DGKL-Workshop. Abteilung für Pharmazeutische Chemie & Bioanalytik Institut für Pharmazie. 10. Oktober 2009

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1 DGKL-Workshop Hochauflösende Massenspektrometrie t für die Identifizierung von Protein- und Peptid-Biomarkern Prof. Dr. Andrea Sinz Abteilung für Pharmazeutische Chemie & Bioanalytik Institut für Pharmazie Martin-Luther-Universität th i ität Halle-Wittenberg 10. Oktober 2009

2 Proteomanalyse (Proteomik) Proteom (Keith Williams und Marc Wilkins, 1994): Das Proteinäquivalent zu einem Genom. Das Proteom beschreibt die Gesamtheit der Proteine eines Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt und in einem bestimmten Zustand. Im Unterschied ed zum Genom ist das Proteom nicht statischsc Beispiel: Raupe und Falter von Orgyia antiqua L.: Gleiches Genom, unterschiedliches Proteom

3 Proteomanalyse Zielsetzung der Proteomanalyse ist die Identifizierung i und Quantifizierung der in einem bestimmten Organismus oder Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt vorhandenen Proteine. Vergleich von Proteomen: Identifizierung von Biomarkern Basis für neue Therapien und Diagnostik Design neuer Arzneistoffe

4 Der Erfolg der Proteomanalyse bei der Identifizierung von Biomarkern Nur sehr wenige neue Biomarker wurden bislang mittels Proteomik, Validierung und klinischer Zulassung identifiziert. Die tatsächliche Zahl neuer er Protein-Targets sinkt (Proteomik ändert daran NICHTS!!) Nur sehr wenige Proteine sind als Biomarker geeignet. Jedoch gibt es eine ganze Familien kommerzieller Produkte, die auf derselben kleinen Gruppe von Biomarkern basieren. Ralph Bradshaw, Herausgeber Molecular & Cellular Proteomics

5 Proteomik Protein-Spots ausstechen Proteingemisch, z.b.gesundes oder krankes Gewebe 2-dimensionale Gelektrophorese Protein im Gelstück Spaltung mit Enzym (z.b. Trypsin) Spaltpeptide p p Massenspektrometrie

6 2D-Gel-Elektrophorese

7 2D-Gel-Elektrophorese Krank Gesund Mol.gew. Identität dieses Proteins? Isoelektr. Punkt

8 Peptidmassen-Fingerprint Fingerprint-Analyse

9 2D-Flüssigkeitschromatographie / Massenspektrometrie (LC/MS) Komplexe Proteingemische i können ohne Gelelektro- phorese analysiert werden. (Trypsin) Peptide binden an Kationenaustauscher (SCX) Säule. Elution mit steigender Salzkonzentration trennt die Peptide nach Ladung. Peptide werden anhand Hydrophobizität auf Umkehrphasen (RP)-Säule getrennt.

10 3.000 Proteine Peptide 30 Fraktionen mit je Peptiden SCX fractionation Peptide (30x wiederholen)

11 Plasmakonzentrationen von Proteinen Rot: identifiziert durch die HUPO Plasmaproteominitiative Gelb: zur Zeit verwendete Biomarker

12 Hochauflösende Massenspektrometrie Fourier Transformation Ion-Cyclotron Resonanz (FTICR)- Massenspektrometer 1934: Ernest O. Lawrence und seine Kollegen M. Stanley Livingston i und Milton White betrieben b das erste Cyclotron- Gerät an der University of California, Berkeley

13 LTQ-Orbitrap-Hybrid-Massenspektrometer API Ionenquelle Lineare Ionenfalle C-Trap Vakuum Orbitrap Vakuum Erfinder: Dr. Alexander Makarov, ThermoFisher Scientific (Bremen)

14 LTQ-Orbitrap Arbeitsprinzip 1. Ionen werden in der linearen Ionenfalle gesammelt, 2.. axial herausgeschleudert 3.. und in der C-Trap gesammelt. 4.. Sie werden in ein Ionenpaket gepresst und in die Orbitrap injiziert. 5.. Dort werden die Ionen elektrostatisch gefangen. Während die Ionen um die zentrale Elektrode rotieren, führen sie gleichzeitig eine axiale Oszillation aus. Die oszillierenden Ionen induzieren i einen Bildstrom in den äusseren Hälften der Orbitrap, der mit einem Verstärker detektiert wird. Ionen einer Masse generieren eine sinusförmige Frequenz.

15 Frequenzen und Massen k Die axiale Oszillationsfrequenz folgt der Gleichung ω = Mit: ω = Oszillationsfrequenz m / z k = Instrumentenkonstante m/z =. ist ja bekannt Viele Ionen in der Orbitrap generieren ein komplexes Signal, wobei die sich überlagernden Frequenzen mittels Fourier Transformation bestimmt werden.

