Untersuchungen zum Pollentransfer von transgenem Raps auf verwandte Kreuzblütler durch Wind und Insekten

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1 BMBF-Statusseminar, Braunschweig Untersuchungen zum Pollentransfer von transgenem Raps auf verwandte Kreuzblütler durch Wind und Insekten Christoph Saure, Stefan Kühne und Bernd Hommel Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA), Institut für integrierten Pflanzenschutz, Stahnsdorfer Damm 81, Kleinmachnow Zusammenfassung Im Jahr 1998 wurden auf einer Freisetzungsfläche der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) mit Glufosinat-tolerantem Winterraps blütenbesuchende Insekten kartiert und Untersuchungen zum insekten- sowie windbedingten Pollentransfer durchgeführt. Während der Blühzeit des Rapses konnten 63 Bienen-, 29 Schwebfliegenund 32 Pflanzenwespenarten nachgewiesen werden, darunter vier Arten mit spezifischer Bindung an Brassicaceen. An der Bestäubung von Raps und verwandten Kreuzblütlern sind sowohl der Wind als auch Insekten beteiligt. Eine Auskreuzung des Transgens konnte unter Freilandbedingungen für Brassica juncea und Brassica nigra belegt werden, eine Auskreuzung auf Raphanus raphanistrum gelang dagegen nicht. Abstract Flower-visiting insects have been mapped and pollen transfer by wind and insects has been investigated at an experimental site of the Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry (BBA) where glufosinate-tolerant oilseed rape has been grown in During the flowering of oilseed rape, we found 63 species of bees, 29 species of syrphids and 32 species of sawflies, among them four species with a specific relationship to Brassicaceae. Both wind and insects contributed to the pollination of oilseed rape and related cruzifers. Under field conditions, outcrossing of the transgene was found in Brassica juncea and Brassica nigra, while outcrossing to Raphanus raphanistrum failed. Einleitung Die Untersuchungen mit Glufosinat-tolerantem Winterraps erfolgten auf einer Freisetzungsfläche der BBA in Dahnsdorf, Landkreis Potsdam-Mittelmark, im Land Brandenburg. Der von Rapsblüten emittierte Pollen steht nicht nur zur Selbstbestäubung bzw. zur Bestäubung weiterer Rapspflanzen zur Verfügung, sondern auch zur Bestäubung verwandter Kreuzblütler. Daraus ergeben sich mehrere Fragen: Wie wirkt sich die windbedingte und die insektenbedingte Pollenverbreitung aus? Welche Insekten spielen dabei eine Rolle? Kommt es zur Auskreuzung des Transgens auf rapsverwandte Arten? Wie sind die Hybride morphologisch und zytologisch zu charakterisieren?

2 112 Saure et al. Das Projekt ist auf zwei Jahre konzipiert. Hier werden Teilergebnisse des ersten Untersuchungsjahres 1998 vorgestellt. Der Gemeinschaft der Förderer und Freunde der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft e.v. sei für die finanzielle Unterstützung gedankt. Material und Methoden Neben den als bedeutende Blütenbestäuber bekannten Insektengruppen Bienen (Apidae) und Schwebfliegen (Syrphidae) (Kugler, 1970; Westrich, 1989) wurden Pflanzenwespen (Symphyta) untersucht, die im Gebiet ebenfalls an der Verbreitung von Rapspollen beteiligt sind. Die blütenbesuchenden Insekten wurden nicht nur am Raps und an verwandten Kreuzblütlern, sondern auch an Ackerrändern, auf Feldwegen und Grasfluren in der unmittelbaren Umgebung der Versuchsflächen (Grünland) sowie an einem 500 m entfernten Waldrand erfasst. Dadurch kann das Artenpotential im gesamten Untersuchungsraum besser eingeschätzt werden. Die Bestandserfassung erfolgte weitgehend durch Handfänge. Am Waldrand und an einer an die Versuchsfeldanlage grenzenden Rapsproduktionsfläche kamen Fallen (je eine Malaisefalle und Gelbschale) zum Einsatz. Am konventionellen und am transgenen Raps wurden Linientaxierungen durchgeführt. Durch Fang-Wiederfang konnte der Blütenbesuch einzelner farblich markierter Individuen festgehalten werden. Der windbedingte Pollenflug wurde mit Hilfe von