Untersuchung von Meeresgiften mit unterschiedlichen MS/MS- und FTICR-MS-Verfahren

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1 Untersuchung von Meeresgiften mit unterschiedlichen MS/MS- und FTICR-MS-Verfahren Dietrich A. Volmer Jährlich erkranken weltweit über Menschen nach Verzehr kontaminierter Muscheln oder Fischprodukte, mehr als von ihnen sterben an den Folgen dieser Vergiftungen. Die Anzahl der Vergiftungsfälle nimmt jährlich um etwa 25% zu. Ein Teil dieser Vergiftungen wird durch Biotoxine hervorgerufen. In den letzten Jahren mehren sich Berichte über die so genannten Algenblüten ( Red Tides [1]). Wenn diese Algenblüten von toxischen Algenspezies dominiert werden, kann es zu hohen Toxinkonzentrationen in Muscheln oder Fischen kommen, die diese Algen direkt oder indirekt über die Nahrungskette aufnehmen. Biotoxine aus toxinbildenden Algen werden meist nach der Giftwirkung klassifiziert, die sie in Menschen, Säugetieren oder Vögeln nach Verzehr von Muscheln oder Fisch hervorrufen. So gibt es u.a. Paralytic shellfish poisoning (PSP)-, Diarrhetic shellfish poisoning (DSP)- und Amnesic shellfish poisoning (ASP)-Toxine. Um Vergiftungen nach dem Verzehr zu vermeiden, ist die analytische Überwachung von Fischereierzeugnissen und die präventive Suche nach neuen Toxinen sehr wichtig, um in Krisensituationen gewappnet zu sein. So konnte als Ursache für zahlreiche Vergiftungsfälle nach dem Verzehr von Kugelfischen im letzten Jahr in Florida relativ schnell das PSP-Toxin Saxitoxin identifiziert werden [2]. Das sonst übliche Kugelfischtoxin Tetrodotoxin stellte sich interessanterweise nicht als Verursacher heraus. Wir beschreiben in diesem Bericht einige neue massenspektrometrische Techniken und erläutern ihre Anwendung in der Untersuchung von Meeresgiften. Identifizierung von marinen Biotoxinen Der Charakterisierung von Biotoxinen kommt eine große Bedeutung zu, da gegenwärtig mit großer Wahrscheinlichkeit nur ein Bruchteil aller Toxine und ihrer Metaboliten bekannt ist. Zur Charakterisierung steht zunächst der Maus-Bioassay und andere Assays zur Ermittlung der Toxizität einer Probe zur Verfügung. Die Identifizierung der Biotoxine kann nachfolgenden mit verschiedenen ELISA- Tests oder mit physikochemischen Verfahren erfolgen. Physikochemische Methoden eignen sich sowohl zur Bestimmung bereits bekannter Toxine (also z.b. für die überwachung), als auch für die Identifizierung von neuen Toxinen. Von besonderer Bedeutung sind spektrometrische Verfahren wie NMR und Massenspektrometrie. Im folgenden werden einige Beispiele für die strukturelle Charakterisierung mit Hilfe neuer MS-Techniken vorgestellt. Aufgrund der Komplexität der Proben werden in der chemischen Toxinanalytik in der Regel HPLC-Trennungen durchgeführt. Die Kopplung mit der Massenspektrometrie erfolgt über Ionisierungsverfahren wie Electrospray oder MALDI. Für Toxinforscher ist die Bestimmung bisher unbekannter Toxine oder Metaboliten mit Hilfe der Tandem-Mas- senspektrometrie (MS/MS) dabei besonders interessant. In diesem Verfahren werden unbekannte Strukturen durch Stossaktivierung der Toxin- Prekursorverbindungen aus dem Spektrum der Fragmentionen bestimmt. Noch vor 10 Jahren wurden MS/MS-Analysen in marinen Forschungslaboratorien meist ausschliesslich mit Triple-Quadrupol- Geräten durchgeführt, die zwar häufig eine Fülle an strukturrelevanten Fragmenten liefern, aufgrund der begrenzten Massenauflösung und -genauigkeit und der häufig unklaren Beziehung zwischen Prekursorionen und Sekundärfragmentionen aus Folgedissoziationsreaktionen aber nur vorläufige Strukturzuordnungen erlauben. Durch die enormen Anforderungen, die Forscher aus den Bereichen Drug Discovery und Proteomics an die Massenspektrometrie stellen, Keywords Meeresgifte, Toxine, Hochauflösung, Massenfeinbestimmung, FTICR GIT Labor-Fachzeitschrift 05/2003, S , GIT VERLAG GmbH & Co. KG, Darmstadt, Germany,

