projektförderung: FEI/AiF

2 Antibiotika-Verbrauch (EU und CH) 1997 Humanmedizin Tiermedizin "Leistungsförderer" beim Tier 46.0% 33.0% 6.0% 15.0% 8.0% 3.0% 1.0% 1.0% 4.0% 31.0% 52.0% Penicilline (322 t) Tetracycline (2294 t) Makrolide (424 t) Aminoglycoside (154 t) Fluorochinolone (43 t) Trimethoprim/Sulfonaminde (75 t) Andere Antibiotika (182 t) Leistungsförderer (1599 t)

3 Tierarzneimittelmarkt Deutschland 2001 Umsätze Prozentual bzw. in Antiparasitika 87 Mio 18,0% Antiinfektiva 132 Mio. 27,4% Biologika 134 Mio. 28,0% Hormone 21 Mio. 4,4% Sonstige 107 Mio 22,2% Quelle: VETimpulse, 15. Juni 2002

4 Gesetzliche Grundlagen Milch-Güteverordnung Hemmstoffuntersuchung 2,3 Preisabzug (5 Ct/kg) nach 4 bei positivem Ergebnis Keine Identifizierung des Hemmstoffes Lebensmittelrecht LMBG, AMG, VO über Stoffe mit pharmakologischer Wirkung EG-Verordnung Nr. 2377/90 Milch-Verordnung ( ) Verkehrsverbot bei Überschreitung der Höchstmenge, Nicht-Einhaltung der Wartezeit sowie bei Anwendungsverbot des Tierarzneimittels

5 Beispiele für Höchstmengen (MRL), Antiinfektiva in Kuhmilch, VO (EWG) Nr. 2377/90 Substanz(en) MRL (µg/kg) Penicillin G, Amoxycillin, Ampicillin 4 Cloxacillin, Oxacillin, Dicloxacillin 30 Cephalosporine Streptomycin 200 Sulfadiazin, Sulfamethazin 100

6 Anlieferungsmilch: Hemmstoffauswertung ,25 0,2 0,15 0,1 0,05 Prozent pos. Proben 0 Sachs. Thür. Brand. Sa.-A. Meckl. Rhl.Pf. Hess. Schl.H Brem. Bayern

7 Derzeitige Hemmstoffuntersuchung Mikrobiologische Tests Dauer(3 h) retrospektives Ergebnis Keine Substanzidentifizierung Beschränktes Spektrum Schnelltets Dauer (10-20 min) Sammelwagenebene nur ß-Laktamantibiotika

8 Zukunft? Verlagerung der Untersuchung auf die Erzeugerebene Vermeidung der Anlieferung antibiotikahaltiger Milch Schadensminimierung für Erzeuger und Verarbeiter Verbesserung des Verbraucherschutzes Allergien Resistenzen Direkte pharmakologische Wirkung Qualitätsvorteil für Milch und Milcherzeugnisse

9 Biosensor (IUPAC Definition) Biologischer Rezeptor direkt verbunden mit Physischem Transducer Reversibles Signal Ein-aus Reaktion Wiederholte Messung Kompact, integriert, klein Signaltransduktion electrochemisch piezoelektrisch optisch (SPR) Analytical Chemistry, March 1998

10 Entwicklung eines Biosensors (Immunosensors) Herstellung monoklonaler Antikörper zum Nachweis von Antibiotika und Sulfonamiden Indirekter kompetitiver Immuntest Multitest auf Mikrotiterplatte Strep. Cloxa. SDA SMA Ampi. LW 2 x MRL 1 x MRL 1/2 x MRL

11 Entwicklung eines Biosensors (Immunosensors) Umstellung auf Lumineszenz Umstellung auf Biochip Entwicklung des Biosensor- Prototyps Nachweis von Antibiotika und Sulfonamiden mit Biochip

12 Biosensor: Aufbau schematisch chip with microarray flow cell in dark chamber lens CCD camera sample loop out flow cell in Cavro pumps with sample, antibody solutions and substrate

