Differenzialblutbild TEAS Themen Erythrozyten, Leukozyten, Färbung nach Pappenheim. Prinzip Beim manuellen Differenzialblutbild wird ein kleiner Blutstropfen auf einem Objektträger so ausgestrichen, dass die Zellen in einer Schicht einzeln nebeneinander liegen. Nach der Pappenheim-Färbung lassen sich die Zellen einzeln nach Größe, Kern-Plasma-Relation, Kernform und -struktur, Zytoplasmafarbe und -granulierung klassifizieren. Die Erythrozyten werden ebenfalls beurteilt. Material Schülerset 1 Messpipette 10 ml, Teilung 0,1 ml 366-1 Pipettierball 36592-1 Reagenzglasgestell, PP, 12 Plätze 46235-1 Messkolben, 10 ml 36552-1 Messzylinder, 250 ml 36630-1 Färbebank mit Wanne 64534-1 Spritzflasche, 5 ml 33931- Einweghandschuhe, M, Latex, 1 1 46359- Stk. 1 Objekträger 64691-1 Immersionsöl, 50 ml 31381-05 1 Mikroskop 62194-93 Chemikalien 1 Azur-Eosin-Methylenblau-Lösung, 1 ml 31070-10 1 Methanol (Fixierlösung) 30142-70 1 May-Grünwald-Lösung 31562-70 Puffertabletten ph 7,2 für Mikroskopie 1 30284-10 Abb. 1: P59215 www.phywe.com P59215 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1
TEAS Differenzialblutbild Aufgabe 1. Untersuchen sie eine gefärbte Blutprobe mikroskopisch und differenzieren Sie die Leukozyten. Durchführung Untersuchungsmaterial EDTA-antikoaguliertes Venen- oder Kapillarblut siehe Präanalytik. Anfertigen eines Blutausstriches Ein kleiner Blutstropfen wird mit der Pipettenspitze auf die Oberfläche eines Objektträgers aufgetragen (Abb. 2) und sofort mit einem zweiten Objektträger ausgestrichen. Dabei führt man den zweiten Objektträger von vorne an den Bluttropfen heran, so dass er sich an der Hinterkante entlang ausbreitet (Abb. 3). Abb. 2 Abb. 3 Ausstrich zu dünn und zu kurz Abb. 4 Abb. 5 Richtige Größe und Dicke Dann zieht man ihn in einem Winkel von 45 zwischen Objektträger und Ausstrichobjektträger zügig aus. Dabei werden die Blutzellen nicht durch Quetschen deformiert. Der Objektträger soll zu etwa ¾ mit dem Ausstrich bedeckt sein, an den Rändern bleibt ein schmaler Saum ausgenommen. Im Ausstrich sollen die Zellen in einer monozellulären Schicht homogen verteilt nebeneinander liegen und sich nicht berühren. Den Ausstrich an der Luft gut trocknen lassen. 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59215
Differenzialblutbild TEAS Hinweis Da Kugelschreiber und Filzstift von den Fixier- und Färbelösungen entfernt werden muss die Beschriftung/Kennzeichnung der Ausstriche auf anderem Weg erfolgen, da es ansonsten im Routinebetrieb leicht zu Verwechslungen kommt. Anstatt der Standard-Objektträger bieten sich hier solche mit Mattrand an (nicht im Paket enthalten). Färbung des Blutausstrichs Herstellung der Giemsa-Gebrauchslösung: - 1 Puffertablette ph 7,2 in 1l frisch destilliertem Wasser lösen, eventuell rühren. Die Lösung ist in einer Glasflasche gut verschlossen mindestens 4 Wochen haltbar. - 10 ml Giemsa-Stammlösung + 190 ml Pufferlösung ph 7,2 mischen, 10 min stehen lassen, bei Bedarf filtrieren. Präparate auf die Färbebank in die Glaswanne legen und in folgender Reihenfolge die entsprechende Zeit überschichten. Die Lösungen nach Ablauf der Überschichtung jeweils abgießen. Methanol 10 min May-Grünwald-Lösung 5 min Giemsa-Gebrauchslösung Spülen mit Pufferlösung ph 7 8 min 1 min