Physikalisches Institut der Universität Bayreuth Lehrstuhl für Experimentalphysik I PPD Biophysik FLUORESCENCE RECOVERY AFTER PHOTOBLEACHING (FRAP) 1. Einleitung und Aufgabenstellung 2. Theorie 3. Versuchsanordnung 4. Versuchsdurchführung 5. Versuchsauswertung 6. Erforderliche Kenntnisse 7. Fragen zur Vorbereitung 8. Literatur (Stand: Februar 2015)
1. Einleitung und Aufgabenstellung Gegenstand dieses Praktikumsversuchs sind die theoretischen Grundlagen, das Messprinzip, der Messaufbau und einige Anwendungen quantitativer Bleichexperimente (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP) in lebenden Zellen. Es soll dabei vermittelt werden, wie man die Diffusion von Proteinen in lebenden Zellen die Kinetik einer reversiblen Bindung von Proteinen an zelluläre Membranen mittels Lichtmikroskopie quantifizieren kann. Untersucht werden dabei neben biomimetische Proben auch Kulturzellen, die ein fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren. Die Proben sind klassifiziert nach BSL1 (d.h. kein Risiko für die menschliche Gesundheit und die Umwelt). Eine Einweisung zum Umgang mit gentechnisch modifizierten Organismen nach GenTSV erfolgt vor dem Versuch. 2. Theorie A. Zellulärer Kontext Eukaryontische Zellen, z.b. menschliche Zellen, sind umgeben von einer Lipiddoppelschicht, der Plasmamembran (PM). Das Innere der Zelle ist ebenfalls durch Membranen in sog. Organellen unterteilt. Eine der bekanntesten Organellen ist der Nukleus, in dem die genetische Information der Zelle (die DNA) bereitgehalten wird. Eine für den Versuch wichtige Organelle ist der Golgi-Apparat (GA). Der Raum zwischen den Organellen ist mit einem wässrigen Fluid gefüllt, das stark mit Proteinen und größeren Aggregaten versetzt ist das Zytoplasma. Proteine können thermisch getrieben durch das Zytoplasma diffundieren und, sofern das Protein hydrophobe Gruppen hat, transient an intrazelluläre Membranen binden, so dass ein Zyklus von Diffusion, Adsorption und Desorption entsteht. Auf den Membranen der Organellen kann das adsorbierte Protein ebenfalls diffundieren. Im Zusammenhang mit diesem Praktikumsversuch ist speziell die Membranhülle des GA von Interesse. In Vorbereitung auf diesen Versuch wird dringend geraten sich einige
Seiten zum internen Aufbau lebender Zellen in der einschlägigen Literatur anzusehen, z.b. in Ref. [1]. Alle im Versuch genutzten Zellen exprimieren sog. FP-Fusionsproteine, d.h. Proteinkonstrukte, die mit einem fluoreszierenden Protein (FP) markiert sind. Ein FP alleine, z.b. das grüne FP (GFP), ist ein lösliches Protein, das sich nur im Zytoplasma und im Inneren des Nukleus ( Nukleoplasma ) aufhält, wohingegen beispielsweise GFP-Arf-1 mit seiner Lipidgruppe zeitweise am GA andockt. Neben GFP werden oft auch cyan-farbene und gelbe Konstrukte (CFP bzw. YFP) genutzt. Absorptions- und Emissionsspektren von CFP, GFP und YFP sind hier abgebildet: Für weitere Details zur Spektroskopie von Farbstoffen sei hier auf die Literatur [2] verwiesen. Ziel des Versuchs ist die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten von GFP-Arf-1 sowie sein Assoziations- und Dissoziationsrate am Golgi-Apparat. Zusätzlich sollen die Proben im Labor teilweise vorbereitet werden und im ersten Schritt die relative Änderung des Diffusionskoeffizienten im Wasser-Glycerin-Gemischen quantifiziert werden. B. Prinzip von klassischen FRAP-Experimenten In klassischen FRAP-Experimenten nutzt man aus, dass Fluorophore wie z.b. GFP bei schwacher Anregung mit blauem Licht (λ=488nm) Stokes-verschobenes, grünes Fluoreszenzlicht (λ=505-550nm) abgeben, bei sehr starker Anregung mit der gleichen Wellenlänge aber irreversibel gebleicht werden. Nach dem Bleichen hat
GFP seine Konformation leicht geändert und kann nicht mehr mit der zuvor verwendeten Wellenlänge angeregt werden. Sind die gebleichten Moleküle immobil, kann sich die Fluoreszenz im gebleichten Bereich (region of interest, ROI) nicht mehr erholen. Beobachtet man hingegen eine Erholung der Fluoreszenz, kann man zunächst qualitativ einen Austausch gebleichter Moleküle mit ungebleichten folgern und im zweiten Schritt aus dem Zeitverlauf der Fluoreszenzerholung Rückschlüsse auf Art und Kinetik des Austauschprozesses gewinnen. Ein typisches FRAP- Experiment besteht also aus folgender Sequenz: prebleach Bildgebung mit schwacher Laserintensität über kurze Zeit bleach Schnelles Bleichen einer ROI mit starker Laserintensität