Umfassende Untersuchungen des Eintrags von Resistenzgenen in Abwässer mittels Metagenomanalysen. D. Jonas, M. Bäumlisberger

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Paulina Beyer
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1 Innovative Konzepte und Technologien für die separate Behandlung von Abwasser aus Einrichtungen des Gesundheitswesens Umfassende Untersuchungen des Eintrags von Resistenzgenen in Abwässer mittels Metagenomanalysen D. Jonas, M. Bäumlisberger 1 Proben Einrichtungen + Psychiatrische Fachklinik + Klinik mit orthopädischem Schwerpunkt + Pflege- und Betreuungsheim + Kommunales Abwasser Probenahmen + 3 Beprobungen zu unterschiedlichen Jahreszeiten + 24 h Mischprobe 2 1

2 PCR-Nachweis von Resistenz-Genen Enzym-Familie PK PK PK ZK1 ZK1 ZK1 ZK2 ZK2 ZK2 PB-E PB-E PB-E PB-A PB-A PB-A Jahreszeit F W S S H F S H S H F S H F S Glycopeptid- Ø Ø Ø + Ø Ø Ø + Ø Ø Ø Ø + Ø Ø Resistenz Methicillin- + Ø Ø + Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Resistenz Ø + + Ø + + Ø Ø + + Ø Ø Ø + Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø + Ø + + Tetracycline- + Ø + Ø Ø Ø + Ø Ø Ø Ø + Ø Ø + Resistenz Ø Ø Ø + Ø Ø Ø Ø Ø Ø + Ø + + Ø Ø Ø Ø Ø + Ø + + Ø + MBL Klasse A und D beta Laktamasen Ø Ø Ø + Ø Ø + Ø Ø + + Ø + Ø Ø Ø Ø Ø + Ø Ø Ø + Ø Ø Ø Ø + + Ø Ø + + Ø Ø Ø + Ø Ø Ø Ø + Ø + + Ø + + Ø + + Ø Ø + Ø Ø + Ø Ø + Ø + + Ø + + AmpC Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø + Ø Ø + Ø Ø + Ø Ø + Ø + + Ø + + Ø Probenahme-Orte Pflege- und Betreuungsheim DORF 800 Einwohner PBH PBH-E K-WW PBH-A Quelle: Google-Maps (anonymisiert) 4 2

Ø + Ø Ø Ø + Ø Ø Ø Ø + Ø Ø + Resistenz + + + + + + + + + Ø + + + + + Ø Ø + Ø Ø Ø Ø Ø Ø + Ø + + Ø + + + + + + Ø Ø Ø Ø + Ø + + Ø + MBL Klasse A und D beta Laktamasen Ø Ø + + + + + Ø + Ø Ø + Ø + + + + +

3 Methoden 24h-Mischproben Gesamt-Genom-Extraktion Illumina- Sequenzierung READS BLAST Analyse MG-RAST ARG MGE Phylogenetische Analyse Metabolic Reconstruction 5 Metagenome rapid annotations using subsystems technology F. Meyer et al. BMC Bioinformatics 2008, 9: 386 Open-Source-Server zum Annotieren (shotgun metagenomics) Subsystems: Untergruppen von verwandten, funktionellen Rollen für biologische Prozesse oder strukturelle Komplexe; in verschiedenen Ebenen hierarchisch gegliedert READS Quality filtering Gene-Calling SSU rrna Identification Protein- Annotation Database: M5RNA Database: SEED 6 3

BMC Bioinformatics 2008, 9: 386 Open-Source-Server zum Annotieren (shotgun metagenomics) Subsystems: Untergruppen von verwandten, funktionellen

Die häufigsten zugeordneten Phyla Vergleich PB-Heim und kommunales Abwasser Actinobacteria Firmicutes PBH-A K-WW Proteobacteria 0% 20% 40% 60% 7 Metabolic Reconstruction Level 1 Gen-Abundanz im

Cofactors, Vitamins, Prosthetic Groups, Pigments Miscellaneous Amino Acids and Derivatives Protein Metabolism Carbohydrates Clustering-based subsystems PBH-A K-WW 0% 5% 10% 15% 20% Virulence, Disease

4 Die häufigsten zugeordneten Phyla Vergleich PB-Heim und kommunales Abwasser Actinobacteria Firmicutes PBH-A K-WW Proteobacteria 0% 20% 40% 60% 7 Metabolic Reconstruction Level 1 Gen-Abundanz im Abwassermetagenom des PB-Heims und des kommunalen Abwassers Virulence, Disease and Defense Membrane Transport Nucleosides and Nucleotides Cell Wall and Capsule RNA Metabolism DNA Metabolism Cofactors, Vitamins, Prosthetic Groups, Pigments Miscellaneous Amino Acids and Derivatives Protein Metabolism Carbohydrates Clustering-based subsystems PBH-A K-WW 0% 5% 10% 15% 20% Virulence, Disease and Defense PBH-A Cell Wall and Capsule K-WW Fatty Acids, Lipids, and Isoprenoids RNA Metabolism DNA Metabolism Cofactors, Vitamins, Prosthetic Groups, Pigments Miscellaneous Protein Metabolism Amino Acids and Derivatives Carbohydrates Clustering-based subsystems 0% 5% 10% 15% 20% Relative Häufigkeit 8 4