Glycerin-bestrichenen Objektträgern bestimmt, die an 3 Tagen für jeweils 6 h in Blütenstandshöhe arretiert waren. Die Pollenfallen standen am Rand der transgenen Rapsparzellen (1 m Abstand) und neben den mit verschiedenen Kreuzblütlern ausgestatteten Habitatinseln (Abstand vom Raps ca. 10 m). Für Auskreuzungsuntersuchungen wurden Hederich (Raphanus raphanistrum), Sareptasenf (Brassica juncea) und Schwarzer Senf (Brassica nigra) im Gewächshaus angezogen. Im Freiland erfolgte die Ausbringung inselförmig zwischen den zentralen Parzellen mit transgenem Raps und der umgebenden Mantelsaat mit konventionellem Raps. Für Untersuchungen zum Gentransfer wurden Kreuzblütlersamen in den Habitatinseln gesammelt, ausgesät und zweimal mit dem Komplementärherbizid Liberty behandelt (3 l/ha). Überlebende Jungpflanzen deuteten auf eine Übertragung des pat-gens hin und wurden mit Hilfe molekularbiologischer Methoden (PCR, RAPD-PCR, Chromosomenzählung) untersucht. Ergebnisse Artendiversität und Artenidentität Im Untersuchungsgebiet wurden bisher 63 Bienen-, 29 Schwebfliegen- und 32 Pflanzenwespenarten nachgewiesen. Vor allem die Bienen sind mit einigen bemerkenswerten Arten vertreten, z.b. Andrena niveata, Andrena suerinensis und Osmia brevicornis. Da diese Arten ausschließlich Kreuzblütlerpollen als Larvennahrung eintragen, werden sie als Charakterarten des Untersuchungsgebietes definiert. Unter den Pflanzenwespen ist die Art

3 BMBF-Projekt: Pollentransfer auf verwandte Kreuzblütler 113 Elinora flaveola im Larvalstadium an Brassicaceen als Futterpflanzen gebunden und kann somit ebenfalls als Charakterart der Versuchsfeldanlage gelten. In Tab. 1 sind die Zahlen der an verschiedenen Habitatstrukturen (Pflanzen) bzw. Habitatstrukturkomplexen (Grünland, Waldrand) nachgewiesenen Insektenarten aufgeführt. Artenidentitäten geben den Grad der Übereinstimmung von Artengemeinschaften wieder (Sörensen-Index nach Mühlenberg, 1984). Danach zeigen der konventionelle Raps (Mantelsaat) und der transgene Raps (Parzellen) den höchsten Grad an Übereinstimmung (Artenidentität von 66%). Eine Übereinstimmung der Zönosen zwischen 50% und 60% weisen Mantelsaat/Grünland, Mantelsaat/Habitatinseln und transgener Raps/Habitatinseln auf. Es sind damit zu einem großen Teil dieselben Arten, die Rapsblüten (konventionell, transgen) sowie Blüten der Kreuzblütler in den Habitatinseln besuchen. Dadurch wird eine insektenbedingte Pollenübertragung von Raps auf andere Brassicaceae wahrscheinlich. Apidae Syrphidae Symphyta gesamt (n) (%) (n) (%) (n) (%) (n) (%) Konv. Raps 34 54, ,9 8 25, ,7 (Mantelsaat) konv. Raps 10 15, , , ,7 (Produktionsfl.) Transgener Raps 24 38,1 4 13,8 4 12, ,8 Sareptasenf 14 22,2 2 6, ,9 Schwarzer Senf 18 28,6 8 27,6 1 3, ,8 Hederich 9 14,3 3 10, ,7 Grünland 43 68,3 9 31,0 8 25, ,4 Waldrand 31 49,2 5 17, , ,5 Tab. 1: Zahl der nachgewiesenen Arten an Habitatstrukturen bzw. in Habitatstrukturkomplexen Pollentransfer durch Wind Die höchsten Pollenzahlen wurden an der Habitatinsel Ost gezählt. Die Pollenfalle enthält hier pro Zählkammer ca. zweimal so viele, nämlich 9,3 Pollen, wie die Fallen an den Habitatinseln Nord (4,0 Pollen), Süd (4,6 Pollen) und West (4,7 Pollen). Das Ergebnis stimmt mit der dominierenden Windrichtung aus W-SW überein, d.h. die hohen Pollenzahlen können auf Windverdriftung zurückgeführt werden. Ob aus dem auf Habitatinsel Ost geernteten Samen auch besonders viele Hybridpflanzen hervorgehen und damit dem windbedingten Pollenflug bei der Bestäubung eine bedeutendere Funktion als dem insektenbedingten Pollenflug zukommt, bleibt noch zu prüfen. Die Konzentration von Rapspollen in der Luft nimmt bereits in geringer Entfernung der Rapsbestände ab. In einer Entfernung von 1 m von den Rapsparzellen wurden durchschnittlich 127,7 Pollen gezählt, an den Habitatinseln dagegen durchschnittlich nur 5,9 Pollen. Die Pollenkonzentration geht also in 10 m Entfernung nach eigenen Untersuchungen auf 4,6% zurück.