2 Abb. 1: Stoßaktivierungsspektrum von Neosaxitoxin (MH +, m/z 316), gemessen auf einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer Abb. 2: MS/MS-Dissoziationsschema von Neosaxitoxin (s. Abb. 1) findet jedoch seit einigen Jahren wieder eine rasante Geräteentwicklung statt und es stehen heute völlig andere Möglichkeiten für die Charakterisierung biologischer Moleküle zur Verfügung. So erlauben es diese neuen Techniken nicht nur die Zielmoleküle gezielt zu zerstören, sondern auch die Beziehungen zwischen Prekursorionen und Fragmenten genauer zu erforschen und über die hohe Massengenauigkeit die Strukturen abzusichern. Beispiele sind Quadrupol-Time-of- Flight (QqTOF), Hybrid-Quadrupol-Linear-Ion-Trap (QTRAP) und Fourier-Transform-Ionen-Cyclotron-Resonanz (FTICR). Vorläufige Strukturen durch Stoßaktivierungsexperimente In unserem Laboratorium werden marine Proben zunächst mit einem robusten Electrospray HPLC/Triple- Quadrupol-Tandem-Massenspektrometer untersucht. Triple-Quadrupol-Instrumente erlauben in Verbindung mit chromatographischer Trennung eine Vielzahl verschiedener MS- und MS/MS-Experimente, die bereits relativ weitreichende Strukturinformationen liefern. So können in den HPLC/MS-Chromatogrammen bei sehr komplexen Matrizes häufig über Precursor- oder Neutral-Loss-Scans unbekannte Metaboliten oder Abbauprodukte erkannt werden. Als Beispiel sollen in diesem Artikel zwei Neurotoxine

3 Abb. 3: Fourier-Transform-Ionen- Cyclotron-Resonanz (FTICR) dienen, die PSP-Toxine Saxitoxin und Neosaxitoxin. Ein typisches Electrospray-MS/MS -Spektrum von Neosaxitoxin nach Stossaktivierung des MH + -Ions (m/z 316) zeigt Abbildung 1. Die Vielzahl der Fragmentionen erlaubt bereits die Aufstellung eines vorläufigen Fragmentierungsschemas (Abb. 2, aufgrund der Komplexität der Dissoziationsreaktionen ist für diesen Bericht nur der m/z-bereich zwischen 190 und 316 im Schema berücksichtigt). Als nächster Schritt folgen in unseren Untersuchungen meist Experimente mit der Ion- Trap-Massenspektrometrie, die über sequentielle MS n -Experimente weitere Einsicht in die chemischen Strukturen liefern können. Obwohl MS n - Spektren aufgrund der bei Ion-Traps verwendeten Resonanzaktivierung häufig sehr linienarm sind und für die ersten beiden MS n -Stufen (n = 2, 3) für viele polare Moleküle lediglich unspezifische Neutralabspaltungen resultieren, so haben sie im Unterschied zu Triple-Quadrupol-MS/MS- Spektren eine herausragende Eigenschaft, die für die Strukturaufklärung von grosser Bedeutung ist. Die Beziehungen zwischen Prekuror- und Fragmentionen sind nämlich genau definiert und Folgefragmentierungsreaktionen, wie bei Triple-Quadrupol-MS/MS, sind selten. Dadurch ist die Bestätigung eines tentativen Dissoziationsschemas häufig möglich. So wurde z.b. der genaue Verlauf aller Dissozia- Abb. 4: Typischer Aufbau eines Electrospray FTICR-Massenspektrometers tionsschritte in Abbildung 2 durch MS n -Experimente bestätigt. Die Identität der Einzelstrukturen der Fragmente im Dissoziationsschema ist an dieser Stelle allerdings häufig noch sehr spekulativ. Im allgemeinen lassen sich also mit Hife von MS/MS und MS n die Strukturen von Toxinen oder die Position einer chemischen Veränderung einer Toxinstruktur einigermassen