Metabolic Reconstruction Level 2 Virulence, Disease and Defense (2-3%) + Adhesion + BRSAP (Bacteriocins, ribosomally synthesized antibacterial peptides) + Detection + INIR (Invasion and intracellular

5 Metabolic Reconstruction Level 2 Virulence, Disease and Defense (2-3%) + Adhesion + BRSAP (Bacteriocins, ribosomally synthesized antibacterial peptides) + Detection + INIR (Invasion and intracellular resistance) + RATC (Resistance to antibiotics and toxic compounds) + TS (Toxins and superantigens) TS BRSAP PBH-A K-WW INIR Adhesion Detection Others RATC 0% 20% 40% 60% 80% Relative Häufigkeit Relative Häufigkeit 9 K-WW PBH-A K-WW PBH-A reads (raw) 5,2E+06 3,2E+07 5,5E+06 1,2E+07 predicted proteins with known functions Resistance to antibiotics and toxic compounds (RATC) 2,3E+06 45% 1,8E+07 58% 2,8E+06 50% 5,7E+06 49% 1,7% 1,5% 2,2% 2,1% Durso LM et al. (2012) Distribution and Quantification of Antibiotic Resistant Genes and Bacteria across Agricultural and Non-Agricultural Metagenomes. PLoS ONE 7(11): e

Relative Häufigkeit 9 K-WW PBH-A K-WW PBH-A reads (raw) 5,2E+06 3,2E+07 5,5E+06 1,2E+07 predicted proteins with known functions Resistance to antibiotics and toxic compounds (RATC) 2,3E+06 45%

6 BLAST-Analysen Alignment search mittels Galaxy / CRS4 ( Antibiotika-Resistenz-Gene (ARG) CARD (Comprehensive Antibiotic Research Database) Antibiotic Resistance Ontology (ARO) mit kontrolliertem Vokabular McArthur et al. 201 Antimicrob. Agents and Chemother., 57: 3348 Mobile Genetic Elements (MGE) INTEGRALL: (Integrons, integrases and gene cassettes database) A. Moura et al Bioinformatics, 25: 1096 READS blastn/ tblastx Quality filtering blastn/ tblastx CARD Integrall 11 Antibiotika-Resistenz-Klassen (top 10) Rel. Häufigkeit nach Antibiotika-Klassen gruppierter ARO 12 6

Vokabular McArthur et al. 201 Antimicrob. Agents and Chemother.

7 Abundanz der tet Determinanten 13 ß-Laktam-Resistenz Determinanten 14 7

Mobile Genetic Elements BLAST gegen Integrall Integron-Integrasen PBH-A K-WW PBH-A K-WW 0 5 10 15 hits / reads [ppm] 15 Zusammenfassung: Mit MG-Analysen lassen sich mikrobielle Strukturen und

8 Mobile Genetic Elements BLAST gegen Integrall Integron-Integrasen PBH-A K-WW PBH-A K-WW hits / reads [ppm] 15 Zusammenfassung: Mit MG-Analysen lassen sich mikrobielle Strukturen und Funktionen wie ARG und MGE umfassend, d.h. quantitativ & in ihrer Diversität zugleich untersuchen. Es gibt einen bereits deutlichen, natürlichen Hintergrund an ARG. Ergebnisse selektiver/spezifischer Mess-Methoden (PCR, Selektivagarmedien) können zu Fehl-Interpretation führen. Unterschiede zwischen den Zeitpunkten der Probenahmen zumeist größer als zwischen den Standorten. Keine offenkundig erhöhten Konzentrationen an ARG/MGE nach dem Zufluss des Pflegeheim-Abwassers. Grenzen der Methode: + Read Länge (Phylum statt Genus oder Spezies; ESBL von TEM/SHV-Typ) + Keine Expressionsdaten (z.b. Efflux-Pumpen, Omp) + Resistenzen durch SNP in house keeping Genen nicht praktikabel bestimmbar (z.b. gyra/b, parc/d, rpob) 16 8

Ergebnisse selektiver/spezifischer Mess-Methoden (PCR, Selektivagarmedien) können zu Fehl-Interpretation führen.

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit www.sauberplus.

9 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Carbon Service & Consulting Aktivkohle für den Umweltschutz Förderkennzeichen: 02WRS1280A - J 17 9

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