4 114 Saure et al. Pollentransfer durch Insekten Anhand von Markierungsversuchen an Bienen konnte gezeigt werden, dass dieselben Individuen sowohl Blüten vom transgenen als auch vom konventionellen Raps anfliegen. Einzelne Individuen besuchten Rapspflanzen und wechselten anschließend zu Brassicaceen in den Habitatinseln. Die Wahrscheinlichkeit einer Bestäubung ist bei den meist stark behaarten Bienen besonders groß. Werden Blüten einer transgenen Rapspflanze und im Anschluss daran Blüten von konventionellem Raps oder verwandten Kreuzblütlern besucht, besteht die Möglichkeit einer Pollenübertragung und damit einer Auskreuzung des Herbizidtoleranzgens. Auskreuzungsuntersuchungen Hederich Die Überprüfung des Hederichsamens ist noch nicht abgeschlossen. Bisher überlebte keine Pflanze die zweifache Herbizidapplikation. Die vorliegenden Untersuchungsergebnisse scheinen gegen eine Auskreuzung des Transgens auf Hederich zu sprechen. Schwarzer Senf Von den bisher mit dem Komplementärherbizid behandelten Keimlingen von Brassica nigra überlebte eine Pflanze. Das Transgen konnte nachgewiesen werden. Eine Untersuchung des Chromosomensatzes steht bislang noch aus. Sareptasenf Sareptasenf zeigt in den bisherigen Untersuchungen die stärkste Neigung zur Hybridisierung mit Raps. Bisher wurde jedoch erst ein Teil des in den Habitatinseln geernteten Samens getestet. Aus dem Samen der Habitatinsel Ost entwickelten sich Keimlinge, von denen 20 die Herbizidapplikationen überlebten. Das entspricht einem Anteil von 0,26%. Charakterisierung der Brassica napus x Brassica juncea-hybriden Morphologie Der Blattrand des Hybrids ist wie beim Raps gelappt und mit langen Haaren besetzt. Brassica juncea besitzt dagegen einen Blattrand mit doppelter, spitzer Bezahnung und einzelnen, kurzen Haaren. Die Adern auf der Blattspreite weisen sowohl bei der Hybridpflanze als auch beim Sareptasenf viele Haare auf. Dagegen sind die Blattadern beim Raps unbehaart. Das Merkmal Blattadern mit Haaren wurde somit von der mütterlichen Pflanze übernommen. Genetik Abb. 1 zeigt ein Gel, auf dem am oberen und unteren Rand ein 100 bp-marker und im mittleren Bereich jeweils zwei Proben von transgenem Raps und eines Brassica juncea- Hybriden aufgetragen wurden. Die aus Blattproben extrahierte DNA wurde in der PCR mit spezifischen Primern, die die Nukleotidsequenzen des pat-gens erkennen, amplifiziert. Im ersten Fall wurde eine 734 bp-sequenz des pat-gens amplifiziert und durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht (Abb. 1, oben), im zweiten Fall ein 386 bp-fragment

5 BMBF-Projekt: Pollentransfer auf verwandte Kreuzblütler 115 (Abb. 1, unten). Die Sequenzen des Transgens sind sowohl im GVO-Raps als auch in den Proben der Hybridpflanze deutlich zu erkennen. Damit ist die Übertragung des pat-gens bewiesen. In einem weiteren Untersuchungsabschnitt wurden Raps, verwandte Brassicaceen und die Hybridpflanze über ein DNA-Fingerprinting (RAPD-PCR) charakterisiert. Abb. 2 zeigt eine Auswahl von mehreren Gelen, die das intermediäre Bandenmuster des Hybriden am besten verdeutlichen. Am oberen Rand der Gele ist jeweils ein 100 bp-marker als Standard