Klonierung von S2P Rolle der M19-Zellen POL-Seminar der Biochemie II 13.02.2007 Sebastian Gabriel
Inhalt 1. Was ist eine humane genomische DNA-Bank? 2. Unterschied zwischen cdna-bank und genomischer DNA-Bank? 3. Warum wurden M19-Zellen mit der Genbank transfiziert?
Inhalt 1. Was ist eine humane genomische DNA-Bank? 1.1. Eigenschaften von Genbanken 1.2. Wie werden Genbanken hergestellt? 2. Unterschied zwischen cdna-bank und genomischer DNA-Bank? 3. Warum wurden M19-Zellen mit der Genbank transfiziert?
1. Was ist eine humane genomische DNA-Bank? - komplettes Genom verfügbar - vergleichbar einer Bibliothek - gesamte menschliche DNA in Abschnitte zerlegt gespeichert - Wie speichert man DNA??
1.1. Eigenschaften von Genbanken (1) - Wie speichert man DNA? In Träger-Organismen! - geeignete Organismen: E. Coli, Saccharomyces cerevisiae (Backhefe) - Träger-Organismen replizieren gespeicherte DNA selbstständig - DNA liegt in Fragmenten vor - sehr viele unterschiedliche Kolonien benötigt, um gesamtes Genom zu speichern - einzelne Kolonien von Träger-Organismen sind gekennzeichnet, welche DNA sie speichern - Anzahl der benötigten Kolonien hängt ab von: + Größe des zu speichernden Genoms + Speicherkapazität des Träger-Organismus
1.1. Eigenschaften von Genbanken (2) - Speicherkapazität?? - Träger-Organismen bekommen die Fremd-DNA zusätzlich zur eigenen DNA implantiert - Speicherkapazität abhängig von verwendeter Technologie: Plasmide, Cosmide, YACs, re-transkribierte RNA?
1.2. Wie werden Genbanken hergestellt? (1) - Beispiel: Speicherung in Bakterien, z.b. E. Coli - DNA-Sequenz muss bekannt sein (Kettenabbruchmethode etc.) - PCR-Amplifikation eines gewünschten Bereiches - Zerlegung mit Restriktionsendonukleasen -> viele Fragmente - Vektoren mit denselben RENasen schneiden -> passende sticky ends - geöffnete Vektoren + Fragmente mischen -> einige nehmen die fremde DNA mit auf - Transformation (Aufnahme der DNA in Bakterien) - Nachweis der Aufnahme durch Selektion: Kopplung mit geeignetem, bekannten Gen des Vektors (i.d.r. Antibiotikaresistenz)
1.2. Wie werden Genbanken hergestellt? (2)
1.2. Wie werden Genbanken hergestellt? (3) + Amp-Resistenz + Fremd-DNA + Ampicillin
1.2. Wie werden Genbanken hergestellt? (4) - dieses Prozedere muss für alle DNA-Abschnitte durchgeführt werden - Ergebnis: viele verschiedene Bakterien-Kulturen mit Vektoren, die sich nur im aufgenommen Gen unterscheiden
Inhalt 1. Was ist eine humane genomische DNA-Bank? 2. Unterschied zwischen cdna-bank und genomischer DNA-Bank? 3. Warum wurden M19-Zellen mit der Genbank transfiziert?
2. Unterschied zwischen genomischer und cdna (1) - genomische DNA beschreibt DNA, wie sie in den Chromosomen des Spenderorganismus vorliegt - enthält Exons, Introns, regulatorische Domänen, Promotor, alle Arten von Satelliten, nicht-kodierende Sequenzen, VNTRs... - genomische DNA ist für einen Organismus spezifisch - cdna ist ein künstliches Produkt - reife mrna wird mittels einer reversen Transkriptase in DNA re-transkribiert - kodiert für eine Aminosäuresequenz, ohne Introns etc. - gewebs- oder zell-spezifisch
2. Unterschied zwischen genomischer und cdna (2) - genomische DNA-Bank: Population klonierter DNA-Fragmente, deren Gesamtheit das komplette Genom eines Organismus repräsentiert - cdna-bank: repräsentiert alle in einem Zelltyp/Gewebe vorkommenden mrnas
Inhalt 1. Was ist eine humane genomische DNA-Bank? 2. Unterschied zwischen cdna-bank und genomischer DNA-Bank? 3. Warum wurden M19-Zellen transfiziert?
3. Warum wurden M19-Zellen transfiziert? - M19-Zellen können kein Cholesterin synthetisieren! - M19-Zellen haben keine Site-2-Protease! - Durch Trial-and-Error-Einbringen von Genen aus der Genbibliothek lässt sich (irgendwann) das S2P-Gen isolieren - Woher weiß man, ob die M19-Zelle das richtige Gen aufgenommen hat??
3. Warum wurden M19-Zellen transfiziert? - M19-Zellen wachsen nicht auf Cholesterin-freiem Medium - diese Zellen werden mit Genen transfiziert und diejenigen selektioniert, die dank des neuen Gens auf Cholesterin-freiem Medium überleben
http://home.arcor.de/unknownguest/ sebastian.gabriel@campus.lmu.de