zuverlässig vorhersagen. Für die Absicherung der Strukturvorschläge ist die Bestimmung der exakten Masse und der Elementarzusammensetzung notwendig. Bei völlig unbekannten Substanzen oder wenn die Aussagen der MS/MS- und MS n -Experimente nicht schlüssig sind, ist es wichtig, eine möglichst hohe Genauigkeit der Massenfeinbestimmung zu erreichen, um die Anzahl der in Frage kommenden Elementarzusammensetzungen für die gemessenen Massen zu minimieren. Mit den im nächsten Abschnitt beschriebenen FTICR-Systemen ist es möglich, so exakte Massenfeinbe-

4 Abb. 5: Electrospray-Massenspektren von Saxitoxin (MH +, m/z 300), gemessen auf einem Ion-Trap- und einem 7 Tesla FTICR-Massenspektrometer Abb. 6: Ausschnit aus dem Infrared- Multiphoton-Dissoziations (IRMPD)-FTICR-Spektrum (9,4-Tesla) von Neosaxitoxin stimmungen durchzuführen, dass nur noch eine einzige Elementarzusammensetzung in Frage kommt. Massengenauigkeiten von <10 ppm können routinemässig in analytischen Laboratorien mit QqTOF-Massenspektrometern durchgeführt werden, die mittlerweile sehr verbreitet sind. In diesem Artikel soll aber schwerpunktmässig auf ein anderes Verfahren eingegangen werden, das Messungen mit noch weitaus höherer Massengenauigkeiten erlaubt, das sogenannte Fourier-Transform- Ionen-Cyclotron-Resonanz (FTICR)-Verfahren. Beispiele für QqTOF-Analysen von Toxinen finden sich in der Literatur (z.b. [3]). Extrem hohe Massengenauigkeit mittels FTICR-MS Die Grundlage der ICR-Massenspektrometrie ist die Cyclotron-Kreisbewegung von Ionen im homogenen Magnetfeld eines supraleitenden Magneten (Abb. 3a): ω = zb/m, (1) wobei ω die Cyclotron-Kreisfrequenz, z die Ladung, B die Magnetfeldstärke und m die Masse des Ions ist. So oszillieren z.b. ionisierte Saxitoxin- Moleküle (MH +, m/z 300) in einem 7 Tesla Magnetfeld mit einer Cyclotron-Kreisfrequenz von 358,33 khz. Cyclotron-Resonanz kann durch Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes der Frequenz ω senkrecht zum Magnetfeld erzeugt werden. Stimmen Frequenz des eingestrahlten Wechselfeldes und Cyclotron-Kreisfrequenz der Ionenmasse überein, so tritt der Resonanzfall ein (ω = ω 0 ) und der Cyclotronradius des betreffenden Ions mit der Eigenfrequenz ω 0 vergrössert sich durch Aufnahme von Energie aus dem Wechselfeld. Es resultiert eine kohärente Bewegung eines Ionenbündels der betreffenden Ionenmasse. Dieses Resonanzverhalten ist die Grundlage der spektrometrischen Massentrennung, denn Ionen anderer Massen (und damit anderer Eigenfrequenzen) werden nicht beschleunigt und verbleiben auf inkohärenten, kleineren Kreisbahnen. Die angeregten und auf den vergrösserten Kreisbahnen oszillierenden Ionen induzieren nun zwischen zwei Elektroden der FTMS-Zelle einen Wechselstrom, dessen Frequenz genau der Eigenfre-

5 Tab. 1: IRMPD-FTICR-Analyse von Neosaxitoxin-Fragmentionen m/z Gemessene Berechnete Fehler Elementar- Massen- Masse Masse (ppm) formel auflösung ,6 C 10 H 16 N 7 O 4 100, ,9 C 10 H 13 N 6 O 4 105, ,1 C 10 H 11 N 6 O 3 112, ,0 C 9 H 14 N 5 O 4 105, ,6 C 9 H 13 N 6 O 2 125, ,3 C 9 H 10 N 5 O 2 135, ,6 C 9 H 11 N 6 O 2 135, ,7 C 8 H 11 N 6 O 143, ,6 C 9 H 7 N 4 O 2 100, ,8 C 8 H 11 N 4 O 2 151,000 quenz der zu bestimmenden Ionen entspricht (Abb. 3b). Dieser Bildstrom kann nach Verstärkung gemessen werden. Die Amplitudenhöhe entspricht der Anzahl der Ionen in der Messzelle. Das Prinzip der Fourier-Transform (FT)- ICR besteht in der simultanen Anregung aller Ionen in der Messzelle. Für die Anregung stehen unterschiedliche technische Verfahren zur Verfügung, die weit über den Rahmen dieses Beitrages