post-bleach Bildgebung mit schwacher Laserintensität über längere Zeit, Aufnahme der zeitlichen Veränderung der Fluoreszenz F(t) innerhalb der ROI Für den Erholungsprozess der Fluoreszenz in der ROI können zwei limitierende Mechanismen als Erklärung herangezogen werden, die im allgemeinen Fall gleichzeitig, aber in unterschiedlichem Maße zur Erholung beitragen. I) Erholung durch Bindung an eine immobile Struktur im ROI Hier wird jeglicher räumlicher Transport als unendlich schnell im Vergleich zur Bindungskinetik angenommen; die immobile Struktur fülle die ROI komplett aus. Der Austausch zweier Proteinpools (im Zytoplasma bzw. gebunden an die Struktur) lässt sich dann formal schreiben als A Z! k A G!! A Z, was man mit Hilfe des Massenwirkungsgesetzes als gewöhnliche Differentialgleichung für die Konzentrationen der beiden Protein-Pools formulieren kann. Unter der Annahme, dass das Zytoplasma und die immobile Struktur die Volumina V Z bzw. V G haben und die Summe aller Teilchen im System erhalten bleibt, können Sie daraus eine einzige gewöhnliche
Differentialgleichung für die Anzahl der gebundenen Proteine N G ableiten. Für das Fluoreszenzsignal gilt näherungsweise F G ~ N G, so dass Sie als allgemeine Lösung folgende FRAP-Kurve erhalten: F G (t) = a 0! a 1 exp(!t /! ). Zur Vorbereitung auf das Praktikum müssen Sie sich die Differentialgleichung für F G (t) ableiten und die Konstanten a 0, a 1 und τ in der Lösung bestimmen. Ohne diese Vorarbeit kann das Experiment nicht begonnen werden! II) Erholung durch Diffusion Die Annahme einer Erholung des Signals durch Diffusion vernachlässigt jegliche Bindungsreaktionen und nutzt neben der Geometrie der gebleichten ROI lediglich die Bewegungsgleichung für Aufenthaltswahrscheinlichkeit eines thermisch bewegten Teilchens (Diffusionsgleichung): "p( r!,t) = D#p( r!,t) "t Der Propagator der Diffusionsgleichung ist bekanntlich eine Gauss-Funktion, die zu einem mittleren! Verschiebungsquadrat (mean square displacement, MSD) r 2 (t) ~ Dt eines diffundierenden Teilchens führt. In Vorbereitung auf das Experiment müssen Sie sich die Grundlagen der Diffusion, den Proportionalitätsfaktor des MSD sowie die Veränderung des Diffusionskoeffizienten mit der Umgebung und der Teilchengröße aus der Literatur erarbeiten (z.b. aus [3]). Im FRAP-Experiment werden wir uns auf kreisförmige ROI unterschiedlicher Radien R beschränken, für die eine längliche Rechnung [4] ergibt: F(t) = A + Be!z { I 0 (z)+ I 1 (z)} z = R2 2Dt Dabei bezeichnet I k die modifizierte Besselfunktion k-ter Ordnung. Durch Fitten der experimentellen Daten mit obigem Ausdruck für F(t) erhalten Sie den Diffusionskoeffizienten bei gegebenem ROI-Radius.
3. Versuchsanordnung Der Versuchsaufbau besteht im Wesentlichen aus einem kommerziellen motorisierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica SP5). Die entsprechenden optischen Grundlagen der konfokalen Mikroskopie sollten Ihnen bereits aus vorherigen Semestern bekannt sein und finden sich auch in jedem Standardwerk zur Optik. 4. Versuchsvorbereitung Herleitung der FRAP-Kurve für Erholung durch Bindung, Planung des Experiments Wie oben bereits erwähnt müssen Sie vor Beginn der Experimente die Differentialgleichung zur Fluoreszenzerholung und die Bestimmung der Integrationskonstanten schriftlich parat haben. Wie können Sie experimentell die unbekannten Assoziationsund Dissoziationsraten aus Messgrößen bestimmen, d.h. welche Messgrößen müssen Sie aufnehmen? Machen Sie sich auch mit den Grundlagen zur Diffusion vertraut. Herstellung von Glyzerin-Wasser-Gemischen Stellen Sie Wasser-Glyzerin-Gemische mit Gewichtsverhältnissen [1 : 0], [3 : 1], [2 : 1], [1 : 1] her. Pipettieren Sie die benötigte Menge von Wasser und Glyzerin in ein Reagenzgefäss. Benutzen Sie dabei die Waage, um das Gewicht genau zu bestimmen. Glyzerin ist sehr viskos und muss daher sehr langsam pipettiert werden! Mischen Sie die Flüssigkeit gründlich mit einem Vortexer und vermeiden Sie die Bildung von Luftbläschen. Geben Sie nach kurzer Ruhezeit fluoreszenzmarkiertes Dextran dazu und mischen sie noch einmal vorsichtig. Die genetisch veränderten Zellen werden für Sie vorbereitet. 5. Versuchsdurchführung und -auswertung Für alle zu bestimmenden Größen wird eine Statistik von 5 Einzelmesswerten erwartet sowie eine Berechnung der statistischen Fehler (ggf. nach Fortpflanzungsgesetz) und eine Diskussion systematischer Fehler.