aufgetragen. Es folgt von oben nach unten das Bandenmuster von transgenem Raps, konventionellem Raps, Hybrid, Brassica juncea, Brassica nigra und Raphanus raphanistrum. Von Bedeutung sind vor allem die Banden des Hybriden. Man erkennt drei Fragmente, die der Hybrid mit dem Vater (Raps), und vier Fragmente, die er mit der Mutter (Brassica juncea) gemeinsam hat. 73 4b p 38 6b p 100 bp Marker Brassica napus, GVO Brassica juncea-hybrid Brassica napus, GVO Brassica juncea-hybrid 100 bp Marker Abb. 1: Zwei Nukleotidsequenzen des pat-gens im transgenen Raps und im Hybrid sind in der Gelelektrophorese als deutliche Banden zu erkennen Abb. 2: Charakterisierung des Hybriden über ein DNA-Fingerprinting 100 bp Marker Brassica napus, GVO Brassica napus, konventionell Brassica juncea-hybrid Brassica juncea Brassica nigra Raphanus raphanistrum

6 116 Saure et al. Schlussfolgerungen Hinsichtlich des kurzen, nur 7-wöchigen Untersuchungszeitraumes und des eingeschränkten Strukturangebots der intensiv genutzten Agrarlandschaft sind die ermittelten Artenzahlen unerwartet groß. Vor allem die Bienen sind sehr artenreich vertreten. Bedingt durch kurzfristige Populationsschwankungen oder langfristig niedrige Bestandsgrößen wurde sicherlich nur ein Teil der tatsächlich vorhandenen Arten (aus den untersuchten Gruppen) erfasst. Es ist davon auszugehen, dass im zweiten Untersuchungsjahr weitere Artennachweise gelingen. Brassicaceen-Blüten werden von Insekten aus unterschiedlichen Gründen besucht, meist aber zur Nahrungsaufnahme. Rapsblüten beispielsweise üben mit ihrer Gelbfärbung, ihrer offenen Form und ihrer großen Nektar- und Pollenproduktion auf viele Insekten eine hohe Anziehungskraft aus (Free, 1970; Mesquida und Renard, 1981). Im mehr oder weniger ausgeprägten Haarkleid der Insekten kann Pollen haftenbleiben, von einer Blüte zur nächsten transportiert und dort auf die Narbe übertragen werden. Die Bedeutung von Insekten als Pollenvektoren hängt dabei nicht zuletzt von ihrer Flugaktivität ab. Wesserling und Tscharntke (1995) fanden bei u.a. Bienen mit geringer Körpergröße Aktionsradien von ca. 200 m und bei größeren Arten bis ca. 800 m vor. Auch Chambers (1968) und Witt (1992) konnten bei Sandbienen (Andrena spec.) Flugdistanzen von bis zu 800 m feststellen. Walther-Hellwig und Frankl (1998) untersuchten die Sammelradien von Hummeln in der Agrarlandschaft. Einige Hummelarten sind in der Lage, ein temporäres Nahrungshabitat in einer Entfernung von m zu nutzen. Bei Honigbienen beträgt der normale Sammelradius 1 bis 2 km, es werden aber auch Flugstrecken von bis zu 14 km zurückgelegt (Eickwort und Ginsberg, 1980). Diese Angaben verdeutlichen, dass die Mantelsaat aus konventionellen Raps-Fangpflanzen im Freisetzungsversuch Dahnsdorf keine Barriere für Bienen (und viele andere Insekten) darstellen kann, die z.b. Distanzen zwischen Nist- und Nahrungshabitat überbrücken. Welchen Anteil der Wind und welchen Anteil Insekten an der Bestäubung von rapsverwandten Kreuzblütlern haben, ist schwer zu beurteilen. Sicherlich spielen beide Faktoren eine Rolle. Namai und Ohsawa (1987) untersuchten die Fremdbestäubung von Raps durch Insekten