16 Wie groß ist die Orbitrap?

17 LTQ-Orbitrap XL-Massenspektrometer in Halle Installation im Mai 2008

18 LTQ-Orbitrap XL-Massenspektrometer Massenauflösung: > 60,000 bei m/z 400 (1 Scan pro Sekunde) Max. Auflösung: > 100,000 (FWHM) Massengenauigkeit: g < 3 ppm externe Kalibrierung Massengenauigkeit: < 2 ppm interne Kalibrierung Massenbereich: m/z ; Sensitivität: sub-femtomol (auf der Säule) Durchsatz: 3 HR-Scans/Sekunde oder 4 Scans/Sekunde parallel (1 HR-Orbitrap Scan + 3 LTQ MS/MS-Scans) Multiple Kollisionsexperimente: CID and HCD (Upgrade für ETD möglich)

19 Auflösung - Simulation Peptidmischung: [Val 5 ]-Angiotensin II Lys-des-Arg 9 -Bradykinin Sequenz: DRVYVHPF KRPPGFSPF Formel: C 49 H 69 N 13 O 12 C 50 H 73 N 13 O 11 Exakte Masse: [M+2H] 2+ = 516,76671 [M+2H] 2+ = 516,78490 Δm (mmu): 18.2 mmu R = R = ,77 (exp.) , , ty (%) Intensit ,6671 (korrekt) 516,78490 (korrekt) ty (%) Intensit m/z m/z

20 Übersicht - Quantitative Proteomik c SILAC 18 O ICAT itraq Peptide counting Spectral counting Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, and Kuster B, Anal Bioanal Chem (2007) 389:

21 SILAC: Stable Isotope Labeling using Amino Acids in Cell Culture Zellen werden markiert mit SILAC Quantifizierungs-Kit SILAC Kit Peptide werden überprüft bzgl. 100%- igem Einbau von 13 C 6 L-Lysin Peptide werden mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert (FTICR- oder Orbitrap-MS)

22 Relative Ab bundance Massenspektren mit SILAC-Peptiden z= z=2 K z= z= z= z=2 K* z= z=2 Light (L) Heavy (H) z= m/z SILAC- Verhältnis H:L = 2,09

23 Hohe Massenauflösung ist wichtig! Relative Abu undance z= z=3 X X z= z= z= z= z=2 z=2 z=2 X z= z= m/z X Light (L) Heavy (H) SILAC- Verhältnis H:L = 1,13

24 Summenformelbestimmung anhand der hochgenauen Masse m/z 516,76671 Peptid: Durchschnittliche h h Zusammensetzung [C H N 8-16 O 9-16 S 0-2 ] 2+ Massen ppm 2 ppm 1 ppm fehler ppm Anzahl der Vorschläge für m/z 516,

25 Problematisch: Aminosäurekombinationen Peptid Hochgenaue Masse (calc.) ADK 333,1769 DAK 333,1769 GEK (EGK) 333,1769

26 Tandem-Massenspektrum (MS/MS)

27 Datenbank-Suche MS 2 -Experiment Full MS MS 2 (b & y-ionen Vorläufer m/z) Proteindatenbank-Suche Basierend auf der Masse des Vorläuferions Welche Sequenzen in der Datenbank passen zu dem Spektrum? SEQ 1 SEQ 2 SEQ 3 SEQ 4 Virtuelle Spektren in silico Kandidatensequenzen Identifizierung des Proteins ( Hit ) Vergleich der virtuellen Sequenz zur realen Sequenz (MS/MS)

28 Parallele Detektion im LTQ-Orbitrap Orbitrap-Massenspektrometer niederaufgelöste MS 2 Spektren Zwei Detektoren Detektion der Fragmentionen auch hochaufgelöst in der Orbitrap möglich! Hochaufgelöste Full MS

29 LTQ-Orbitrap XL-Massenspektrometer Vorläuferionen werden entweder in der LTQ oder in der Kollisionszelle fragmentiert. HCD (High Energy CID): Fragmentierung ähnlich wie im Triple- Quadrupol Niedere Massen vorhanden Automatische normalisierte Kollisionsenergie- Einstellungen

30 Higher Energy Collision Induced Dissociation i (HCD)

31 HCD-MS/MS zur De Novo-Sequenzierung von Peptiden Massendifferenz: Gln / Lys: 0,0364 u Daten von Markus Kellmann & Peter Verhaert, Delft University of Technology

32 Zusammenfassung Proteomik für die Identifizierung von Biomarkern: Bislang ein Debakel? Reproduzierbare Abreicherung hochabundanter Proteine nötig. MS-Techniken für die Identifizierung von neuen Biomarkern müssen hohe Sensitivität grosse dynamische Breite hohe Massenauflösung exzellente Massengenauigkeit g aufweisen.

33 Danke Abteilung für Pharmazeutische Chemie & Bioanalytik Si 867/7-1 (SPP 1086); Si 867/13-1, Graduiertenkolleg 1026 Protein-Kompetenznetzwerk Halle: tools, targets and therapeutics Dr. Kai Scheffler, ThermoFisher Scientific

34 43. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie (DGMS) März 2010 Halle (Saale)