FRAP und Diffusion in vitro Probe: FITC-markiertes Dextran in Wasser-Glyzerin-Gemischen Bestimmung der Diffusionskoeffizienten des fluoreszenten Dextranmoleküls und der Viskosität des Gemisches. Dazu bestimmen Sie zunächst aus der Messung in Wasser (η=0.001pas) den hydrodynamischen Radius des Dextranmoleküls und extrahieren daraus die Viskositäten der Gemische. Tragen Sie diese als Funktion des Glyzerin-Anteils (%) graphisch incl. Fehlerbalken auf. FRAP und Diffusion in vivo Probe: HeLa-Zellen transfiziert mit GFP-Arf1 (sind vorbereitet) Bestimmen Sie die FRAP-Erholungszeiten von GFP-Arf1 im Zytoplasma (nicht auf dem GA!) für drei ROIs mit unterschiedlichen Radien (wieder jeweils 5 Messungen für die Fehlerabschätzung). Welchen Zusammenhang zwischen den Zeiten und den genutzten Radien der ROI erwarten Sie und was messen Sie wirklich (graphische Auftragung)? Schätzen Sie ab, wie viskos das Zytoplasma ist (Annahme: FITC-Dextran und GFP- Arf1 sind gleich groß). Wie gut ist diese Annahme (vgl. Kristallstruktur von GFP)? Vergleichen Sie die Variation der Messwerte für D in der Zelle mit den Variationen in Glyzerin-Wasser-Gemischen; erklären Sie qualitativ den Unterschied. FRAP und Bindungskinetik in vivo Probe: HeLa-Zellen mit Arf-1-GFP (sind vorbereitet) Bestimmung von Assoziations- und Dissoziationsrate k, γ für GFP-Arf-1 am Golgi- Apparat. Dazu sollten Sie die Fit-Gleichung inkl. der Parameter vorab abgeleitet und darauf aufbauend einen experimentellen Plan erarbeitet und mit dem Betreuer besprochen haben (was muss wie gemessen werden). 6. Versuchsauswertung Die aufgenommenen Erholungskurven der FRAP-Experimente werden unter Anleitung direkt am Lehrstuhl EP I ausgewertet.
7. Erforderliche Kenntnisse Grundlagen Optik, Atom- und Molekülphysik sowie Statistische Physik Grundlagen Zellbiologie Funktionsweise (konfokale) Fluoreszenzmikroskope 8. Fragen zur Vorbereitung a) Wie sieht die Adsorption/Integration von Proteinen an/in Membranen auf der nm- Skala aus? Welche Energie benötigt man zum Loslösen der Proteine? b) Wie lautet die Differentialgleichung und die allgemeine Lösung für die FRAP- Kurve im Limes einer Erholung durch Bindung (s. oben)? c) Warum ist die Diffusion entlang der optischen Achse nicht diskutiert? Warum ist sie für die Aufgabenstellung irrelevant? Was bedeutet das für die Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops? d) Wie wird der Farbstoff angeregt, warum bleicht er? Warum ist das Fluoreszenzlicht Stokes-verschoben? e) Was ist Diffusion und wie wird sie mathematisch beschrieben? f) Welchen Diffusionskoeffizienten würde man für ein 1nm großes Protein in Wasser bzw. auf einer Membran erwarten? Wie lässt sich der Diffusionskoeffizient aus Eigenschaften des umgebenden Fluids und der Molekülgeometrie bestimmen? g) Wie ändert sich der Diffusionskoeffizient, wenn sich die gebleichte Region verändert (Form, Größe)? h) Wie gut ist die Annahme, dass die Bindungskinetik nicht von Transportvorgängen abhängt? i) Welche Artefakte können durch das Bleichen auftreten? Hat die Methode systematische Fehler? 9. Literatur [1] Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Press [2] Lackowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Springer-Verlag [3] Berg, Random walks in biology, Princeton University Press [4] Soumpasis, Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments, Biophys. J. 41, 95 (1983).