Spülen mit Aqua dest 1 min Nach Beendigung der Färbung die Objektträger von der Rückseite reinigen und die Präparate lufttrocknen lassen. Hinweis Bei der Anfertigung des gefärbten Blutausstrichs kann es zu folgenden Fehlern kommen: - Bei zu langsamer oder ungenügender Lufttrocknung kommt es zu stechapfelförmigen Zellen - Übersättigte Lösungen und schlecht abgespülte Farbniederschläge führen zu Präzipitatbildung - Bei sauren Dämpfen oder saurem destilliertem Wasser ist der Ausstrich zu rot (Puffer benutzen) - Bei Alkalispuren, zu langer Färbung oder zu dicken Ausstrichen ist der Ausstrich zu blau Mikroskopische Untersuchung Ausstrich auf den Kreuztisch des Mikroskops legen. Zunächst Objektiv 10:1 einschwenken. Mit dieser Vergrößerung gelingt es meist sehr leicht, die Ebene des Ausstrichs mit der Makroschraube einzustellen und die Beschaffenheit des Präparats zu beurteilen. Abb. 6: Mikroskop: 1. Okulare 2. Objektive 3. Fokussiertrieb Makroschraube 4. Fokussiertrieb Feintrieb 5. Objektführer (bewegt den Objekttisch in 2 Ebenen www.phywe.com P59215 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3
TEAS Differenzialblutbild Ist die Präparatebene gefunden, auf den dünnen Teil des Ausstrichs (Auslauf) einen kleinen Tropfen Immersionsöl bringen, das Objektiv 1:1 in den Strahlengang schwenken, in den Öltropfen tauchen und zur Scharfeinstellung noch vorsichtig am Feintrieb drehen. Achtung: Trockenobjektive 40:1 und 10:1 nicht mit Öl verunreinigen! Name. Geb. Datum Abb. 7: Präparat mäanderförmig durchmustern Beim Ausstreichen des Blutes auf den Objektträger verteilen sich die Leukozyten nicht gleichmäßig; am Rand des Ausstrichs finden sich vermehrt größere weiße Blutkörperchen (Granulozyten, Monozyten), in der Mitte gehäuft kleinere Zellen (Lymphozyten). Es ist daher notwendig, das Präparat mäanderförmig zu durchmustern (siehe Abb. 7). Das Ölimmersionsobjektiv nach Beendigung der Differenzierung sorgfältig reinigen, ebenso alle Flächen, die mit dem Öl in Berührung gekommen sind. Grundlagen Während Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten meist automatisiert gezählt werden, ist in der hämatologischen Diagnostik die mikroskopische Beurteilung eines gefärbten Blutausstrichs meist zusätzlich unumgänglich, um weitere wichtige Informationen zu gewinnen. Es gibt zwar auch automatische Differenzierungsmethoden, die entsprechenden Blutausstriche müssen aber stets manuell gefärbt werden und überdies mikroskopisch nachdifferenziert werden. Die Differenzierung der Leukozyten gehört zum großen Blutbild. Die verschiedenen Arten von Leukozyten unterscheiden sich in Größe, Kern-Plasma-Relation, Kernform/-struktur, Zytoplasmafarbe und granulierung. Nach der Pappenheim-Färbung lassen sich die Leukozyten auf Grund ihrer Morphologie und Anfärbbarkeit in ihre Subpopulationen einteilen: neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten und alle Vorstufen. Hämatologische Blutausstriche werden routinemäßig mit der Panoptischen Färbung nach Pappenheim (kombinierte May-Grünwald-Giemsa-Färbung) gefärbt. Die Ausstriche werden mit Farblösungen behandelt, die saure Farbstoffe (Eosin) und basische Farbstoffe (Azur II, Methylenblau) enthalten. Saure Bestandteile der Zelle, wie die DNA des Kerns und die RNA der