Quantifizierung von Proteinen mittels MeCAT-Lanthanid-Markierung. Karola Lehman, Boris Neumann, Stefanie Wienkoop, Robert Ahrends

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1 Quantifizierung von Proteinen mittels MeCAT-Lanthanid-Markierung Christian Scheler Proteome Factory AG Karola Lehman, Boris Neumann, Berlin Stefanie Wienkoop, Robert Ahrends Andreas Kühn, Stefan Pieper, Humboldt-Universität zu Berlin Michael Linscheid Institut für Chemie Bremen, DGMS Jahrestagung 2007

2 Hauptansätze der quantitativen Proteomanalyse auf Proteinebene 1) ggf. Proteinmarkierung MeCAT, ICPL, ITRAQ, Fluoreszenz 2) Proteintrennung 2DE, LC, CE, Free-flow 40x30 cm 2DE 3) Quantifizierung* Spotintensität, UV, ICP-MS (MeCAT) 4) Proteinspaltung Enzymatische/chemische Spaltung auf Peptidebene 1) Proteinspaltung Enzymatische/chemische Spaltung, ggf. mit Isotopen-Markierung zuvor, danach oder in-vivo 2) Peptidtrennung LC, MD-LC 3) Peptid-Quantifizierung und Protein-ID LC-MALDI-MSMS, LC-ESI-MSMS 5) Protein-ID* MALDI-, ESI-MSMS *bei ICPL, ITRAQ: Quantifizierung in 4)

3 Proteomanalyse auf der Proteinebene. Warum? Single gene Transcriptomics Multiple splice variantes Only on protein level post-translational modifications (PTMs) can be matched to protein species!! LC-MS based proteomics of peptides does not allow matching of PTMs to protein species! P Translated proteins P P glyco residue P Protein species Protein can be post-translational modified >50% of eukaryontic proteins are post-translational modified

4 Herausforderungen der Proteomanalyse 1) Datenmenge und Zeitaufwand bei Quantifizierung und Identifizierung Müssen alle Proteine identifiziert werden? 2) Erfassung von tausenden bis zehntausenden Proteinspecies (Proteine mit ihren PTMs und Isoformen) => hochauflösende Trennverfahren 3) Dynamischer Konzentrationsbereich von Proteinen: wenige bis zu vielen Millionen Kopien pro Zelle => analytische Detektionsverfahren mit einem ähnlichen linearen dynamischen Messbereich (>10 6 ) 4) Die Proteinmenge in einer einzelnen Zell beträgt ca. 100 pg (ca. 2 fmol) => hochsensitive Nachweisverfahren 5) Quantifizierung: Absolute oder relative Quantifizierung?

5 Voraussetzungen für Multiplex-Markierungen A) Quantitative Markierung B) Ko-Migration/-Elution in Trennverfahren Elektrophorese LC C) Kompatibilität mit Detektionsverfahren Quantifikation (ICP-MS, MALDI-, ESI-MS) Identifikation (MALDI-, ESI-MSMS)

6 MeCAT - Metal coded tagging Optionaler Affinitätsanker Reaktive Gruppe Massendifferenz - Differentielle Markierung mit verschiedenen Lanthaniden - Optionale Affinitätsanreicherung markierter Proteine/Peptide - Protein / Peptid-Trennung (z.b. 2DE-Gel, LC) - Quantifizierung: 1) absolute Quantifizierung der Metalle mit ICP-MS 2) relative Quantifizierung mit MALDI-, ESI-MS -> Massendifferenz (in Analogie zu ICAT) - Protein-Identifizierung: MSMS von Peptiden nach Proteinspaltung

7 Probe wird auf C in ionisiertem Argon erhitzt Der MeCAT- Lanthanid-Detektor : ICP-MS Bisher unerreichte Vorteile für die Bioanalytik Robuste, sehr empfindliche Analysenmethode für Elementanalytik, u.a. Spurenanalyse von Schwermetallen Linearer dynamischer Meßbereich: 8 (bis max. 12) Größenordnungen Keine Matrix-Suppressionseffekte Sensitivität: amol/g bis µmol/g Bereich Externe Kalibration mit Metallstandards Sehr gute S/N-Verhältnisse

8 MeCAT-Workflow auf Proteinebene Markierungs-Metalle Tm Proteinebene Lu 2DE LC Peptidebene Ho

9 Workflow - Absolute Quantifizierung intakter Proteine aus Elektrophorese-Gelen 1. Quantitative MeCAT-Markierung der Proteine 2. Elektrophorese mit auflösbaren Gelen ( -Gele) 3. Spot-Stanzen mit und auflösen der Proteinspots 4. Absolute Quantifikation mit ICP-MS (dynamischer Bereich >10 8 ) Z.B. Detektion von amol α-lactalbumin und 110 amol BSA (ca. 7,5 pg) 5. Identifikation regulierter Proteine mit nanolc-esi-msms nach tryp. Spaltung