13 Flußzelle und Biosensor-Prototyp Durchflußzelle mit Biochip L x B x H: 65 x 8,5 x 0,25 mm Vol.: 100 µl

14 Indirekter kompetitiver Immuntest

15 Biosensor: Prototyp

16 Durchflusszelle CCD-Kamera Objektiv Durchflusszelle

17 Messprotokoll Immunsensor Dauer Schritt 15 Sek. Spülen 15 Sek. Vorinkubation Probe und Antikörper 70 Sek. Inkubation von Probe und Antikörper in der Flußzelle 30 Sek. Spülen 70 Sek. Inkubation der markierten Sekundärantikörper 45 Sek. Spülen 5 Sek. Zugabe des Substrates 30 Sek. Belichtungszeit/Messung 280 Sek. Gesamtmeßzeit Strep Cloxa SDA SMA 0,001 ng/ml 1 ng/ml 100 ng/ml

18 Messung Parallelspots Mittelung der 9 intensivsten Pixel pro Spot Normalisierung durch Vergleich mit Referenzsspots Relative intensity s = 30 % detection limit 0 1E Cloxacillin [µg/l] Calibration curve for cloxacillin in milk

19 Nachweis von Antibiotika und Sulfonamiden in Milch Relative intensity Streptomycin Cloxacillin Sulfadiazin Sulfamethazin NH OH HO O NH NH2 O OH H3C CHO NH HO O H2N NH HOCH 2 O HO NHCH 3 OH Relative intensity H H H N S N O O Cl N O COOH Relative intensity O N H2N 0.4 S N H O N 0.2 Relative intensity O N 0.3 H2N S N H O N E Streptomycin [µg/l] E Cloxacillin [µg/l] E Sulfadiazine [µg/l] E Sulfamethazine [µg/l] Nachweisgrenze (µg/kg) Substanz MRL (µg/kg) Biosensor MTP Einzeltest MTP Multitest Streptomycin 200 5,1 3,2 14 Cloxacillin 30 0,3 0,8 1,7 Sulfadiazin 100 3, Sulfamethazin 100 4,9 7 13

20 Optimierte Meßparameter 7 Spotreplikate Verwendung von Referenzantikörpern 8.5 mm 65 mm active area: 4.2x12 mm trinitrophenyl penicillin G trinitrophenyl cloxacillin trinitrophenyl cephapirin trinitrophenyl sulfadiazine trinitrophenyl sulfamethazine trinitrophenyl streptomycin trinitrophenyl gentamicin trinitrophenyl neomycin trinitrophenyl erythromycin trinitrophenyl tylosin 0 ng/ml 1 ng/ml 100 ng/ml

21 Ergebnisse Substanz MRL (µg/kg) LOD (µg/kg) Penicillin G 4 3,3 Ampicillin 4 8,0 Cloxacillin 30 0,3 Cephapirin 60 0,12 Sulfadiazine 100 3,5 Sulfamethazine 100 4,9 Streptomycin 200 5,1 Gentamicin ,1 Neomycin Erythromycin 40 0,36 Tylosin 50 0,95

22 Wiederfindung found concentration [µg/l] Penicillin G Cloxacillin Cephapirin Sulfadiazine Sulfamethazine Streptomycin Gentamicin Neomycin Erythromycin Tylosin spiked concentration [µg/l]

23 Realproben 8,30% 8,30% 8,30% 66,60% 8,30% Pencillin G* Cloxacillin Pen G*, Cloxa, Ampi* Ampi*, Strep, SDA Erythromycin

24 Projektstatus und Ausblick Miniaturisierung: (Test auf Objektträger) Automatisierung: (Proben- u. Reagenzien) Parallelisierung: 11 Tests gleichzeitig Testdauer: 4 min 40 sec. Keine Probenvorbereitung ermöglicht prinzipiell die on-line Erfassung Praktische Umsetzung

25 Zukunft! Verlagerung der Untersuchung auf die Erzeugerebene Vermeidung der Anlieferung antibiotikahaltiger Milch Schadensminimierung für Erzeuger und Verarbeiter Verbesserung des Verbraucherschutzes Allergien Resistenzen Direkte pharmakologische Wirkung Qualitätsvorteil für Milch und Milcherzeugnisse