hinaus gehen. Hier sei auf die Literatur verwiesen (z.b. [4]). Der gemessene transiente Bildstrom entspricht nach der Simultananregung einer überlagerung aller Ionen bzw. aller Eigenfrequenzkomponenten in der Messzelle. Mit Hilfe der Fourier-Transformation wird der zeitabhängige Bildstrom in ein frequenzabhängiges Spektrum und mit Gl. (1) nach Kalibration in ein Massenspektrum umgerechnet (Abb. 3c). In der Praxis akkumuliert man meist mehrere transiente Signale, um das Signal/ Rausch- Verhältnis zu verbessern. Den Aufbau eines kommerziellen FTICR-Systems, bei dem die Ionen extern z.b. durch Electrospray erzeugt und in die FTMS-Zelle überführt werden, zeigt Abbildung 4. Die herausragende Eigenschaft der FTICR ist die enorm hohe Massenauflösung, die je nach Magnetfeldstärke und gemessener Molekülmasse bis in den Bereich von einigen Millionen gehen kann [5]. Dabei steigt die Auflösung mit der verwendeten Magnetfeldstärke und ist besonders gross für kleinere Massen. In der Praxis erhält man für Toxine (typische Molmassen im Bereich von 200 bis 1.000) mit 4,7 oder 7 Tesla FTICR-Systemen hervorragende Ergebnisse. Abb. 5 verdeutlich an einem Toxin- Beispiel den Unterschied zwischen Quadrupol-MS und einem 7 Tesla FTICR-System. Neben der Auflösung zeichnen sich FTICR-Spektren durch extrem hohe Massengenauigkeiten aus, die es häufig erlauben, eine einzige Elementarzusammensetzung aus dem gemessenen m/z- Verhältnis zu errechnen. So ist die Abweichung zwischen gemessener und theoretisch berechneter Masse für Saxitoxin im Beispiel in Abb. 5 nur 0, amu (0,16ppm). Voraussetzung für eine solch hohe Genauigkeit ist eine sorgfältige interne Massenkalibrierung, die den experimentelle Aufwand im Vergleich mit herkömmlichen Massenspektrometern allerdings nicht übersteigt. In dem gezeigten Beispiel wurde lediglich mit einer internen 3-Punkt Massenkalibrierung gearbeitet. Neben der Bestimmung der Elementarzusammensetzung der intakten Quasi-Molekülionen lassen sich mit der FTICR auch Fragmentspektren erhalten. Dafür stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. So kann ähnlich wie bei elektrischen Ion-Traps eine Resonanzaktivierung durchgeführt werden. Die am Markt erhältlichern FTICR-Systeme aller Hersteller lassen sich aber auch mit dem sogenannten Infrared Multiphoton Dissociation (IRMPD)-Verfahren ausrüsten, bei der ein Laserstrahl aus einem CO 2 -Laser eine Photodissoziation der isolierten Ionenmassen in der FTMS-Zelle bewirkt und die Dissozationsprodukte dann analysiert und für die Strukturaufklärung verwendet werden können (Abb. 4). Die resultierenden Dissoziationsprodukte der von uns untersuchten Biotoxine entsprachen dabei weitgehend den aus Stossaktivierungsexperimenten (Triple-Quadrupol) erhaltenen Fragmentionen. Isoliert man in der FTMS-Zelle neben dem Toxin-Prekursor- Ion noch eine bekannte Referenzverbindung und fragmentiert dann beide Spezies gleichzeitig durch IRMPD, dann können die aus der Referenzverbindung resultierenden Fragmentionen zur internen Massenkalibrierung verwendet und die Toxin- Fragmentmassen mit hoher Genauigkeit gemessen werden. Abb. 6 illustriert ein Beispiel für den hohen IRMPD-Informationsgehalt. In diesem Experiment wurde die exakte Masse eines Zwischenproduktes aus dem Dissoziationsschema in Abbildung 2 gewählt (die betreffende Struktur in Abbildung 2 ist grün dargestellt) und mit einer Massengenauigkeit von 0,6 ppm ermittelt. Aus der exakten Masse wurde dann die Elementarzusammensetzung ermittelt. In ähnlicher Weise wurden die in Abbildung 2 zusammengefassten Strukturen bestätigt (Tab.1).