10 Quantitative MeCAT Protein-Metallmarkierung m/z 20facher Überschuß m/z

11 2 D Geltrennung von zwei MeCAT markierten Augenlinsenproteinproben Intensity Spot Time in s Intensity Spot b,2,3,4 α-crystallin A 9 β-crystallin B3 5,6,7,8 β-crystallin B C iso 4 Silbergefärbte 2DE Gele: A) ohne, B) mit MeCAT-Markierung Intensity Time in s Spot 5 0 Konzentrationsverteilung eines Proteinspots Probe 1: Lutetium Probe 2: Terbium Lu Tm 6 pmol 22 fmol Time in s

12 Linearer Meßbereich ICP-MS vs. ESI-MS Triple Quadropol ESI-MS: Linearität bis ca. 3 Größenordnungen für einzelne Peptide (hier Kalibrationskurve: fmol) Kalibration mit Peptid-spezifischen Heavy-Peptides ICP-MS: (hier Kalibrationskure: 570 amol bis 57 pmol) Linearität über 8 Größenordnungen Externe/Interne Kalibration mit Metallstandards z.b. Terbiumchloridlösungen (Protein/Peptid-unabhängig) aus Wienkoop et al.: Relative and absolute quantitative shotgun proteomics: targeting low-abundance proteins in Arabidobsis thaliana, Journal of Experimental Botany Kalibrationskurve Terbium 2.5E E+10 y = E+05x E+06 R 2 = E-01 Peakfläche 1.5E E E E c [amol]

13 Absolute Quantifizierung m (Metall) [g] * M (Proteine) [g/mol] m (Protein) [g] = * F x (Metall) [-] * M (Metall) [g/mol] m: mit ICP-MS gemessene Metallmenge [g] F: Verdünnungsfaktor der Probe vor ICP-MS Messung x: Anzahl der MeCAT-Metall-Markierungen des Proteins

14 MeCAT-Workflow auf Peptidebene Markierungs-Metalle Tm Proteinebene Lu Peptidebene Ho

15 Voraussetzungen für Multiplex-Markierungen A) Quantitative Markierung B) Ko-Migration/-Elution in Trennverfahren Elektrophorese LC C) Kompatibilität mit Detektionsverfahren Quantifikation (ICP-MS, MALDI-, ESI-MS) Identifikation (MALDI-, ESI-MSMS)

16 Ko-Elution MeCAT-markierter Peptide MeCAT-Peptide mit Tb, Ho, Tm, Lu

17 Relative Quantifizierung Ho und Lu MeCATmarkierter Peptide nanolc-esi-msms MALDI-MS Massendifferenzen (Da) zw. 159 Tb (Terbium) Ho (Holmium) Tm (Thulium) 175 Lu (Lutetium) 6

18 MSMS-Identifikation von MeCAT-markierten Peptiden mit Sequit! (de novo Sequenzierung)

19 Voraussetzungen für die Multiplex-Markierungen MeCAT + A) Quantitative Markierung + B) Ko-Migration/-Elution in Trennverfahren Elektrophorese LC + C) Kompatibilität mit Detektionsverfahren Quantifikation (ICP-MS, MALDI-, ESI-MS) Identifikation (MALDI-, ESI-MSMS)

20 Vergleich von Isotopen- und Metallmarkierung Verfahren mit stabiler Isotopenmarkierung Komplexe und aufwendige Datenauswertung zur Quantifizierung Keine Quantifizierung auf Proteinebene Relative Quantifizierung von Peptiden mit MALDI- und ESI-MS Multiplexing, je Reagenz zwei bis vier Proben Sensitivität im fmol Bereich MeCAT-Markierung Sehr einfache Datenauswertung durch Quantifizierung weniger Metall-Ionenspuren mit ICP-MS Absolute Quantifizierung auf Proteinebene durch ICP MS mit sehr gutem Signal-Rauschverhältnis Relative Quantifizierung von Peptiden mit MALDI-, ESI-MS und ICP MS (sehr gutes Signal- Rauschverhältnis) Multiplexing, Quantifizierung von 4 und mehr Proben möglich Sensitivität im attomol-bereich (ICP MS) Detektion von Proteinen geringer Abundanz (fmol Bereich bei ESI-MS) Dyn. Messbereich: <=10 3 Hoher dynamischer Messbereich: >10 8 (mit ICP-MS)

21 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Proteomics Services, Technologies and Products Kooperationspartner M. Linscheid, R. Ahrends, S.Pieper, A. Kühn Institut für Chemie, Humboldt Universität zu Berlin P. Jungblut, Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin W. Weckwerth, Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, Potsdam