Nukleoli und des Zytoplasmas, sind basophil und färben sich mit basischen Farbstoffen blau an. Basische Bestandteile der Zelle wie die Proteine und das Hämoglobin sind acidophil und färben sich mit sauren Farbstoffen rot an. Auswertung Aufgabe 1: Differenzieren der Leukozyten Die Differenzierung erfolgt anhand von: - Zellgröße Vergleich von Erythrozyten u. Granulozyten - Kern Form? Nukleolen? Kern-Plasma-Relation? - Cytoplasma Farbe blau, blau-grau, rosa? Farbintensität? - Granula Neutro-, eosino-, baso- und azurophil? - Einschlüssen JOLLY-, HEINZ-Körper in Erythrozyten / AUER-Stäbchen in Leukozyten? 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59215
Differenzialblutbild TEAS Die physiologisch im peripheren Blut vorkommenden Leukozyten werden in Monozyten, Lymphozyten und Granulozyten eingeteilt, wobei letztere noch weiter in neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten eingeteilt werden. Hilfreich bei der Differenzierung sind Hämatologieatlanten, hier sind nur kurz die wichtigsten Charakteristika aufgezählt. Lymphozyten sind mit einem Zelldurchmesser bis 12 µm die kleinsten Zellen des weißen Blutbildes. Sie besitzen einen runden, selten eingebuchteten, dunklen, dichten, tiefblauen Kern mit einem schmalen hellblauen, oft kaum erkennbaren Zytoplasmasaum ( nacktkernig ). Plasmazellen kommen im peripheren Blut normalerweise nicht oder nur vereinzelt vor. Sie sind 14 20 µm groß, ihr Zytoplasma ist tiefblau und zeigt eine perinukleäre Aufhellung. Der Kern ist rund und in der Regel exzentrisch gelegen. Die Chromatin-Struktur des Kerns ist grob ( Radspeichen ). Monozyten sind die größten Zellen des peripheren Blutes (12 20 µm) und außerordentlich vielgestaltig. Das unregelmäßig begrenzte Zytoplasma ist graublau, der Kern gelappt, eingebuchtet oder stabförmig. Stabkernige, neutrophile Granulozyten sind mittelgroß, ihr Zytoplasma ist rosa. Der Kern ist stabförmig und rotviolett. Sie unterscheiden sich von den segmentkernigen, neutrophilen Granulozyten dadurch, dass die Brücke zwischen zwei Segmenten schmaler ist als zwei Drittel der Dicke der benachbarten Segmente. Segmentkernige neutrophile Granulozyten sehen den stabkernigen sehr ähnlich (siehe dort). Die in der Regel 3-5 Kernsegmente zeigen ein grobes verklumptes Chromatin-Gerüst und sind durch schmale kurze Brücken oder Chromatinfäden verbunden. Eosinophile Granulozyten sind ebenfalls mittelgroß und verfügen über eine oxyphiles, rosa gefärbtes Zytoplasma. Sie besitzen zahlreiche große, grobe, eosinophile (gelb-orange) Granula. Diese lassen den stabförmigen oder segmentierten Kern frei. Basophile Granulozyten sind in der Regel kleiner als eosinophile. Ihr ebenfalls rosa gefärbtes Zytoplasma wird meist durch die groben, basophilen (blau-violetten) Granula weitgehend verdeckt. Auch die Kernform (segmentiert, oft kleeblattförmig) ist deshalb oft nicht erkennbar. Stabkerniger Granulozyt Segmentkerniger neutrophiler Granulozyt Monozyt Lymphozyt Abb. 8: Beispiele für die Zellen, die bei einem gesunden Probanden im peripheren Blut vorkommen können P59215 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5 www.phywe.com
