Primärstruktur Proteinsequenzierung

Transkript

1 Proteinanalytik II

2 Primärstruktur Proteinsequenzierung

3 Hydrolyse der Peptidbindung

4 Aminosäurenachweis Ninhydrin

5 Aminosäurenachweis Fluorescamin

6 Proteinhydrolysat Ionenaustauschchromatographie

7 Polypeptidstruktur

8 N-Terminale Sequenzierung Edman-Abbau I (Kupplungsreaktion)

9 N-Terminale Sequenzierung Edman-Abbau II (Spaltungsreaktion) ΑΤΖ = Anilinothiazolinon

10 N-Terminale Sequenzierung Edman-Abbau III (Endprodukt) PTC = Phenylthiocarbamoyl PTH = Phenylthiohydantoin

11 Analyse der PTH-Aminosäuren RP-HPLC

12 Massenspektrometrie Peptid- und Protein-Identifizierung

13 N-Terminale Leitersequenzierung I

14 N-Terminale Leitersequenzierung II

15 C-Terminale Sequenzierung (Chemisch) Biochemisch Carboxypeptidasen

16 Sekundärstruktur ORD- und CD-Spektroskopie

17 ORD Optische Rotationsdispersion CD Circulardichroismus Grundlage: Wechselwirkung von linear polarisiertem Licht im UV/VIS- Bereich mit optisch aktiven Substanzen (optisch aktives (C-)Atom oder (helikale) Struktur) ORD: linear polarisierte Welle wird wellenlängenabhängig in ihrer Polarisationsrichtung gedreht (unterschiedlicher Brechungsindex für linksund rechtszirkular polarisiertes Licht); Messgröße: Drehwinkel. CD: rechts- und linkszirkular polarisierte Komponenten einer planpolarisierten Welle werden unterschiedlich absorbiert (unterschiedlicher Extinktionskoeffizient); Messgröße: Elliptizität = f ( ε).

18 Optische Drehung Elliptizität

19 ORD-Spektroskopie In optisch aktiven Strukturen ist die Lichtgeschwindigkeit für links- und rechtsgerichtet zirkular polarisiertes Licht unterschiedlich groß

20 CD-Spektroskopie In optisch aktiven Strukturen ist die Absorption für links- und rechtsgerichtet zirkular polarisiertes Licht unterschiedlich groß. Lambert-Beer: E = ε.c.d Elliptizität: θ = (εl-εr).c.d

21 ORD und CD Informationen ORD und CD enthalten prinzipiell die gleiche Information; CD nur nahe am Absorptionsmaximum beobachtbar, Auflösung besser; ORD noch weit weg vom Absorptionsmaximum beobachtbar (für Chromophore im fernen UV) Struktur von Makromolekülen Konformationsänderungen, z.b. durch Bindung kleiner Moleküle Strukturübergänge: z.b. Faltung und Entfaltung, Helix-Coil-Übergänge

22 CD-Spektren von Poly-L-Lysin Effekte der Sekundärstruktur

23 Tertiärstruktur Röntgenstrukturanalyse NMR-Spektroskopie Computermethoden

24 Proteine Reportergruppen-Methoden Fluoreszenz (Emission) Phe, Tyr, Trp ORD (Brechung) optisch aktives, nichtabsorbierendes Material CD (Absorption) z. B. Amidgruppe in Proteinen IR (Absorption) Bindungsschwingung, Bindungsrotation Raman (Streuung) wie oben Kernresonanz (Absorption, NMR) ungepaarte Kernspins ( 1 H, 13 C, 31 P, 2 H, 14 N) Elektronenspinresonanz(Absorption, ESR) ungepaarte Elektronenspins (Metalloproteine, freie Radikale) Röntgenkristallographie (-beugung) Streuung durch Elektronen der Atomhüllen Neutronenbeugung Streuung durch Atomkerne ( 2 H > 1 H) Massenspektroskopie (Ionen, Ionisation) m / z, Molekülpeak, Fragmentierungsmuster Calorimetrie (Thermodynamik) Tc, H

25 Nuclear magnetic resonance (NMR) Magnetische Resonanz: Absorption elektromagnetischer Energie im Magnetfeld durch Anwesenheit ungepaarter Kern- (NMR) oder Elektronenspins (ESR); NMR weniger empfindlich. Magnetische Kerne : 1 H, 13 C, 14 N, 15 N, 31 P, 19 F; nichtmagnetisch : 12 C, 16 O, 32 S. Messgrößen: chemische Verschiebung, Kopplungskonstante, Linienbreite, Peakfläche, Relaxationszeit

26 NMR von Proteinen Hohe Konzentrationen erforderlich Löslichkeitsprobleme Protein darf nicht aggregieren Schlechtere Auflösung durch Linienverbreiterung (Teilchengröße) und Überlappung der zahlreichen Signale

27 Elektronenspinresonanz (ESR) Absorption von Mikrowellenstrahlungdurch paramagnetische Substanzen (Moleküle mit ungepaarten Elektronen) durch Übergänge zwischen verschiedenen Energieniveaus der Elektronenspins Zugänglich sind: Übergangsmetalle, z.b. in Proteinen und Enzymen Coenzyme, z.b. FAD(H) Freie Radikale, z.b. in Elektronentransportketten (Photosynthese, Atmungskette) Spinsonden, synthetische ESR-Marker für die Markierung von Biomolekülen

28 ESR von Proteinen INFORMATIONEN über Enzymmechanismen Verlauf von Redoxreaktionen Konzentrationsmessung Moleküldynamik, Orientierungseffekte Physiologische Effekte von Radikalen oder Strahlung

29 Infrarot(IR)- und Raman-Spektroskopie Messen Molekülschwingungen und Rotationen IR: Absorption von Wellenlängen zwischen 2,5 und 250 µm (Wärmestrahlung) - Absorptionsintensität hängt von der Größe des zeitlich veränderlichen Dipolmoments während der Schwingung ab - Polare Gruppen sind gut sichtbar: C=O, C=N, P=O (weniger gut: symmetrische Gruppen wie C-C, S-S; O-O ramanaktiv) RAMAN: inelastische Lichtstreuung, enthält frequenzverschobene Banden, die den Energiebeträgen von Molekülschwingungen und Rotationen entsprechen - Intensitäten hängen von der molekularen Polarisierbarkeit ab - Symmetrische Gruppen (s. oben), C-S, C-Br

30 IR- und Raman-Spektroskopie von Proteinen INFORMATIONEN: funktionelle Gruppen Sekundärstruktur von Makromolekülen Dynamik von Makromolekülen: Einfluss von Liganden und Metallen (Redoxzustand) Dynamik von Liganden am Protein (z.b.: O-O an Hämoglobin, Retinal an Opsin)