6 Zusammenfassung Für die physikochemische Charakterisierung von Meeresgiften stehen heute eine Vielzahl aussagekräftiger massenspektrometrischer Verfahren zur Verfügung. In unserem Laboratorium hat sich eine Kombination verschiedener HPLC-MS/MS-Verfahren bewährt. Die ersten Schritte bei der Identifizierung unbekannter Toxine oder Metaboliten umfassen die Analyse mit Triple-Quadrupol- und der Ion-Trap-MS. Die Absicherung der Strukturenvorschläge aus diesen Experimenten erfolgt nachfolgend mit hochauflösender Massenspektrometrie, wie z.b. durch QqTOF oder FTICR. FTICR hat mittlerweile einen technischen Stand erreicht, der die Bedienung solcher Geräte auch Nichtspezialisten möglich macht. Zudem sind Systeme mit kleineren Magneten (4,7 Tesla) mittlerweile auf das Preisniveau von QqTOF-Systemen gefallen. Wegen der hohen Auflösung und Genauigkeit bieten Verfahren wie QqTOF und FTICR weitere Möglichkeiten, die im Rahmen dieses kurzen Beitrages nicht gezeigt werden konnten. So hilft die hohe Auflösung bei Störungen durch isobare Interferenzen und bei der Untersuchung von Analyten in sehr komplexen Matrizes. Desweiteren können mit der FTICR im Gegensatz zu elektrischen Ionenfallen hohe Massenbereiche gemessen werden. Auch eignet sich die FTICR prinzipbedingt besonders gut für die Kopplung mit gepulsten Ionisierungsmethoden wie z.b. MALDI. Danksagung Einige der beschriebenen Experimente wurden in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Alan Marshall (Florida State University) und Prof. Dr. Michael Karas (Universität Frankfurt) durchgeführt. Ich danke Bruker Canada und Ionspec Corp. für die freundliche überlassung der Abbildungen 3 und 4. Literatur [1] Hallegraeff, G.M.: A rview of harmful algal blooms and their apparent global increase. Phycologia 32: (1993). [2] Neurologic illness associated with eating Florida pufferfish, MMWR 51: (2002). [3] Brombacher, S.; Edmonds, S.; Volmer, D.A.: Studies on azaspiracid biotoxins. II. Mass spectral behavior and structural elucidation of azaspiracid analogs, Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, (2002). [4] Marshall, A.G.; Hendrickson, C.L.; Jackson, G.S.: Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: A primer, Mass Spectrom. Rev. 17:1 35 (1998). [5] Pinto, D.; Boyd, R.K.; Volmer, D.A.: Ultra-High resolution for mass spectrometric analysis of complex and low-abundance mixtures: the emergence of FTICR-MS as an essential analytical tool, Anal. Bioanal. Chem. 373: (2002) Der Autor Dr. Dietrich A. Volmer Studium der Chemie an den Universitäten Osnabrück und Hannover, 1994 Promotion; ORISE Fellow am National Center for Toxicological Research in AR/USA; Research Officer beim NRC Canada; Laborleiter Merck Darmstadt. Seit 2001 Senior Research Officer am Institute for Marine Biosciences und apl. Professor an der Dalhousie University in Halifax, Nova Scotia/Canada. Institute for Marine Biosciences National Research Council 1411 Oxford Street CDN-Halifax, Nova Scotia B3H 3Z1 dietrich.volmer@nrc.ca