resp. Wind in Feldkulturen in Kanada, Japan, Polen und Deutschland. Sie kommen zum Ergebnis, dass insbesondere in Abhängigkeit von den Arten- und Individuendichten blütenbesuchender Insekten die Fremdbestäubung an einem Standort vorrangig windbedingt, an einem anderen vorrangig insektenbedingt sein kann. Der windbedingte Pollenflug ist vor allem in der unmittelbaren Umgebung eines Rapsfeldes von Bedeutung. Nach Mesquida und Renard (1982) geht bereits in 6 bis 10 m Entfernung die Pollenkonzentration auf 50%, nach McCartney und Lacey (1991) in 100 m Abstand auf 2-10% zurück. Dennoch kann ein Teil des Pollens auch über weite Distanzen transportiert werden, vor allem in höheren Luftschichten: Timmons et al. (1995) konnten z.b. noch in 2,5 km Entfernung von einem Rapsfeld windverdrifteten Pollen nachweisen und in 1,5 km Entfernung Hybridisierungen feststellen. Pfeilstetter et al. (1999) kommen zum Ergebnis,

7 BMBF-Projekt: Pollentransfer auf verwandte Kreuzblütler 117 dass bei einem großflächigen, kommerziellen Anbau von transgenem, herbizidtolerantem Raps eine wirkungsvolle Eingrenzung der Pollenverbreitung kaum möglich ist. Die Ergebnisse der Auskreuzungsversuche stimmen nur teilweise mit den aus der Literatur bekannten Angaben überein. Eine Hybridisierung zwischen Raps und Schwarzem Senf gelang bisher nur unter künstlichen Bedingungen (Heyn, 1977; Mathias, 1991; Kerlan et al., 1992, 1993). Eine Auskreuzung von Raps auf Brassica nigra im Freiland ist bisher noch nicht bekannt geworden. Dagegen konnten verschiedene Arbeitsgruppen zeigen, dass Hederich mit Raps unter Freilandbedingungen erfolgreich kreuzbar ist (Lefol et al., 1996; Chèvre et al., 1997). In der eigenen Versuchsanordnung gelang die Bastardisierung bislang nicht. Die erfolgreiche Hybridisierung von Raps und Sareptasenf im Gewächshaus wurde bereits mehrfach durchgeführt (Heyn, 1977; Rousselle und Eber, 1983; Roy, 1984; Bajaj et al., 1986). Scheffler und Dale (1994) weisen darauf hin, dass auch unter Feldbedingungen eine Befruchtung und die Entwicklung von F1-Bastarden möglich sind. Welche Chromosomenzahlen die gewonnenen Hybridpflanzen besitzen, wird in Kooperation mit der Universität Göttingen (Institut für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung) ermittelt. Die elterlichen Pflanzen besitzen die Chromosomensätze 2n=38 (Raps) und 2n=36 (Sareptasenf). Die bisher untersuchten Pflanzen weisen einen Chromosomensatz von 2n=37 auf und sind somit echte Hybride. Literatur Bajaj, Y.P.S., Mahajan, S.K., Labana, K.S.: Interspecific hybridization of Brassica napus and B. juncea through ovary, ovule and embryo culture. Euphytica 35, , Chambers, V.H.: Pollen collected by species of Andrena (Hymenoptera: Apidae). Proc. R. ent. Soc. Lond. (A) 43, , Chèvre, A.-M., Eber, F., Baranger, A., Renard, M.: Gene flow from transgenic crops. Nature 389, 924, Eickwort, G.C., Ginsberg, H.S.: Foraging and mating behavior in Apoidea. Ann. Rev. Ent. 25, , Free, J.B.: Insect Pollination of Crops. London (Academic Press), Heyn, F.W.: Analysis of unreduced gametes in the Brassicaceae by crosses between species and ploidy levels. Z. Pflanzenzücht. 78, 13-30, 1977.