TEAS Differenzialblutbild Eosinophile segmentkernige Granulozyten Neutrophiler segmentkerniger Granulozyt Basophiler segmentkerniger Granulozyt Außerdem enthält die untenstehende Tabelle noch unreife Vorstufen der Granulopoese, die nur in pathologischen Blutausstrichen vorkommen, zu Ihnen zählen die Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten (Jugendliche) und Blasten (Myeloblasten). Neben der Differenzierung der Leukozyten müssen in jedem Ausstrich auch das rote Blutbild sowie die Thrombozyten beurteilt werden. Treten kernhaltige Erythrozytenvorstufen auf, ist deren Zahl pro 1 weiße Blutkörperchen anzugeben. Auffälligkeiten in der Erythrozytenmorphologie sind ein Hinweis auf zugrundeliegende Störungen der Erythropoese. Sie beweisen aber in den seltensten Fällen bestimmte Erkrankungen. Liegen Auffälligkeiten in der Erythrozytenmorphologie vor, ist deshalb stets eine weitere Diagnostik angeraten. Hier sollen nur kurz auf die wichtigsten Auffälligkeiten in der Erythozytenmorphologie aufgezählt werden, normale rote Blutkörperchen (Normocyten) sind etwa 6.9-8.5 µm groß und haben einen normalen Hämoglobingehalt. - Bei Eisenmangelanämien kommen kleinere weniger oder gar nicht von Hämoglobin gefärbte Mikrooder Anulozyten vor. - Vergrößerte Erythrozyten (>9 µm) weisen mit teilweise verminderter mittlerer korpusculärer Hämoglobinkonzentration (MCHC) auf Alkoholabusus oder Leberschaden hin. - Target-Zellen sind normal große aber abnorm dünne Erythrozyten; zwischen hämoglobinreichem Rand und Zentrum liegt ein hellerer Bereich. Sie kommen z. B. bei Thalassämien, hypochromen 6 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59215
Differenzialblutbild TEAS Anämien und nach Milzexstirpationen vor. Vereinzelt auch bei Gesunden. - Bei ausgeprägten Anämien beobachtetet man eine andere Größenverteilung der roten Blutkörperchen (Anicozytose) und zum Teil auch birnen oder keulenförmige Erythrozyten (Poikilocytose). - Polychromasie, also mit basischen Farbstoffen gefärbtes Plasma, weist auf eine Bleivergiftung oder beschleunigte Ausschwemmung von Eythrozyten aus dem Knochenmark hin. Manchmal sind auch nur kleine Körnchen im Plasma basophil gefärbt (basophile Tüpfelung). - Bei schweren Anämien oder bei Störungen der Blut-Knochenmarkschranke können Erythrozytenvorstufen detektiert werden. Bezeichnung Art der Veränderung Vorkommen Anisozytose eine andere Größenverteilung der roten Blutkörperchen praktisch jede Anämie Poikilozytose Birnen- oder keulenförmige Erythrozyten ausgeprägte Anämien Mikrozyten kleine Erythrozyten, weniger oder gar nicht Eisenmangelanämien von Hämoglobin gefärbt Anulozyten Ringformen, abnorm dünne Zellen schwere Eisenmangelanämien Target-Zellen Schießscheibenformen, Hb-reiches Zentrum u.a. Thalassämien, schwerer Eisenmangel, Verschlussikterus Sichelzellen Sichelbildung, vor allem bei O 2 -Mangel Sichelzellanämien Sphärozyten Kugelformen, Fehlen der Zentralen Aufhellung Kugelzellanämien Polychromasie mit basischen Farbstoffen gefärbtes Plasma weist auf eine Bleivergiftung oder beschleunigte Ausschwemmung von Eythrozyten aus dem Knochenmark hin Ein Differenzierschema (siehe Abb. 9 und Lab-Report) erleichtert nicht nur die Auszählung von 1 Leukozyten, sondern es gibt auch einen Überblick über die Verteilung der Zellen im Ausstrich. Ist sie nicht annähernd gleichmäßig, so sind weitere 1 Leukozyten (möglichst in einem zweiten Präparat) auszuwerten. In jede senkrechte Spalte werden 10 Zellen notiert. Wenn 1 Leukozyten differenziert sind, werden die Zellen gleicher Zellart addiert. Aus dem Differenzierschema ist ohne Kenntnis der absoluten Zellzahl (Leukozytenzahl) nur die relative Verteilung der Zellen in % zu entnehmen. Ist jedoch die absolute Leukozytenzahl bekannt, kann auch die absolute Zellzahl der Subgruppen pro µl berechnet werden. Abb. 9: Differenzierschema P59215 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 7 www.phywe.com
TEAS Differenzialblutbild Referenzwerte: % Neutrophile 40-75 Eosinophile 1-6 Basophile 0-1 Monozyten 2-8 Lymphozyten 20-45 Achtung: Die angegebenen Normalwerte beziehen sich auf die westeuropäische Bevölkerung! Hinweis Da die Zellen für eine korrekte Beurteilung der Erythozytenmorphologie locker nebeneinander liegen müssen, ist eine mikroskopische Differenzierung nur im dünnen Teil des Ausstrichs (Fahne oder Auslauf) möglich. Die bei Sichelzellanämien auftretenden typischen sichelförmigen Blutkörperchen lassen sich im Differentialblutbild nicht von normalen Blutkörperchen unterscheiden. Erst wenn der Sauerstoffgehalt der Probe absinkt, verformen sich diese Zellen. Zum Thema Malaria-Diagnose aus dem Differenzialblutbild siehe Anleitung P59218. Fragen - Welche Färbung ist für das Differenzialblutbild gebräuchlich? Pappenheim-Färbung - Bei welcher Vergrößerung wird das Differenzialblutbild mikroskopiert? 1er Ölimmersion - Wozu dient bei der Färbung nach Pappenheim die May-Grünwald-Lösung? Sie dient der Fixierung und Vorfärbung. Die eigentlich Färbung erfolgt durch die Giemsa-Lösung. - Wie beeinflusst der Winkel zwischen Objektträger und Ausstrichobjektträger den Ausstrich? Die Größe des Winkels zwischen Objektträger und Ausstrichobjektträger bestimmt die Dicke des Ausstriches. Je kleiner der Winkel desto dünner der Ausstrich. 8 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59215
Differenzialblutbild TEAS Protokoll Tragen Sie das Ergebnis Ihrer Differenzierung in das folgende Schema ein: Zellart 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 Σ % Norm Blasten Promyelozyten Myelozyten Jugendliche Stabkernige neutrophile Segmentkernige Eosinophile Basophile Monozyten Lymphozyten lymphatische Reizformen Bemerkungen/ Besonderheiten weißes Blutbild Beurteilung rotes Blutbild (evtl. vorkommende tox. Granulationen, Gumprechtsche Kernschatten usw.) (Erythrozytenmorphologie, Erythroblasten usw.) bis 5 50-70 bis 4 bis 1 bis 8 25-40 In jede senkrechte Spalte werden 10 Zellen notiert. Wenn 1 Leukozyten differenziert sind, werden die Zellen gleicher Zellart addiert. Aus dem Differenzierschema ist ohne Kenntnis der absoluten Zellzahl (Leukozytenzahl) nur die relative Verteilung der Zellen in % zu entnehmen. Fragen - Welche Färbung ist für das Differenzialblutbild gebräuchlich? - Bei welcher Vergrößerung wird das Differenzialblutbild mikroskopiert? P59215 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 9 www.phywe.com
TEAS Differenzialblutbild - Wozu dient bei der Färbung nach Pappenheim die May-Grünwald-Lösung? - Wie beeinflusst der Winkel zwischen Objektträger und Ausstrichobjektträger den Ausstrich? 10 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59215