8 118 Saure et al. Kerlan, M.C., Chèvre, A.-M., Eber, F., Baranger, A., Renard, M.: Risk assessment of outcrossing of transgenic rapeseed to related species: I. Interspecific hybrid production under optimal conditions with emphasis on pollination and fertilization. Euphytica 62, , Kerlan, M.C., Chèvre, A.-M., Eber, F.: Interspecific hybrids between a transgenic rapeseed (Brassica napus) and related species: cytogenetical characterization and detection of the transgene. Genome 36, , Kugler, H.: Einführung in die Blütenökologie. 2. Aufl., 345 S., Stuttgart (Fischer), Lefol, E., Fleury, A., Darmency, H.: Gene dispersal from transgenic crops. II. Hybridization between oilseed rape and the wild hoary mustard. Sex. Plant Reprod. 9, , Mathias, R: Improved embryo rescue technique for intergeneric hybridization between Sinapis species and Brassica napus. Cruziferae Newsletter 14/15, 90-91, McCartney, H.A., Lacey, M.E.: Wind dispersal of pollen from crops of oilseed rape (Brassica napus L.). J. Aerosol Sci. 22 (4), , Mesquida, J., Renard, M.: Le colza, principales caractéristiques botaniques et biologiques. Bul. Tech. Apic. 8 (3), , Mesquida, J., Renard, M.: Étude de la dispersion du pollen par le vent et d importance de la pollinisation anémophile chez la colza (Brassica napus L., var. oleifera Metzger). Apidologie 13, , Mühlenberg, M.: Freilandökologie. 3. Aufl., 512 S., Heidelberg, Wiesbaden (Quelle & Meyer), Namai, H, Ohsawa, R.: Variations in pollination requirements of Brassica napus L. (rapeseed) cultivars reflect density of insect pollinators in the regions where each cultivar was bred and/or cultivated. Cruziferae Newsletter 12, 58-59, Pfeilstetter, E., Matzk, A., Schiemann, J., Feldmann, S.: Untersuchungen zum Auskreuzungsverhalten von Liberty-tolerantem Winterraps auf nicht-transgenen Raps (Brassica napus). In: Schiemann, J. (Hrsg.): Biologische Sicherheit Proceedings zum BMBF-Workshop, Braunschweig Freisetzungsbegleitende Sicherheitsforschung mit gentechnisch veränderten Pflanzen und Mikroorganismen, Braunschweig, Jülich, BEO (Projektträger Biologie, Energie, Umwelt des BMBF), S , 1999.

9 BMBF-Projekt: Pollentransfer auf verwandte Kreuzblütler 119 Rousselle, P., Eber, F.: Croisements interspécifiques entre quelques Brassicae et Brassica napus L.-analyse génomique des hybrides et perspectives d obtention de systèmes d androstérilité chez le colza. Agronomie 3, , Roy, N.N.: Interspecific transfer of Brassica juncea-type high blackleg resistance to Brassica napus. Euphytica 33, , Scheffler, J.A., Dale, P.J.: Opportunities for gene transfer from transgenic oilseed rape (Brassica napus) to related species. Transgenic Research 3, , Timmons, A. M., O Brien, E.T., Charters, Y.M., Dubbels, S.J., Wilkinson, M.J.: Assessing the risks of wind pollination from fields of genetically modified Brassica napus ssp. oleifera. Euphytica 85, , Walther-Hellwig, K., Frankl, R.: Nahrungshabitate und Sammelradien von Hummeln in Agrarlandschaften (Hymenoptera, Apidae). Beitr. Hymenopt.-Tagung Stuttgart 1998, 10, Wesserling, J., Tscharntke, T.: Das Heimfindevermögen von Stechimmen und die Verinselung von Lebensräumen. Mitt. dt. Ges. allg. angew. Ent. 10, , Westrich, P.: Die Wildbienen Baden-Württembergs. 2 Bde., 972 S., Stuttgart (Ulmer), Witt, R.: Zur Bionomie der Sandbiene Andrena barbilabris (Kirby 1802) und ihrer Kuckucksbienen Nomada alboguttata Herrich-Schäffer 1839 und Sphecodes pellucidus Smith Drosera 92 (1), 47-81, 1992.